iScience。2023年1月20日；26(1): 105755.
健康与疾病活体人眼红细胞淤积的可视化研究
,1,6 ,2,5,6 ,三 ,1 ,三 ,4 ,4 ,三 ,1 ,2 ,1和三，7,∗
乔安妮·李
1美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所
王东一
2美国马里兰州大学费舍尔生物工程系生物成像与机器视觉实验室
杰西卡·波滕堡
三美国马里兰州大学巴尔的摩医学院眼科和视觉科学系
安德鲁·J·鲍尔
1美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所
塞缪尔·阿萨纳德
三美国马里兰州大学巴尔的摩医学院眼科和视觉科学系
莉莉我
三美国马里兰州大学巴尔的摩医学院眼科和视觉科学系
拉里萨·胡林
1美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所
杨涛
2美国马里兰州大学费舍尔生物工程系生物成像与机器视觉实验室
约翰尼·谭
1美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所
奥萨马·J·赛迪
三美国马里兰州大学巴尔的摩医学院眼科和视觉科学系
1美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所
2美国马里兰州大学费舍尔生物工程系生物成像与机器视觉实验室
三美国马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院眼科和视觉科学系
4美国马里兰州大学巴尔的摩医学院
5现住址：美国阿肯色州费耶特维尔阿肯色大学生物与农业工程系
6这些作者贡献均等
7引线触点
2022年4月14日收到；2022年8月25日修订；2022年12月5日验收。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
- 补充资料
文件S1。图S1-S4，表S1和S2
GUID:1451691E-9591-4C15-A342-318584A464F4
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总结
据报道，微循环中的血细胞被困于淤滞状态，但其与健康和疾病的相关性尚未确定。在本研究中，我们引入了体内一种成像方法，揭示了先前未知的停滞期红细胞池的存在，位于中枢神经系统的毛细血管段内，在100%的受试者中都存在。这些结果提供了一个关键的见解，即血细胞在脉络膜微血管中运动时会暂停，脉络膜微动脉是一种血管结构，在体内任何组织中具有最高的血流量。利用深度学习证明临床实用性表明，青光眼患者的红细胞淤滞状态发生了改变，这表明脉络膜微血管可能发生比以前认识到的更广泛的变化。在单细胞水平监测脉络膜微血管的能力可能会为青光眼、年龄相关性黄斑变性和其他神经退行性疾病的微血管健康追踪提供新的策略。
主题领域：健康科学、验光术、眼像差测定
集锦
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血瘀状态下的红细胞是活体人眼的生理强健现象
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短暂的停滞事件是脉络膜微血管的特征
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血瘀分布的变化揭示青光眼脉络膜毛细血管损伤
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自适应光学可以有效地与红细胞介导的血管造影相结合
