介绍
受损DNA的修复始于蛋白质因子对损伤的识别,如核酶PARP1和PARP2对单链和双链DNA断裂(SSB和DSB)的快速检测。1,2,三与受损DNA结合后,PARP1和PARP2(PARP1/2)利用NAD+将聚ADP-核糖(PAR)链添加到自身、组蛋白和DNA修复途径的其他蛋白质组分上。4,5,6这些PAR链有助于染色质的分解和下游因子的补充,以协调DNA损伤反应(DDR)。7,8PARP1催化85%–95%的细胞总PAR化,以响应DNA断裂。9PARP2与DDR中的PARP1部分冗余,由于PARP1中残留的PAR活性而被确定−/−细胞。9,10,11,12PARP1首先到达DNA断裂处,其次是PARP2,其招募部分由PARP1依赖性PAR化介导。三,13,14除了在DNA修复中的作用外,高度丰富的PARP1还调节染色质结构和转录。15,16,17未经PARP1修饰的PARP1以高亲和力结合染色质,并将其压缩成高阶结构以阻止转录体外试验。15,17,18此外,基因组研究已确定PARP1位于活性转录基因的启动子。19,20
PARP1/2的酶活性被一类被称为PARP抑制剂(PARPi)的药理学试剂抑制,PARPi抑制剂是NAD+结合PARP催化位点以阻止细胞PAR化从而导致SSB积聚的类似物。21,22当在循环细胞中未修复时,这些SSB通过包括BRCA1/2蛋白的途径转化为DSB,在正常细胞中进行同源重组修复(HRR)。此外,PARPi治疗导致PARP捕获(见下文)、分叉停滞和逆转,23无门控冈崎碎片形成,24和复制后ssDNA缺口。25在缺乏功能性HRR机制的肿瘤细胞中(即BRCA−/−)由于广泛的基因组不稳定,PARPi治疗导致复制应激和细胞死亡。26,27PARPi和HRR蛋白之间的这种合成致死机制导致PARP1/2被识别为癌症药物的关键靶点。28现已批准四种PARPi(塔拉唑帕利、奥拉帕利、尼拉帕利和鲁巴派布)用于治疗HRR缺乏的乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。29这些和其他PARPi也正在研究与放疗、铂盐和其他细胞毒性化疗药物(如替莫唑胺)的联合使用。30
在存在DNA损伤剂的情况下用PARPi处理细胞会导致一种称为“PARP陷阱”的现象,即PARP1与染色质的明显紧密结合。PARP捕捉最初被描述为染色质免疫沉淀和qPCR检测到的DNA与PARP1的10倍增加的关联。31多个实验室使用从PARPi处理过的细胞中分离的染色质进一步证明了PARP1与DNA之间增加(>10倍)的关联,并观察到PARP1的捕获效率因PARPi的使用而异。32,33,34,35最近,在使用KU0058948(一种olaparib类似物)和甲基磺酸甲酯(MMS)治疗后,使用定量Western印迹技术显示PARP捕获涉及所有PARP1的~50%。36PARP2也观察到PARP捕获(高达80%)。37,38这些研究清楚地表明,PARPi介导物理失速PARP1/2在受损DNA上的表达。
重要的是,当PARP与烷基化剂联合使用时,PARPi的细胞毒性与PARP捕获有关。32,34,37,39虽然通常报告各种PARPi在催化抑制(IC)方面仅略有不同50在一位数纳米摩尔范围内),它们的真实抑制值和细胞毒性潜能彼此相差很大,并且与捕获PARP1的能力相关性更好。40,41塔拉佐帕利是最有效的PARP捕捉剂,具有最高的细胞毒性潜力。22,33,34,35重要的是,PARP捕获需要PARP1,但不需要PARP2,因为只有PARP1−/−由于PARP捕获的损失,细胞对某些临床PARPi的敏感性降低。11,32,42
在阐明PARP捕获的分子机制方面,人们有很多兴趣.体外结合分析表明,PARPi不会严重干扰DNA中PARP1的释放速率。34,43,44虽然PARP1在DNA断裂时的稳定可能通过PARPi、PARP1和DNA底物之间的不同变构相互作用来调节,但这些与捕获效率或体内疗效。34,45最近的一项研究发现,PARP1在DNA损伤处发生快速转换,而PARPi并没有破坏这一过程,这一发现对PARP1物理性包埋在细胞DNA损伤处的概念提出了挑战。42
更好地了解活细胞内内源性PARP1/2的动力学行为将有助于深入了解PARP捕获在控制PARPi疗效中的作用,尤其是考虑到PARP1/2所具有的许多其他作用。尽管已经使用光漂白后荧光恢复(FRAP)、荧光相关光谱和荧光缺失研究了PARP1的染色质结合状态和动态,2,46这些集成方法掩盖了多状态动态行为。此外,过度表达可能会改变蛋白质的动力学行为。47,48在这里,我们开始了解内源性PARP1/2如何在未受损的核环境中导航,移动到DNA损伤处,然后在PARPi的存在下停滞。为了实现这一目标,我们使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑来荧光标记内源性PARP1/2分子,以便使用集成和单分子活细胞显微镜进行直接可视化。我们发现PARP1/2在未受损和受损细胞中均存在三种不同的动态状态(快速扩散、缓慢扩散和染色质结合)。我们进一步将染色质结合群体划分为瞬时和稳定结合的PARP分子。在激光诱导DNA损伤后,只有暂时结合的PARP1/2分子得到稳定,而大多数分子继续自由扩散。用一种有效的PARP捕捉剂塔拉佐帕利治疗,增加了DNA损伤处稳定结合的PARP1分子的数量和保留时间,但这种作用并没有延伸到较弱的PARP捕获剂奥拉帕利。因此,我们的研究结果为下一代PARPi的开发提供了关键见解。
