调节SIRT1表达改善老年大鼠勃起功能

组

共68只雄性SD大鼠分为4组(n个=17/组）：对照组、Res组、NAM组和Res+Tad组。Res组大鼠灌胃给予Res，剂量为5 mg kg⁻¹每日（#34092，Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国）。Res的剂量是根据我们之前的研究调整的，并且证明是有效的。8NAM组大鼠每日灌胃500 mg kg⁻¹NAM（#72340，西格玛）。NAM的剂量是根据先前发表的研究得出的，这些研究报告了300–1000 mg kg⁻¹才能有效。9,10我们选择每天服用500 mg kg⁻¹NAM在我们的研究中。Res+Tad组的动物每天接受胃内Res（5 mg kg⁻¹)和Tad（5 mg kg⁻¹; #11302020，美国印第安纳波利斯礼来）。11对照大鼠灌胃给予相同剂量的生理盐水。连续治疗8周后，评估大鼠的勃起功能。随后，处死大鼠，分离阴茎组织。将阴茎中部（离龟头4 mm）分离并嵌入最佳切割温度的复合物中（OCT；4583，SAKURA，Torrance，CA，USA），用于冰冻切片制备。剩余组织立即储存在−80°C下，以备进一步实验。

勃起功能评估

如前所述，通过海绵内压（ICP）/海绵神经刺激诱导的平均全身动脉压（MAP）的比值来评估大鼠的勃起功能。12简单地说，通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg kg）将大鼠麻醉⁻¹; SML1873，Sigma）和地西泮（50 mg kg⁻¹; D0899安定，西格玛）。暴露盆腔星状神经节和阴茎组织，然后穿刺颈内动脉和海绵体。用脉冲宽度为5ms、频率为20Hz、电压为5V的连续方波连续刺激神经60次。刺激两侧海绵体神经3次。记录ICP和MAP，并计算ICP/MAP比值。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的2'-脱氧尿苷5'-三磷酸（dUTP）镍标记（TUNEL）分析

阴茎组织切片（5μm厚）固定在4%多聚甲醛/0.01 mmol l中⁻¹室温下磷酸盐缓冲盐水（PBS；p5368-10PAK，Sigma）30分钟至60分钟，并用3%H封闭₂O（运行）₂洗涤后，将切片与20μl含有末端脱氧核苷酸转移酶（TdT；1μl）和DIG-d-UTP（1μl）的标记缓冲液在37°C下孵育2小时。然后，用二氨基联苯胺（DAB；SNM475，Biolab，中国北京）对样品进行染色，然后用苏木精进行复染。凋亡细胞核呈棕色，显微镜下观察阳性染色。

免疫组织化学染色

组织切片（5μm）在室温下清洗并固定在4%的多聚甲醛中10分钟。切片用3%的山羊血清封闭，然后用针对von Willebrand因子（vWF；1:400；ab6994，Abcam，New York，NY，US）和α-SMA（1:200；#19245，Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA）的一级抗体孵育以及常规条件下生物素标记的二级抗体。随后，用苏木精对载玻片进行复染。使用配备相机的BX51显微镜（日本东京奥林巴斯）（日本东京尼康）拍摄图像。使用Image-Pro软件（Media Cybernetics，美国纽约州纽约市）分析平滑肌面积在图片总面积中的比例。

蛋白质印迹

使用带有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（中国南通Beyotime）从50–100 mg阴茎海绵体组织中提取蛋白质。通过离心分离蛋白质上清液（14 400克; 在日本日立市日立市HITACHI）4°C下放置15分钟，并通过双钦酸（BCA）分析（Beyotime）测定蛋白质浓度。根据BCA分析的定量结果，将每个样品的总蛋白质含量调整为60μg。用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）系统分离蛋白质条带并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。对于蛋白质标记，抗SIRT1（ab110304，Abcam）、p53（ab26，Abcan）和叉头盒O3（FOXO3a；ab154786，Abcam）的一级抗体以1:1000稀释，而抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；ab82445，Abca姆）以1:3000稀释。抗兔IgG（H+L）和鼠IgG的抗体（MedImmune，Gaithersburg，MD，USA）用作二级抗体。使用化学发光系统观察蛋白质带，并使用Quantity One软件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行分析。

一氧化氮（NO）和环磷酸鸟苷（cGMP）含量的测量

NO/cGMP途径是调节阴茎勃起的主要途径。NO激活鸟苷酸环化酶，将鸟苷-5’-三磷酸（GTP）转化为cGMP。cGMP降低细胞内钙浓度，放松海绵体平滑肌，增加阴茎血流量，并诱导勃起。NO和cGMP水平反映了勃起功能；因此，评估了阴茎组织中NO和cGMP的含量。将阴茎海绵体组织（50 mg）均质并在1000℃下离心克按照制造商的说明，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（中国武汉Servicebio）收集上清液进行NO和cGMP分析。

超氧化物歧化酶（SOD）活性和3,4-亚甲基二氧苯丙胺（MDA）含量的测定

SOD活性降低和MDA含量增加对衰老和老年病至关重要。SOD活性和MDA含量用于评估氧化应激。13海绵体组织（80 mg）在PBS中均质。上清液通过1000℃离心收集克氧化应激标记物SOD和MDA的活性由商业检测试剂盒（中国南京建成公司）测定。使用微孔板阅读器（分子器件，VERSAmax；Thermo Scientific，New York，NY，USA）进行定量测量。