介绍
脉络膜是一种血管结构，将85%的血液输送到眼睛，在人体任何组织中，每单位重量的血液流量最高。脉络膜微血管被称为脉络膜毛细血管，为视网膜最外层提供血液和营养，被认为是体内代谢最活跃的组织，单位重量消耗的氧气比大脑多。1与视网膜血管系统不同，视网膜血管系统由分支的圆柱形血管网络组成，从一个分支点到下一个分支点都具有相对共线的排列，脉络膜毛细血管由一个由异常短的毛细血管段组成的平面网组成，这些毛细血管段由外脉络膜的正交连接的小动脉和小静脉供血和排泄。2,三,4,5,6脉络膜血管功能障碍与全球四大致盲原因中的三个有关：年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变。7,8,9尽管它与眼部健康和疾病有关，但我们对体内活体眼睛脉络膜毛细血管内的血流特征不完整，因为它相对难以成像，部分原因是它的厚度和色素上皮后面的解剖位置。当前体内成像技术可以提供血管的结构和功能信息，4,10,11但不能揭示活体中单个血细胞如何通过脉络膜毛细血管网络的非典型几何形状。与大多数其他毛细血管不同，相对于红细胞的大小而言，脉络膜毛细血管管腔宽（直径约10μm）（直径约8μm）。这些特征将脉络膜毛细血管与体内许多其他微血管网络区分开来，并为血细胞如何通过不同的毛细血管网络传播提供了一个潜在的变革视角。
青光眼是一种神经退行性疾病，视网膜神经节细胞（RGC）及其轴突受损，导致神经元死亡和视力丧失。眼睛内的所有RGC轴突都穿过视神经，视神经是青光眼轴突损伤的主要部位。虽然眼压升高是青光眼的主要危险因素，但眼部灌注减少和眼部血流自动调节受损也与该病的发病机制有关。12此外，视网膜外循环功能障碍与青光眼有多种联系。最近的研究表明，视神经头周围脉络膜循环出现局部微血管脱落或无灌注，13,14即使显示脉络膜微血管脱落也可能先于青光眼的进展。15,16但是，如果不能在血细胞流经网络时对其进行可视化，则很难全面评估脉络膜微血管的破坏程度。这些观察激发了我们的假设，即红细胞通过脉络膜毛细血管的方式在青光眼中发生改变。
为了可视化单个血细胞，我们求助于红细胞介导的血管造影（EMA），在这种血管造影中，自体红细胞被标记为吲哚青绿（ICG）染料并重新注入受试者的静脉，从而能够观察非人灵长目动物（NHP）和人眼中单个红细胞的运动和动力学。17,18,19重要的是，ICG的近红外荧光波长能够穿过眼睛的色素上皮，从而在视网膜和脉络膜中都可以看到荧光细胞，这为使用适当的仪器可视化脉络膜毛细血管中的单个血细胞开辟了可能。
值得注意的是，在早期的EMA报告中，在这些血管造影照片中，有一些红细胞处于停滞状态，或“暂停”了几分钟到几小时。考虑到红细胞流量、速度甚至流动方向的变化，这一点也不奇怪，因为眼部邻近毛细血管的流动方向都有变化。20,21,22,23红细胞淤积也可能由于血管运动引起，可能来自毛细血管周细胞，22先前有报道称，在某些毛细血管段中存在自发的血瘀红细胞。24具有非典型拓扑结构的脉络膜毛细血管是否是红细胞淤滞的自然部位尚未被探索。虽然这些处于停滞状态的红细胞可以用EMA检测出来，但迄今为止，这些图像的分辨率有限，并且这些处于停滞中的细胞在视网膜和脉络膜微血管中的精确定位尚未被区分。
自适应光学（AO）视网膜成像技术已被用于研究视网膜内的各种细胞和血管结构，因为通过校正眼睛中的光学像差可以提高分辨率。25,26其中，AO增强ICG（AO-ICG）成像显示了在活体人眼中可视化ICG染料的能力，27,28在染料最初通过血管系统的过程中，可以使用AO-ICG显示脉络膜毛细血管的结构。10在本研究中，AO-ICG与EMA（AO-EMA）相结合，直接显示荧光标记的红细胞，具有足够的横向和轴向分辨率，以阐明它们在眼睛中相对于脉络膜微血管的位置。这些额外的信息有助于更好地了解健康和患病眼睛中红细胞淤积和血管功能之间的关系。