结果
活细胞单分子显微镜显示未受损细胞中稳定结合的PARP1和PARP2的比例
为了研究活体人骨肉瘤U2OS细胞内源性PARP1和PARP2分子的动力学,我们使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑,将编码3X-Flag-HaloTag的序列引入内源性PARP和PARP1的所有等位基因的N末端第1部分或第2部分基因。这使得含有N-末端3X Flag HaloTag的融合蛋白得以表达(图S1A) ●●●●。使用位于两个同源臂两侧的引物进行PCR并通过Sanger测序证实了准确的基因组靶向性(图S1A和S1B)。免疫印迹显示Flag-Halo-PARP1和Flag-Helo-PARP2的稳健表达(图S1C) 这些标记蛋白在与细胞可渗透的HaloTag配体Janelia Fluor 646(JF646)孵育后进行共价修饰和荧光标记(Ai和S1D) ●●●●。49,50我们还证明,我们的改良细胞系产生PAR,以应对过氧化氢诱导的DNA损伤,这些细胞系中的PARP1/2活性可以被PARPi阻断(图S1E) ●●●●。
活细胞单分子显微镜显示未受损细胞中稳定结合的PARP1和PARP2的比例
(A) (i)描述JF646染料与HaloTag共价结合的示意图。(ii)描述单个PARP1分子轨迹的典型97 Hz SPT电影的裁剪帧样本。640 nm激发激光连续用于成像,而相机曝光时间为10.3 ms。
(B和C)单个代表核中Halo-PARP1(B)或Halo-PARP2(C)在30 s内的单粒子轨迹(长度>2)。
(D) 分数绑定(F类跳跃)根据Spot-On的三态模型拟合97 Hz SPT数据推断出未受损细胞中的Halo-PARP1和Halo-PARP2。条形图显示平均值F类跳跃±SEM从≥5个独立重复(以点表示)的≥52个细胞中获得≥42000个轨迹(>3次检测),每个重复均单独拟合。使用非配对t检验确定两组之间的统计差异。
(E) Halo-PARP1和Halo-PARP2位移的累积分布函数(CDF)(代表Δτ=30 ms)。单个曲线描述了来自≥5个独立重复的≥52个细胞的≥42000个轨迹(>3次检测)合并的数据。
(F) 对数图显示了单个Halo-PARP1和Halo-PARP2分子的未修正生存概率(1-CDF),以及它们各自的两相指数模型与未受损细胞中的2 Hz SPT数据拟合(实心曲线)。每条曲线表示从≥3个独立复制的≥13个细胞的≥870个轨迹中合并的数据。H2B-Halo的数据(来自10个独立复制品中≥40个细胞的11737个轨迹)用于光漂白校正,从而得出以下值τ瞬态和τ稳定的(参见表S3).
(G) 显示97 Hz和2 Hz SPT工作流程的方案。使用Spot-On三态模型拟合97 Hz SPT数据,得出快速扩散的分数和扩散系数(F类快速的,D类快速的),缓慢扩散(F类缓慢的,D类缓慢的),并绑定PARP(F类跳跃,D类跳跃)分子。此外,使用两相指数模型拟合2 Hz SPT数据,以得出瞬态分数和持续时间(分数瞬态,τ瞬态)和稳定(分数稳定,τ稳定的)PARP绑定事件。
(H和I)饼图图解总结了Halo-PARP1(以H表示)和Halo-PARP2(以I表示)的总分数的推导,这些分数参与了97至2 Hz SPT实验中的瞬态和稳定结合、缓慢扩散和快速扩散。结合分数、慢扩散分数和快扩散分数(in i)使用Spot-On的三态模型拟合97 Hz SPT数据来确定。用2 Hz SPT分析Halo-PARP1和Halo-PARP2细胞中的结合分数(in ii),并拟合为两相指数模型。获得的H2B Halo数据用于光漂白校正,以及校正因子(见STAR方法)用于获得瞬时稳定结合Halo-PARP分子的真实分数(in iii)。将这些数据汇总在一起,以获得内源性Halo-PARP1和Halo-PARP2分子的总分数(iv)。
(J) 在Halo-PARP1(蓝色圆圈)和Halo-PARP2(红色圆圈)上进行的FRAP实验的归一化和光漂白校正回收曲线。H2B-Halo(绿色圆圈)用于光漂白校正。将两相指数模型(实线)拟合到FRAP数据中。误差条表示来自≥3个独立重复的11至18个细胞的SD。
我们首先通过进行整体活性细胞激光微辐照来验证我们的基因组编辑细胞系三,51并使用DNA损伤后荧光积累定量(Q-FADD)方法分析我们的数据。14,52,53为了可视化荧光标记的蛋白质,我们使用了高纳米摩尔浓度的HaloTag配体JF646。我们发现,在激光诱导的DNA损伤中,内源性Halo-PARP1的累积速度明显快于内源性Halo-PARP2,这是通过更高的有效扩散系数来测量的(D类效率) (图S1F、,表S1). 这一结果与我们之前发表的关于过度表达GFP-PARP1和GFP-PARP 2的细胞的研究一致,14证明Halo和GFP标记蛋白的类似招募动力学(图S1F和S1G)。