SIRT1对大鼠海绵体组织学变化的影响

为了确定SIRT1过度表达或抑制介导的海绵体组织学变化，我们通过α-SMA和vWF免疫组织化学染色定量分析平滑肌和内皮含量。与生理盐水处理的大鼠相比，Res处理8周后，大鼠海绵体平滑肌和内皮细胞显著升高(P（P）< 0.05). 值得注意的是，通过与Tad的联合治疗，这种增加得到了加强。相反，NAM治疗组的平滑肌和内皮含量显著下降（两者均为P（P）< 0.05;图2a和​2亿2亿). 此外，Res给药减轻了海绵体细胞凋亡，并且通过Res和Tad的联合作用增强了这种作用(P（P）< 0.05). 与对照组相比，NAM组凋亡细胞增多(P（P）< 0.05;图2c). 这些结果表明，SIRT1的激活改善了勃起功能障碍，并诱导了海绵体的组织学改变。

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图2

SIRT1介导的大鼠海绵体的组织学变化。免疫组织化学染色评估(一)阴茎血管平滑肌（α-SMA阳性）和(b条)内皮细胞（vWF阳性），以及(c（c）)TUNEL染色评价凋亡细胞。Res组阴茎血管平滑肌和内皮细胞含量显著增加，而凋亡细胞减少。NAM治疗的结果与此相反。红色箭头表示阳性染色。^*P（P）< 0.05,^**P（P）<0.01，以及^***P（P）< 0.001. 对照组，对照组大鼠灌胃生理盐水；NAM：烟酰胺组，NAM组大鼠灌胃给予烟酰胺；Res：白藜芦醇组，Res组大鼠灌胃给药；Res+Tad：白藜芦醇和他达拉非组，Res+Tad组大鼠每天灌胃白藜芦醇和他达拉非。NS：无显著差异；SIRT1：沉默信息调节器2-相关酶1；TUNEL：TdT介导的dUTP镍标记；vWF：von Willebrand因子。

SIRT1、p53和FOXO3a在老年大鼠阴茎组织中的表达

Western blot分析用于评估SIRT1、p53和FOXO3a在海绵状组织中的表达水平。结果显示，与用生理盐水处理的对照大鼠相比，用Res处理8周的大鼠SIRT1蛋白显著积累（两者P（P）< 0.05). 然而，与对照组相比，Res组的p53和FOXO3a水平显著下调（所有P（P）< 0.05). 相反，在接受NAM治疗的大鼠中，SIRT1的表达显著降低，同时p53和FOXO3a的表达增加(P（P）< 0.05). 与Tad共治疗后，Res诱导的SIRT1表达增加强烈，而Tad治疗显著削弱了Res组p53和FOXO3a的表达（所有P（P）< 0.05;图3).

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图3

阴茎组织中SIRT1、p53和FOXO3a的表达。的表达式(一)SIRT1、(b条)p53，和(c（c）)western blot分析检测阴茎组织中的FOXO3a。Res治疗组SIRT1表达显著升高，而FOXO3a和p53表达下降。Tad的添加增强了表达趋势。相反，NAM处理导致相反的表达谱。^*P（P）< 0.05,^**P（P）<0.01，以及^***P（P）< 0.001. 对照组，对照组大鼠灌胃生理盐水；NAM：烟酰胺组，NAM组大鼠灌胃给予烟酰胺；Res：白藜芦醇组，Res组大鼠灌胃给药；Res+Tad：白藜芦醇和他达拉非组，Res+Tad组大鼠每日灌胃白藜芦》和他达拉菲。NS：无显著差异；SIRT1：沉默信息调节器2-相关酶1；FOXO3a：叉头箱O3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

SIRT1对NO和cGMP生成的影响

NO和cGMP水平与勃起功能密切相关，勃起功能由ELISA测定。如所示图4，与对照组相比，NAM治疗组大鼠的NO和cGMP水平显著降低，而Res治疗组明显升高（所有P（P）< 0.05). 与Res组相比，Res+Tad组的NO和cGMP水平进一步升高（两者均P（P）< 0.05). 总之，这些结果表明SIRT1激活可维持老年大鼠的勃起功能。

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图4

用ELISA法测定海绵体组织中NO和cGMP的生成。(一)否和(b条)通过ELISA检测cGMP水平。与对照组相比，NAM治疗组大鼠的NO和cGMP水平显著降低，而Res治疗组大鼠则显著升高。^*P（P）< 0.05,^**P（P）<0.01，以及^***P（P）< 0.001. 对照组，对照组大鼠灌胃生理盐水；NAM：烟酰胺组，NAM组大鼠灌胃给予烟酰胺；Res：白藜芦醇组，Res组大鼠灌胃给药；Res+Tad：白藜芦醇和他达拉非组，Res+Tad组大鼠每日灌胃白藜芦》和他达拉菲。NO：一氧化氮；ELISA：酶联免疫吸附试验；cGMP：环状鸟苷一磷酸。

本研究得到了国家自然科学基金（No.81170563）的资助。