结果
红细胞淤滞是一种强烈的现象，在所有眼睛中都可以观察到
在自体注射ICG标记的红细胞后，100%的成像眼睛（4只NHP和37只人眼）观察到红细胞淤积，这与较小的四只眼队列中的初步发现相一致，并在其基础上进一步扩大。17与传统的基于染料的眼底血管造影早期、中期和晚期所描述的信号变化类似，静脉给药后，眼睛内可见的自体注射荧光标记红细胞的数量也随时间变化。注射后使用扫描激光检眼镜（SLO）可以看到淤积的红细胞，在接下来的几个小时内检测到的细胞数量逐渐减少(). 我们没有观察到任何荧光细胞长期驻留的例子（超过一天，经随访影像证实）。值得注意的是，每一只健康的眼睛（n=10）都观察到红细胞淤积，这表明这些处于淤积状态的细胞是在正常生理条件下发生的。
红细胞介导血管造影（EMA）注射后红细胞停滞的时间进程
海德堡扫描激光眼底镜（SLO）在EMA手术之前和之后的时间点（A）的视网膜图像。
（A） 注射前图像显示，在眼睛中未观察到ICG信号（可以看到微弱的背景红外自荧光信号）。
EMA程序后获得的（B–F）SLO图像（在[A]中的虚线框中）显示了红细胞在停滞期随时间变化的位置。（B） 注射15分钟后，可以看到亮度不同的许多停滞事件。（C） 2小时后，在视网膜的不同位置观察到停滞事件，但细胞数量略少于早期。4小时后，停滞事件的数量（D）减少，一天后观察到进一步减少（E）。（F） 术后两周，眼部未见ICG信号。比例尺：200μm。
中央凹无血管区内观察到的血瘀红细胞
在眼球后极观察到红细胞淤积，包括中央凹无血管区（FAZ），该区域不含视网膜血管，并使用光学相干断层血管造影（OCTA）绘制。在对两个NHP进行的八次成像过程中（每个NHP四次成像），每次成像过程中，每个NHP至少有一只眼睛的FAZ内观察到红细胞处于停滞状态()，在所有成像过程中，FAZ中停滞的细胞的平均±SD数为1.4±1.1（范围从0到4）。由于在这些成像过程中经常在FAZ中观察到红细胞淤积，NHP数据表明视网膜血管外的红细胞很可能处于淤积状态，这表明脉络膜微血管内存在红细胞淤滞。
在大多数眼睛的中央凹无血管区（FAZ）内观察到淤积的红细胞
进行红细胞介导血管造影（EMA），自体注射吲哚青绿（ICG）载红细胞并成像。光学相干断层血管造影（OCTA）图像确定了FAZ（中央黑色区域）的位置，该区域缺乏视网膜血管。使用SLO捕获并覆盖在OCTA图像上的荧光标记红细胞图像（白色圆点）显示了FAZ内红细胞处于停滞状态。在非人类灵长类（NHP）眼睛和人类眼睛（绿色方框内）中也观察到类似的结果。在人眼中，对照组、疑似青光眼和青光眼的眼睛中都存在血瘀状态的红细胞，这表明血瘀是一种强健的生理现象。比例尺：1 mm。
基于这些观察结果，即NHP眼的FAZ内存在红细胞停滞()，对一组人眼的进一步研究表明这些发现是可重复的(表S1). 31只眼中有28只眼（90.3%，9只眼（9/9），15只眼（16/16），4只眼（6/6））观察到FAZ内的红细胞淤积。基于广义估计方程分析，FAZ内处于停滞状态的细胞总数在患者队列中没有统计学上的显著差异（p=0.44）。FAZ整体中平均有4.7±4.7个红细胞处于停滞状态（青光眼为5.0±2.8，青光眼可疑眼为3.9±3.2，对照眼为6.5±9.0；平均值±SD）。由于FAZ是一个没有视网膜血管的区域（但仍含有脉络膜血管），这些结果表明，大多数眼睛的脉络膜血管系统中至少有一些红细胞处于淤积状态，打开了可视化活体人眼脉络膜毛细血管中荧光标记的单个血细胞的可能性。
使用AO-EMA进行特定层定位