我们使用我们的基因组编辑Halo-PARP1/2细胞系来监测未受损状态下单个内源性PARP1和PARP2分子的核内动力学。我们用低纳米摩尔浓度的JF646标记基因组编辑细胞,并可视化Halo-PARP1/2的单个分子,如其他Halo-tagged蛋白所述。47,48,50,54,55使用高帧速率(97 Hz SPT)的单粒子跟踪和高度倾斜和层压光学片(HILO)照明,56随着时间的推移,我们可以追踪核内单个PARP1/2分子(Aii、1B和1C,视频S1和S2系列). 虽然一些颗粒相对不动,因此可能是染色质结合的,但其他颗粒显示出快速扩散。
视频S1。使用97 Hz SPT检测到PARP1快速移动的代表性电影,与图1相关:
视频S2。使用97 Hz SPT检测到PARP1缓慢移动的代表性影片,与图1相关:
为了了解PARP1/2与染色质结合的比例与自由扩散的比例,我们绘制了Halo-PARP1/2的位移分布图,并用“Spot-On”分析了数据。57由于由束缚分数和自由分数组成的两态模型拟合不良,特别是在较长的时间延迟Δ下τ(图S1H和S1I),我们改为使用由束缚分数、慢扩散分数和快扩散分数组成的三态动力学模型,从而得到更好的拟合。这表明,在未受损的细胞中,内源性PARP1/2分子至少存在三种不同的状态:染色质结合状态、缓慢扩散状态和快速扩散状态。后者可能负责扫描基因组中潜在的DNA损伤。虽然PARP1和PARP2之间的扩散系数(快扩散和慢扩散分数)非常相似,但在染色质结合状态下PARP1的分数(0.29)明显高于PARP2的分数(0.19)(F类跳跃) (D和1E以及表S2). PARP总体的其余部分分布在慢扩散分数之间(F类缓慢的,PARP1=0.4;PARP2=0.44)或快速扩散分数(F类快速的,PARP1=0.31,PARP2=0.37)(表S2).
快速光漂白限制了我们研究稳定的染色质结合事件的能力,这些事件发生的时间尺度比97赫兹电影的30秒长。因此,我们采用了一种不同的成像方案(2 Hz SPT)来专门研究Halo-PARP1/2的染色质结合部分,使用较低的激光功率和帧速率(2 Hz)以及5分钟内500 ms的较长曝光时间。47,58,59在这种成像模式下,快速扩散的粒子变得模糊,而结合分子可以清晰地观察到,60从而可以跟踪稳定和瞬态PARP绑定事件(视频S3和S4系列)如其他核蛋白所示。47,58,59我们通过绘制Halo-PARP1/2分子的存活概率,使用2Hz SPT研究了Halo-PARP1/2分子从染色质中的解离。H2B-Halo是一种组蛋白,已知其能与染色质稳定结合数小时,其存活曲线被用作光漂白的对照。47,59我们用两阶段指数衰减模型拟合存活曲线,该模型解释了暂时或稳定结合的PARP分子的结合事件(F和S1一) ●●●●。我们发现,0.58(0.29束缚外)PARP1和0.51(0.19束缚外(表S3).
视频S3。演示使用2 Hz SPT检测到的瞬时结合PARP1的代表性影片,与图1相关:
视频S4。使用2 Hz SPT检测到的稳定结合PARP1的代表性影片,与图1相关:
接下来,我们整合了97到2 Hz SPT的观察结果,并计算了PARP1/2分子自由扩散(缓慢或快速)或参与瞬态和稳定结合事件的分数。所得饼图显示,在结合分子中,PARP1和PARP2的类似部分参与了瞬态和稳定的结合事件(G–1I和表S3). 我们的分析进一步揭示了与这些结合事件相关的时间常数(τ瞬态和τ稳定的)在未损坏的细胞中,PARP1和PARP2类似(F和S1J和表S3).
接下来,我们使用FRAP作为正交方法验证了2Hz SPT实验的结果。用两态反应主导模型拟合Halo-PARP1/2的FRAP曲线,47,61我们发现FRAP恢复时间(PARP1τb条:72.3秒;第2部分τb条:58 s)与稳定相互作用的结合时间(τ稳定的,PARP1:47.6 s和PARP2:54.7 s),根据2 Hz SPT推断(J、,表S3和S4系列). 因为PARP1与染色质结合的比例明显大于PARP2(从97 Hz SPT,表S2)因此,PARP1的瞬时和稳定结合分数也大于PARP2的瞬时和稳态结合分数(从2 Hz SPT,H和1I)。
大多数PARP1和PARP2分子在激光诱导的DNA损伤处自由扩散
为了研究激光诱导的DNA损伤如何影响核内PARP1/2的动力学,我们将激光微照射方法与97和2 Hz SPT相结合。我们首先在激光诱导DNA损伤(405 nm)后立即使用97 Hz SPT在矩形感兴趣区域(ROI,损伤区域,蓝色)和ROI上方(红色)和下方(绿色)相似大小的控制区域跟踪PARP1/2分子(A) ●●●●。通过使用Spot-On三态模型分析PARP1数据,我们发现与原子核的未受影响区域相比,激光损伤部位束缚、慢扩散和快扩散PARP1分子的分数和扩散系数没有显著变化(B和表S5). 这与之前的研究结果一致(H、,表S2和第5章).42相反,PARP2的结合分数显著增加(F类跳跃:与核内其他区域相比,损伤区域为0.2至0.32)(C、,表S5). 值得注意的是,大多数PARP1(0.64)和PARP2(0.68)分子仍然没有稳定结合,但在损伤区域以慢扩散和快扩散状态存在(表S5,F类缓慢的+F类快速的)这表明,尽管DNA损伤导致富集,但染色质结合蛋白和自由扩散蛋白之间仍存在快速交换。
大多数PARP1和PARP2分子在激光诱导的DNA损伤处自由扩散
(A) 描绘细胞核和预定感兴趣区域ROI(蓝色)内的单个分子的卡通,经过激光微照射,以及ROI上方(红色)和下方(绿色)的类似尺寸的控件。
(B和C)分数界限(F类跳跃)ROI中的Halo-PARP1(B)和Halo-PARP2(C),激光损伤细胞中控制区域的上方和下方。F类跳跃根据Spot-On的三态模型拟合97 Hz SPT数据推断。条形图显示平均值F类跳跃来自5个独立重复(用点、正方形或三角形表示)的≥64个细胞的≥64000个轨迹(>3次检测)的±SEM,每个重复分别进行拟合。各组之间的统计差异通过普通单因素方差分析和Bonferroni的多重比较测试确定。
(D和E)对数图显示单个Halo-PARP1(以D表示)和Halo-PARP2(以E表示)分子的未修正生存概率(1-CDF)及其各自的两相指数模型与未受损和激光损伤细胞中的2 Hz SPT数据相吻合(实心曲线)。每条曲线表示从≥3个独立重复的13到30个细胞的≥870个轨迹合并的数据。H2B-Halo的数据(来自10个独立重复的≥40个细胞的11737个轨迹)用于光漂白校正,从而得出以下值τ瞬态和τ稳定的(参见表S3).
(F和G)总结τ的饼图插图瞬态以及未受损细胞(in i)和激光损伤细胞(in ii)中Halo-PARP1(in F)和Halo-PARP2(in G)的总分数。每个饼图表示从97到2 Hz SPT实验汇编的数据。H iv和1I iv分别在2F和2G中重复使用,以供参考。
为了更好地了解在DNA损伤区域结合的PARP1和PARP2部分的性质,我们进行了2 Hz SPT,并在激光脉冲后立即分析了PARP1/2分子的轨迹。我们发现,与未受损细胞中的PARP1分子(τ瞬态,PARP1:3–5.9秒),但位移速度仍然比稳定结合类分子快约4倍(D和S2系列A和表S6). 此外,我们发现损伤部位瞬时结合的PARP1分子增加(D和S2系列A和表S6). 对于PARP2,在损伤部位(τ瞬态,2.7–6.9 s),但属于这一类别的分子比例没有增加(E和S2系列B和表S6). 结合97至2 Hz SPT的结果,我们可以确定PARP1和PARP2在DNA损伤处的分布如何变化(F和2G)。总之,这些结果详细说明了PARP1和PARP2在激光诱导的DNA损伤中的动力学,并表明,虽然大多数PARP1与PARP2分子即使在强烈DNA损伤的区域也能自由扩散,但即使在没有PARPi的情况下,参与短暂相互作用的小部分分子在DNA损伤的地区也能稳定下来。
一种高效的PARP捕获剂,塔拉佐帕林,只增加了一小部分稳定结合的PARP1分子在损伤部位的保留时间
为了了解PARPi如何影响激光诱导损伤部位的PARP1交换,我们首先进行了激光微照射和Q-FADD分析,以研究用他拉唑帕林(一种临床上已知的最有效的PARP捕获剂)处理的基因组编辑Halo-PARP1 U2OS细胞中PARP1的集合积累。33,34,35,39我们观察到D类效率PARP1的,但不在F类米表明内源性PARP1(当被视为一个整体时)积累较慢,并在用他拉唑帕林治疗后停滞在断裂的DNA末端(表S7). 我们跟踪了在塔拉唑帕林存在下损伤病灶中PARP1整体释放的动力学。在用单指数模型拟合PARP1衰减对应的曲线部分后,我们量化了保留时间(τ第页)局部损伤区域的PARP1(A) ●●●●。塔拉佐帕利导致内源性PARP1在染色质区域的保留时间显著增加,且DNA损伤程度较高(B、,表S7)与最近在转染细胞系中的发现一致。37,42,45,62
一种高效的PARP捕获剂,塔拉佐帕林,只增加了一小部分稳定结合PARP1分子在损伤部位的保留时间
(A) 图中显示了用0.5μM塔拉唑啉(橙色方块)或二甲基亚砜(蓝色圆圈)处理的单个代表性细胞中Halo-PARP1在激光诱导的DNA损伤中的整体累积和释放。从最大振幅的强度(蓝色虚线)开始,将单指数模型拟合到与Halo-PARP1从DNA损伤中释放相对应的动力学曲线部分(红色曲线)。拟合残差显示为橙色或蓝色点。
(B) Halo-PARP1保留时间(τ第页)从单指数模型导出的结果与DNA损伤释放Halo-PARP1的动力学曲线部分相吻合。代表PARP1保留时间平均值±SEM的点图(τ第页)从≥20个细胞中进行2至4次独立复制实验/条件,以增加他唑帕尼浓度(0.1、0.2、0.35和0.5μM)。对每个细胞分别进行模型拟合。使用普通单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验评估各组之间的统计差异,以比较各组与DMSO对照组(τ第页=150.38±12.17,n=28,>3个独立重复)。
(C) 分数绑定(F类跳跃)根据Spot-On的三态模型推导出的Halo-PARP1,该模型适用于DMSO或0.5μM他唑帕林处理的细胞中97 Hz的SPT数据,无论是否存在MMS或激光诱导的DNA断裂。条形图显示平均值F类跳跃±SEM来自≥30000个轨迹(>3次检测),来自≥45个细胞,来自≥3个独立重复,每个重复均单独拟合。各组之间的统计差异通过普通单因素方差分析和Bonferroni的多重比较测试确定。
(D和E)对数图显示了单个Halo-PARP1分子的未修正生存概率(1-CDF)及其各自的两相指数模型,适用于DMSO或他唑帕林处理细胞在存在或不存在激光损伤(D)或MMS损伤(E)的情况下的2 Hz SPT数据。每条曲线表示从≥3个独立复制的≥13个细胞的≥880个轨迹中合并的数据。H2B-Halo的数据(来自10个独立重复的≥40个细胞的11737个轨迹)用于光漂白校正,从而得出以下值τ瞬态和τ稳定的(参见表S12).