红细胞淤积的时间进程为使用AO-SLO在几个小时内对其进行成像提供了机会。使用AO-EMA联合方法成功地对处于停滞状态的红细胞进行成像(A和3B）。由于序列成像（SLO和AO交替），在较早时间点采集的SLO图像中观察到更多停滞(A） 与随后采集的AO图像进行比较(B） 与注射后最初几个小时内血瘀的逐渐减轻相一致(). 然而，在SLO和AO图像中可以看到这些细胞的相同总体空间模式，这证实了在SLO图像和AO图片中成功地对细胞子集进行了成像，可以用于进一步分析。与SLO图像相比，AO图像具有更高的横向和轴向分辨率，这是因为成像光束直径增大了约4-5倍，并且校正了低阶和高阶光学像差，29这有助于使用AO-EMA对这些处于停滞状态的细胞进行分层特异性定位。
处于停滞状态的红细胞位于人眼的脉络膜毛细血管层内
（A） SLO图像显示红细胞在眼部的分布。
（B） （A）中白色虚线区域的高分辨率AO-ICG图像显示了血瘀期红细胞的一个子集，在（A）图像后30至40分钟获得。这里，焦平面设置在脉络膜毛细血管层。荧光标记的血细胞在AO图像中都清晰可见（黄色虚线：中央凹无血管区[FAZ]边界）。
（C） 使用AO-ICG在不同焦平面上成像的七个细胞的最大半宽（FWHM）测量结果证实，细胞在脉络膜毛细血管焦平面附近的最佳聚焦。（C）中的每种颜色对应于（A和B）中的一个单元格，该单元格由颜色匹配箭头标识。这些图也证实了处于停滞状态的红细胞并不位于视网膜血管系统中。出于可视化目的，单个单元格的绘图将垂直移动。
（D） 一系列静止红细胞的AO-ICG图像（[A和B]中的深蓝色箭头）跨越不同的焦平面，显示当焦平面靠近脉络膜毛细血管（0.00 mm）时，细胞处于最佳聚焦状态。比例尺：（A）1 mm；（B） 100微米；（D） 70微米。
我们通过依次获取焦平面设置在视网膜和脉络膜中的AO图像，检查停滞是发生在视网膜血管系统还是脉络膜血管系统中。为了比较在两个不同焦平面上获得的同一细胞的图像，计算了ICG信号剖面的半高宽（FWHM）测量值。此测量值计算信号强度为最大强度一半的两点之间轮廓曲线的宽度(图S1). 当使用AO（一种校正光学像差的技术）成像时，这些测量值表明物体聚焦的程度–与聚焦的细胞值相比，离焦细胞将导致更大的FWHM值。在两名受试者的两只眼睛中，使用AO-EMA连续成像的19个细胞中有19个（100%）位于脉络膜血管系统中，既包括FAZ内的细胞，也包括FAZ外的细胞。
为了进一步表征停滞状态下每个红细胞的分层特异性定位，在后续成像过程中，我们获得了一系列连续采集的AO图像，并对眼睛内各层的焦平面进行了精细采样（步长约为35μm）(C和3D）。这些图像序列显示，在离脉络膜毛细血管层更远的焦平面上，使用这种精细取样方法成像的100%细胞（n=7个细胞）变得越来越模糊（失去焦点）。综合起来，我们对两名受试者（n=26个不同的细胞）进行的三次AO-EMA程序的数据表明，红细胞淤积主要发生在脉络膜毛细血管，而不是视网膜血管。
红细胞淤积的相关多模式成像揭示脉络膜微血管的定位
通过将多模式AO图像与在多个时间点和多次就诊中获得的SLO图像相关联，追踪了一整套处于停滞状态的红细胞相对于脉络膜微血管的位置。FAZ周围中央凹旁毛细血管的高分辨率图像证实了大量处于停滞状态的红细胞的存在，即使在FAZ以外的区域，这些红细胞也不能与视网膜血管共存(A和4B），进一步证实了我们的说法，即观察到的停滞发生在视网膜血管系统之外，并且与我们的半高宽比数据一致，该数据表明这些处于停滞状态的红细胞位于脉络膜毛细血管层内。在这里，我们确定了x-y轴首先使用AO-ICG血管造影绘制脉络膜毛细血管图，以确定停滞细胞相对于脉络膜微血管的位置，10然后用AO-SLO和SLO在三年内通过多次EMA程序获得的停滞期红细胞图像对脉络膜毛细血管图进行空间注册(C和S2系列). 