(F和G)饼图插图总结了τ稳定的在激光损伤(F)或MMS损伤(G)存在的情况下,DMSO(i)或0.5μM塔拉唑啉(ii)处理细胞中Halo-PARP1的总分数。每个饼图表示从97到2 Hz SPT实验汇编的数据。
为了进一步研究PARP1在DNA损伤处停滞的分子动力学,我们在塔拉佐帕尼处理的细胞中使用激光微照射和97 Hz SPT。通过这种方法,我们发现塔拉佐帕林既没有增加结合分数(F类跳跃)也没有显著降低扩散系数(D类快速的或D类缓慢的)PARP1在辐射诱导的DNA损伤中的表达(C、,表S10). 当使用烷基化剂甲基甲磺酸(MMS)诱导DNA损伤时,也获得了类似的结果(C、,表S10). 总之,这些数据表明,大多数缓慢或快速扩散的内源性PARP1分子仍在扩散,即使存在DNA损伤和有效的PARP捕获剂,结合PARP1的分子部分也没有改变。
接下来,我们对Halo-PARP1细胞进行了2 Hz SPT,以确定PARP处理细胞DNA断裂时内源性PARP1结合部分的特征。我们发现,他拉唑帕林增加了分数(0.43–0.70)和持续时间(τ稳定的,52.8–81.8 s),PARP1分子参与稳定的结合事件,同时降低激光诱导DNA断裂时瞬时结合PARP1的分数(0.57–0.30)(D和第3章A、,表S12). MMS用于DNA损伤诱导导致稳定(0.55–0.79)和瞬时(0.45–0.21)结合组分发生类似变化,且增加幅度更大τ稳定的(71.3–163.4秒)(E和第3章B和表S12). 总之,这些数据表明,在DNA损伤的情况下,塔拉佐帕林通过捕获一些仅因损伤而增加的瞬时结合PARP1,增加了参与DNA损伤稳定相互作用的小部分PARP1分子的分数和保留时间(F和2G)。这些结果解释了我们在塔拉唑帕林存在下的集合测量中观察到的损伤部位PARP1释放较慢的原因(A和3B,表S7).
然后,我们综合了2和97 Hz SPT实验的结果,并推导了PARP处理细胞中参与激光或MMS诱导损伤部位瞬态或稳定结合事件的PARP分子的总分数(F和3G以及表S14). 这些结果表明,有效的PARP捕捉器(如他拉唑帕林)仅“捕捉”一小部分PARP1分子,在DNA损伤处将一些瞬时结合物转化为稳定的结合物。
较弱的PARP捕捉剂奥拉帕利和veliparib对稳定结合PARP1分子的保留时间有明显影响
接下来,我们描述了在另外两种已知PARPi存在的情况下DNA损伤处PARP1交换的特征:olaparib(一种中度但较弱的PARP1诱捕剂,比他唑帕利)和veliparib(较差的PARPi诱捕剂),如之前的研究所分类。33,34我们首先确定了系综累积性质(D类效率和F类米)和集合保持时间τ第页对于激光诱导DNA损伤后的Halo-PARP1,使用奥拉帕利和veliparib进行治疗。在较高浓度的奥拉帕林下,我们观察到τ第页,但未发现浓度相关的变化D类效率和F类米(A、,表S8). 相比之下,增加veliparib浓度的处理不会导致τ第页,D类效率,或F类米(B、,表S9). 这些结果表明,olaparib和veliparib均不影响PARP1的整体积累,在较高浓度下,olaporib(而非veliparip)可诱导PARP1在DNA损伤处停滞(A和4B,表S8和第9部分).
较弱的PARP捕捉剂奥拉帕利和veliparib对稳定结合PARP1分子的保留时间有明显影响
(A和B)Halo-PARP1保留时间(τ第页)从单指数模型导出的结果与DNA损伤释放Halo-PARP1的动力学曲线部分相吻合。代表PARP1保留时间平均值±SEM的点图(τ第页)来自≥14个来自≥2个独立重复实验/条件的细胞,用于增加奥拉帕林浓度(0.1、0.6、1和4μM)(A)和veliparib浓度(1、4、6、12和20μM)。对每个细胞分别进行模型拟合。使用普通单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验评估各组之间的统计差异,以将各组与DMSO对照组进行比较(τ第页=150.38±12.17,n=28,>3个独立重复)。
(C) 分数绑定(F类跳跃)根据Spot-On的三态模型拟合DMSO、olaparib(4μM)和veliparib(40μM)处理的细胞中97 Hz SPT数据推断出的Halo-PARP1,无论是否存在MMS或激光诱导的DNA断裂。条形图显示平均值F类跳跃±SEM来自≥26000个轨迹(>3次检测),来自≥45个细胞,来自≥3个独立重复,每个重复均单独拟合。各组之间的统计差异通过普通单因素方差分析和Bonferroni的多重比较测试确定。
(D和E)对数图显示了单个Halo-PARP1分子的未修正生存概率(1-CDF)及其各自的两相指数模型,适用于DMSO、olaparib(4μM)或veliparib(5μM)处理细胞在存在或不存在激光损伤(D)或MMS损伤(E)的情况下的2 Hz SPT数据。每条曲线表示来自≥3个独立复制的≥12个细胞的≥874条轨迹的合并数据。H2B-Halo的数据(来自10个独立重复的≥40个细胞的11737个轨迹)用于光漂白校正,从而得出以下值τ瞬态和τ稳定的(参见表S12).
(F和G)饼图插图总结了τ稳定的在激光损伤(F)或MMS损伤(G)存在的情况下,DMSO(i)、olaparib(4μM)(ii)或veliparib(4μM)(iii)处理细胞中Halo-PARP1的总分数。每个饼图表示从97到2 Hz SPT实验汇编的数据。
在使用97 Hz SPT研究激光或MMS诱导DNA断裂时,奥拉帕里尼和veliparib对单分子PARP1动力学的影响后,我们发现,与塔拉佐帕里尼一样,较弱的PARP捕捉器奥拉帕里克和veliparib没有改变F类跳跃,D类缓慢的,或D类快速的PARP1分子(C、,表S10). 这些数据表明,这两种药物都不影响DNA损伤处大多数内源性PARP1分子的特性。此外,使用2 Hz SPT对结合分数的分析表明,奥拉帕林既不影响激光或MMS诱导DNA损伤时的结合时间,也不影响短暂或稳定相互作用的PARP1分子的分数(D、 4E、,S4系列A、 以及S4B,表S12). 令人惊讶的是,在激光诱导的DNA损伤中,我们发现veliparib在增加长寿命结合分子(0.43–0.66)方面的作用与他拉唑帕利相似,但牺牲了更多的短命(0.57–0.34)PARP1结合事件。此外,在使用塔拉唑帕林治疗的过程中,绒毛膜肋的激光损伤增加τ稳定的PARP1分子(52.8 s–116.1 s),在MMS诱导的DNA损伤中未观察到这种效应(D、 4E中,S4系列A、 和S4B,表S12). 然后,我们通过合并我们在97至2 Hz SPT下对奥拉帕利和veliparib的结果,确定了瞬时和稳定结合PARP1分子的总分数(F和4G,表S14). 总的来说,这些结果揭示了veliparib的一个意想不到的特性,即在激光损伤后立即延长稳定结合的PARP1分子的驻留时间,但在烷基化剂MMS引起的碱损伤后却没有。这与olaparib形成对比,olaparip对PARP1的任何属性都没有显著影响,以应对任何类型的损伤。
即使在没有DNA损伤的情况下,稳定结合的PARP2分子的捕获也由他拉唑帕林介导
接下来,我们应用这些相同的方法来描述PARP2诱捕PARP2处理细胞DNA损伤部位的分子基础。我们首先使用97 Hz SPT,在有他拉唑帕林、奥拉帕林或veliparib存在的情况下,研究激光照射或MMS诱导的DNA损伤的PARP2动力学。如PARP1所示,这些抑制剂均未影响PARP2的参数,包括F类跳跃,D类缓慢的、和D类快速的DNA损伤处(A、,表S11). 使用2 Hz SPT研究PARP2的结合分数表明,在未受损和MMS处理的细胞中,塔拉唑帕利(而不是奥拉帕利或维利帕利)增加了PARP2分子参与稳定染色质相互作用的分数和持续时间,但在激光损伤的细胞中没有增加(B、 5摄氏度,第5章A、 以及S5B,表S13). 在整合97至2 Hz SPT的结果后,我们测定了未受损、激光损伤和MMS处理细胞中瞬态和稳定结合的PARP2分子的总分数(D–5F,表S15). 综上所述,我们的结果表明,塔拉唑帕利对稳定结合PARP2分子的包封作用与诱导的DNA损伤无关。
即使在没有DNA损伤的情况下,稳定结合的PARP2分子的捕获也由他拉唑帕林介导
(A) 分数绑定(F类跳跃)根据Spot-On的三态模型拟合DMSO、olaparib(4μM)、veliparib(5μM)或talazoparib(0.5μM)处理细胞中97 Hz SPT数据推断出的Halo-PARP2,无论是否存在MMS或激光诱导的DNA断裂。条形图显示平均值F类跳跃±SEM来自≥7000个轨迹(>3次检测),来自≥12个细胞,来自≥3个独立重复,每个重复均单独拟合。各组之间的统计差异通过普通单因素方差分析和Bonferroni的多重比较测试确定。请注意,我们可以看到F类跳跃二甲基亚砜处理细胞激光损伤后的PARP2,与C、。
(B和C)Log-Log图显示单个Halo-PARP2分子的未修正生存概率(1-CDF)及其各自的两相指数模型,与DMSO、olaparib(4μM)、veliparib(40μM)或talazoparib(0.5μM)处理的细胞在存在或不存在激光损伤(B)或MMS损伤(C)的情况下的2 Hz SPT数据相吻合。每条曲线表示从≥3个独立复制的≥12个细胞的≥625个轨迹中合并的数据。H2B-Halo的数据(来自10个独立重复的≥40个细胞的11737个轨迹)用于光漂白校正,从而得出以下值τ瞬态和τ稳定的(参见表S13).