令人惊讶的是，在使用这种相关的多模式成像方法确定的约860μm×250μm区域内，共有66个处于停滞状态的红细胞，发现的每一个处于停滞期的单个细胞都位于脉络膜毛细血管段内。由于脉络膜毛细血管是一个很薄的解剖层，所以在较深的脉络膜层中可能有红细胞处于淤积状态。然而，如果是这样的话，我们预计会看到一些处于停滞状态的细胞出现在脉络膜毛细血管管腔区域之外，而我们在这个队列中无法识别这些细胞。此外，半高宽测量结果表明，至少其中一些细胞位于较深的脉络膜层中。在不同时间点和不同访视中处于停滞状态的所有细胞均位于脉络膜毛细血管段内而非流动空洞内的可能性具有统计学意义（p<0.001，二项式检验）。结合我们的半高宽测量数据，这些结果确定红细胞淤积发生在脉络膜毛细血管内。
脉络膜微血管短血管段内出现红细胞淤积
第一年只进行了标准EMA，第二年和第三年都进行了标准的EMA和AO-EMA。
（A和B）血瘀期红细胞的高分辨率AO图像（使用AO-ICG成像的白色圆点；[A]：第2年，[B]：第3年）与视网膜内微血管的AO图像共同注册（黄色，使用AO非焦点分裂检测成像）。
（C） 在脉络膜毛细血管的分割图中(图S2)，视网膜血管的图像是在血瘀期红细胞前方的焦平面上采集的。三年内，与三个独立的EMA程序相关的多个时间点标记的红细胞停滞。不同年份和程序记录的细胞按不同标记进行分类（填充标记：使用SLO成像；未填充标记：用AO成像）。彩色图显示了这些处于停滞状态的细胞被成像捕获的时间点。在该区域内可以识别的所有处于停滞状态的细胞都位于脉络膜毛细血管血管段内。比例尺：200μm。
青光眼患者红细胞淤血在脉络膜微血管中的分布发生改变
为了进一步表征红细胞淤积在健康和疾病中的分布，我们使用EMA评估青光眼（包括青光眼和青光眼疑似眼；表S1). 使用自动细胞检测深度学习算法，在16名受试者的21只眼（15例青光眼，6例对照）中，共客观地鉴定出5823个处于停滞状态的红细胞(图S3和表S2). 对黄斑区和乳头周围区的淤滞进行了分析和比较(). 有趣的是，在青光眼中，与黄斑相比，乳头周围视网膜中淤积的红细胞明显较少（乳头周围视网膜为102.9±46.1，黄斑为236.5±89.7，p<0.001）(C） ●●●●。对照组未观察到这种现象（乳头周围视网膜122.9±47.3，黄斑146.1±83.7，p=0.335）。为了进一步表征停滞期细胞的相对分布，我们引入了一种简单的定量指标，该指标基于乳头周围视网膜和黄斑（PMR）之间的比率计算。正如预期的那样，与对照眼相比，青光眼的PMR显著倾斜（青光眼为0.43±0.14；对照眼为0.93±0.27；p<0.001，广义估计方程）(D） ●●●●。这些发现提示青光眼视神经头附近的脉络膜毛细血管网络存在局部功能或结构改变。由于EMA手术或将青光眼患者与健康受试者进行比较，在心率、呼吸频率、血压或温度方面没有观察到差异。
使用载ICG的红细胞对人类进行EMA，以确定健康和疾病眼睛中停滞细胞的视网膜分布特征
（A和B）对照组和青光眼受试者的平均宽视野SLO图像显示了黄斑区和乳头周围区域（白色虚线区域）的固定细胞分布。
（C） 对照组受试者黄斑区和乳头周围区停滞密度（细胞密度）中红细胞绝对数量的箱线图相似，而青光眼受试者，黄斑细胞密度高于乳头周围细胞密度（中心线：中位数，红三角：平均值，框限：上/下四分位数，胡须：1.5倍四分位数间距，黑点：个人数据点）。
（D） 与对照组相比，青光眼受试者的乳头周围与黄斑比率（PMR）值降低，表明青光眼视神经周围的细胞淤积较少，而视神经是青光眼发病机制的影响区域。比例尺：2毫米。
讨论
目前对健康和疾病中脉络膜毛细血管的认识主要基于结构成像或体外组织学研究中，血流模式通常被建模为离散的“功能性小叶”，即围绕中心毛细血管前小动脉组织的相邻脉络膜毛细血管血管段簇。30,31,32,33在本文中，我们介绍了两种互补技术的自然组合（AO-EMA）10,17,18,28这揭示了之前未发现的红细胞聚集状态，这些红细胞隐藏在脉络膜微血管内。
在FAZ内观察到的红细胞淤积()以及视网膜毛细血管之间的区域(A和4B），结合这些细胞在两个轴向的脉络膜毛细血管腔中的停滞定位(C） 和横向(D） 尺寸显示后极红细胞淤积主要发生在脉络膜微循环内。仅作为从头开始使用EMA可以揭示血瘀状态，在任何给定的时间，血瘀状态中都可能有额外的红细胞未被检测到。对于典型的EMA注射液，总血容量中含有荧光标记红细胞的不到0.05%，因此可能只有一小部分处于停滞状态的细胞被捕获。停滞期的细胞数量也可能与每个个体特有的因素有关，包括脉络膜毛细血管结构和有效血容量。时间动力学()提示这些处于停滞状态的细胞自发地出现在脉络膜毛细血管内，并能在数分钟到数小时内保持稳定。处于停滞状态的红细胞的这种周转将允许细胞在某个时刻回到循环中，而不会影响特定组织内的总血流量。
计算流体动力学模拟34,35流过视网膜毛细血管网的单个红细胞中，有个红细胞处于淤积状态，这似乎最常见于短血管段，这些血管段似乎架起了两条通道的桥梁36（在此模拟中，毛细血管直径假定为10μm，大小与脉络膜毛细血管管腔相似）。我们的发现与这一模拟结果一致，这支持了我们的假设，即红细胞淤积是脉络膜微血管的标志，主要由毛细血管床本身的结构而非单个红细胞的流变性建立。特别是，有人假设红细胞硬度会因衰老、高血压或糖尿病而增加，37,38,39可以在单细胞水平上影响毛细管流动。然而，通过滤过率评估红细胞变形性的研究表明，红细胞鬼影的变形性指数低于天然红细胞（即在流经滤过器时更有效）。37,40用于EMA的ICG载红细胞17类似于幽灵红细胞，它们被广泛用作生物药物的载体。41这些先前的发现表明，ICG负载红细胞比天然红细胞更不可能自发进入停滞状态。
从结构角度来看，考虑到脉络膜毛细血管特征的短而相互连接的血管段数量高于典型数量，因此，与含有较少短、相互连接的视网膜毛细血管相比，处于停滞状态的红细胞在脉络膜毛细血管中更丰富也就不足为奇了，互连容器节段22,23因此，预计处于停滞状态的细胞会更少。由于血管结构的差异，视网膜血管系统中任何处于停滞状态的红细胞都可能比脉络膜毛细血管中的红细胞停留的时间更短。值得注意的是，虽然在最小的视网膜毛细血管中，单个血细胞呈单列流动，但处于停滞状态的红细胞可能会暂时阻塞血流；相反，脉络膜毛细血管的管腔直径越大，理论上会允许其他红细胞在停滞状态下流过单个红细胞。
在确定红细胞淤积是在所有眼睛中观察到的一种生理强健现象后，我们发现与健康眼睛相比，青光眼淤积中红细胞的分布发生了显著变化。由于大多数青光眼队列包括疑似青光眼患者，因此脉络膜微血管的这些破坏可能是疾病的早期指标。我们发现，当计算乳头周围和黄斑区停滞期细胞数量的比率时，存在统计学上的显著差异，这可能有助于解释观察到的停滞期细胞绝对数量的受试者间差异。我们的观察基于先前的研究，这些研究报告了视网膜和脉络膜乳头周围萎缩与青光眼的发展和进展相关。42眼球摘除的临床病理相关性表明，乳头周围绒毛膜毛细血管可能是与青光眼变性相关的乳头周围萎缩的原因。43最近，扫描源OCTA成像显示乳头周围萎缩区域的脉络膜微血管丢失，这是青光眼性结构损伤的先兆，特别是视网膜神经纤维层变薄。13,14,15,16这些先前的研究与以下观点一致：青光眼不仅仅是视网膜内部的疾病，脉络膜和脉络膜毛细血管的循环可能与视神经循环有关。考虑到这些研究，在乳头周围区域观察到的停滞事件的相对减少可能是预期会发生停滞事件的短绒毛膜毛细血管段脱落的结果。