(D–F)饼图插图总结了τ稳定的二甲基亚砜(in i)、塔拉佐帕林(0.5μM)(in ii)、奥拉帕林(4μM)、或veliparib(4μM)(in iv)处理过的细胞中Halo-PARP2的总分数处于未受损状态(in D),存在激光损伤(in E)或MMS损伤(in F)。每个饼图表示97至2 Hz SPT实验中汇编的数据,但存在激光损伤的veliparib除外[5E(iv)],其中符合2 Hz SPT数据的数据不稳定且无结论。
讨论
跨越50多年的研究有助于我们对PARP1和PARP2的结构和生物功能有更广泛的了解。在这里,我们首次在活哺乳动物细胞中的单分子水平上描述了这些丰富的蛋白质是如何i)在天然的、未受损的核环境中导航,ii)识别DNA损伤,以及iii)在DNA损伤处被PARPi停滞的。
不到三分之一的观察到的PARP1和PARP2群体在未受损的细胞中与染色质结合
PARP1是一种大量表达的蛋白质,每~20个核小体中有一个PARP1分子的化学计量比,是染色质的组成部分。63先前对纯化蛋白的研究表明,未PARP1与缺乏自由端的完整染色质相关。8,15,16,64全基因组方法捕捉到了其基因组相互作用的稳态快照。19,20,65
体外单分子实验表明,PARP1修饰DNA并通过稳定交叉点使其致密。18,66,67这些观察结果共同表明了PARP1在形成染色质结构中的作用。通过直接可视化未受损活细胞内PARP的动态,我们的工作表明,不到三分之一的PARP1蛋白是染色质结合的,而大多数PARP1分子(71%)在核质空间内扩散(D和1E以及表S2)可能通过“monkey-bar”机制。43即使PARP1的结合部分(29%)也包括参与快速染色质探测的分子(瞬时相互作用,29%中的12%与τ瞬态~3s),因此只有一小部分可以被视为“不动”(29%中的17%,τ稳定的~48秒)(H、,表S3).
相比之下,连接蛋白组蛋白H1是染色质的主要结构成分,在细胞中也很丰富(每个核小体一个H1)。68,69,70PARP1和H1相互占据基因启动子和其他基因组位点。19,71虽然核小体核心组蛋白保持稳定相关(例如,H2B,停留时间=小时),但连接组蛋白H1在染色质上快速交换,停留时间仅为~3分钟,与PARP1(~1分钟)相当(表S3).72,73,74PARP2具有非常不同的DNA-结合域,丰度远低于PARP1,与PARP1具有相似的时间特征(我,表S2)这表明其长期存在的相互作用也可能有助于染色质结构。
激光诱导DNA损伤时PARP1和PARP2的瞬时染色质相互作用稳定
集成激光微辐照是产生局部DNA断裂的最广泛的方法之一,用于研究活细胞对DNA损伤的生物反应。53,75我们和其他人对PARP1/2的募集获得了有价值的见解,证明内源性和过度表达的PARP1在激光诱导的DNA损伤中的累积速度明显快于PARP2(图S1E中,表S1).2,三,14,76最近使用集合微辐射结合FRAP的研究表明,PARP1在DNA损伤部位发生快速转换,42挑战PARP捕获的概念。在这里,我们实现了一个工作流程,该流程允许激光微照射与单粒子追踪(SPT)耦合,为详细研究局部DNA损伤处PARP1/2的动力学和结合事件提供空间和时间分辨率(). 我们发现PARP1分子在DNA损伤部位迅速交换,而其结合分数没有变化(F类跳跃)或扩散系数(D类快速的和D类缓慢的) (B和表S5). DNA损伤的诱导导致局部PARP1/2浓度增加(PARPs的集合积累),但不会影响损伤区域大多数蛋白质的行为。激光辐照损伤确实会增加参与瞬态PARP1/2分子部分的停留时间(长达7 s),但不会影响稳定的染色质结合(F和2G,表S6). 瞬时和稳定的染色质结合模式可能对应于完整与受损DNA上PARP1/2的不同构象。先前的研究表明,PARP1的Zn和BRCT结构域参与结合完整的DNA77而Zn和WGR结构域与断裂的DNA末端结合以激活PARP1。78DNA损伤位点的短暂结合足以使PARP1/2发生自身和转PARP酰化(k个猫~5–10秒−1)79从而在DNA断裂释放之前启动下游修复机制。
某些PARP抑制剂通过延长其与染色质的稳定相互作用来捕获PARP1
尽管PARPi在临床上取得了成功,这至少部分归因于PARP捕捉,但PARP捕捉的分子机制尚不清楚。我们在这里首次阐明了在PARPi存在的情况下,PARP1/2的单个颗粒在DNA损伤位点的动力学性质的变化。对于辐射(激光)诱导的损伤和化学(MMS)损伤,97 Hz SPT显示,大多数PARP1分子的交换不受PARPi的影响,无论它们被归类为高效还是低效PARP捕集剂(C和C、,表S10). 最有可能的是,PARP1分子的数量大大超过了我们研究中损伤位点的数量,这可以解释为什么在PARPi过量的情况下,大多数PARP1的分子不会受到DNA损伤的影响。我们的2 Hz SPT数据表明,PARP捕获对不同PARPi的影响是微妙的,并且与它们的细胞毒性无关(B和A、,表S7-S9). 例如,对于强PARP-捕捉剂塔拉唑帕利,激光微辐射或MMS诱导的损伤后,停留时间和稳定结合PARP1的分数(12%–14%)都会增加(F和3G)。我们只观察到参与稳定染色质相互作用的小部分PARP1的稳定性。捕获这种小(或更小的无法检测的)种群可能足以通过诸如复制叉停滞和逆转等机制诱导细胞死亡,23无门控冈崎碎片形成,24或复制后ssDNA缺口。25出乎意料的是,可怜的捕捉器绒毛膜显示出与他拉唑帕利类似的效果,但只是在微辐射后,而非MMS(F和4G)。同样出乎意料的是,介质捕集剂奥拉帕林对PARP1的任何结合或非结合种群的分数或停留时间都没有引起显著变化(F和4G)。细胞效力与我们的诱捕观察之间缺乏相关性进一步证实,PARPi的细胞效力是由其与PARP1/2的亲和力驱动的,而不是由PARP诱捕驱动的。40,41
用PARPi治疗后,我们观察到DNA损伤处PARP1捕获量的细微变化,与细胞裂解后Western blot测量中观察到的PARP1捕捉的显著比例形成对比。32,33,34,35,36,37,39,80在这些Western blot实验中,与对照组相比,在诱导DNA损伤时,与染色质相关的PARP1总量增加了10倍以上,高达总PARP1的50%。在我们的实验中,与染色质紧密结合的PARP1/2的数量与对照组相比变化很小(最多2倍)。我们的结果与FRAP集成实验一致,即尼拉帕立布和他拉唑帕立布不会在活细胞DNA损伤处物理阻止PARP1。42我们的结果表明,即使在PARPi治疗缺乏稳定结合的情况下,PARP1/2仍可能在DNA损伤处滞留。我们推测,在DNA损伤剂存在的情况下,长时间使用PARPi处理的细胞会积累越来越多的损伤,这反过来会导致染色质部分中PARP1的积累增加,尽管完整细胞中的实际动态要微妙得多。在这些先前的报告中,在细胞裂解和样品制备过程中发生的DNA损伤也有可能产生较高水平的PARP捕获。
塔拉佐帕林可稳定结合PARP2分子,与诱导的DNA断裂无关
PARP2被PARPi抑制的程度与PARP1相同,40鉴于这两种蛋白质活性位点的相似性,这是一个预期的结果。虽然PARPi在细胞中的功效主要归因于抑制PARP1,11,32,42在DNA损伤处捕获PARP2可能有助于细胞毒性机制。PARP2在DNA损伤部位的行为与PARP1非常相似,其中大多数PARP2分子即使在PARPi存在的情况下也能快速交换(A和表S11). 此外,对于PARP1,PARP2的结合分数在塔拉唑帕林的存在下变得更稳定。对于MMS诱导的损伤,分数和停留时间都增加,而对于微辐射诱导的损伤则有更复杂和微妙的反应(E和5F)。有趣的是,塔拉佐帕尼的这种保留作用也可以在没有DNA损伤的情况下观察到,这暗示了PARP2在复制应激期间维持DNA完整性的特殊作用(D、,表S13). 这些结果还指出了一种PARP1活性独立的向DNA损伤位点募集的机制,这种机制可能与最近描述的PARP1介导的PARylization募集作用平行或替代。13最后,奥拉帕林或veliparib无法检测到PARP2的捕获(D–5F,表S13).
结论
基于临床经验和强劲的销量,PARPi是治疗越来越多癌症的重要而有效的工具。然而,与其他有不良副作用的癌症治疗一样81容易产生阻力,82下一代PARPi的开发还有很大的改进空间。我们对活细胞的定量单分子研究挑战了经典的捕获机制,该机制是从细胞裂解后染色质结合的PARP1的免疫印迹推断出来的,32,34并独立地通过系综激光微辐照37,42,45,62]. 我们的结果表明,PARP抑制不会导致PARP广泛固定在受损DNA上。最多,PARP抑制减缓了损伤部位PARP分子的一小部分的动力学,这可能足以导致下游复制叉崩溃和基因组不稳定。我们观察到PARP1的捕获分数出奇地小,这表明更有效的PARPi对这种采用DNA-结合构象的PARP1小群体具有特异性。鉴于细胞核中PARP1的浓度比典型的DNA损伤量大许多数量级,开发专门针对这种轻微状态的抑制剂可以减少剂量要求,从而降低非靶向效应。据报道,这方面有望开始45我们期待着这方面的进一步发展。
研究的局限性
首先,由于抗PARP1/2抗体未能检测到Halo标记的PARP1/2,我们无法将表达水平与未标记的对照进行比较。该研究基于对每个PARP1和PARP2使用一个克隆,PARP1的标记细胞系表达的PARP1水平远低于具有内源性基因的细胞。第二,尽管我们在工作中清楚地描述了内源性PARP1/PARP2的时间和空间动力学,但确切的分子机制是,PARP1/2分子在激光DNA损伤中的扩散速度如何缓慢,以及在PARPi存在的情况下,瞬时结合的PARP1/2分子如何在DNA损伤处转化为稳定结合的分子尚待理解。第三,与所有活细胞单分子成像研究一样,尽管我们可以在时间和空间上以毫秒和纳米精度定位单个分子,但DNA序列信息缺失,我们不知道PARP1/2在基因组中的何处结合更稳定,也不知道这些更稳定的结合分子是否会导致DNA损伤。未来的实验可能能够克服这些限制。