迄今为止，仅推测脉络膜血流中断延伸至视神经头附近，尚未探索脉络膜毛细血管功能的区域差异。考虑到脉络膜毛细血管与筛板（睫状后短动脉）有共同的血液供应，甚至可能有助于滋养层前视神经头，我们的工作确定，乳头周围的脉络膜毛细血管可能比黄斑的脉络膜毛细管受影响更大，这并不奇怪。此外，眼压升高缺乏自动调节反应44也可能使乳头周围区域更容易受到脉络膜毛细血管功能改变引起的损伤。这种血流模式本身的功能改变也可能导致青光眼中观察到的淤滞模式的进一步改变。最后，考虑到脉络膜毛细血管与视神经头共用一个共同的血液供应，这一点也很有趣，这可能是早期脉络膜毛细血管功能障碍与青光眼性视神经病变相关的神经损伤之间的联系。然而，还需要进一步研究来阐明脉络膜毛细血管结构、血流模式变化和青光眼性视神经病变之间的潜在关系。
观察到的视神经周围淤滞数量的相对减少与该区域脉络膜毛细血管的变化一致。例如，这可能是由于脉络膜毛细血管网络中的血管较少或分支点较少所致，例如一名患有弓形虫视网膜脉络膜炎（一种永久影响脉络膜毛细血管系统的疾病）的受试者缺乏红细胞淤积(图S4). 与病灶外区域相比，该受试者病灶内相对缺乏红细胞淤积。OCTA还显示，上覆的视网膜血管完好无损，支持我们的解释，即缺乏淤积反映了脉络膜血管缺陷，而不是视网膜血管缺陷。这一例证支持了我们的观点，即脉络膜毛细血管血管结构的损伤可能会导致红细胞淤积减少。更广泛地说，这些处于停滞状态的细胞倾向于出现在短血管段中(C） 说明了EMA作为监测眼部不同区域可能受疾病局部影响的脉络膜毛细血管功能的工具是如何有用的。
这项研究证实，脉络膜毛细血管内存在一种红细胞处于停滞状态的生理强健现象，尽管流经该毛细血管床的血液量相对较高，但偶尔会停留数分钟至数小时。尽管据我们所知，这项研究代表了迄今为止最大的队列体内EMA、更多年龄范围更广的受试者以及未来需要进行纵向研究，以更好地了解脉络膜微循环中的这些短暂停滞事件。我们预计AO-EMA将揭示令人兴奋的新可能性，以可视化单个血细胞流经脉络膜毛细血管网络的方式，这是目前任何其他方法都无法实现的，体内或体外利用深度学习证明青光眼的潜在临床实用性表明，追踪停滞事件可以作为一种定量指标，用于识别脉络膜微血管可能的局部变化。除了青光眼，绒毛膜毛细血管损伤也与其他眼病有关，包括年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。三,45,46这与之前关于视网膜受黄斑变性或视网膜静脉阻塞影响的区域红细胞淤积减少的报道一致。17这些疾病中关键毛细血管段的脱落以及微血管血流的改变也可能表现为红细胞淤积分布的改变。这些对健康和疾病中单个血细胞如何通过脉络膜微循环的初步认识可能会导致早期检测和跟踪微血管损伤的新策略。最终，AO和EMA的结合为监测其他神经退行性疾病（如帕金森和阿尔茨海默病）的微血管健康提供了一种工具。47
研究的局限性
在本研究中，在EMA注射后至少1小时的时间点进行AO成像。由于在研究地点之间旅行所需的时间，早期的时间点是不可能的。在未来的研究中，跨不同年龄组招募更多受试者可能会进一步深入了解衰老在停滞事件中的作用。最后，对其他疾病的EMA进行评估，可以进一步阐明血瘀期红细胞与神经血管组织整体健康的关系。
STAR★方法
实验模型和主题细节
非人灵长类
两只健康雄性恒河猴(猕猴，11岁和17岁，其他详细信息请参见关键资源表)用于本研究。每个NHP在全身麻醉和麻痹状态下进行了几次成像，以控制眼球运动（成像和麻醉方案包括在方法详细信息（见下文）。每只动物的双眼在每次治疗期间都会被成像。在成像过程中进行基线光学相干断层扫描（OCT），以评估和监测眼部健康状况。本研究遵循巴尔的摩马里兰大学动物护理和使用委员会批准的方案。包括来自两个NHP成像的所有四只眼睛的数据，用于红细胞淤积的定性评估。
人体受试者
本研究的受试者是从巴尔的摩马里兰大学眼科和视觉科学系招募的（更多详细信息请参见表S1). 对照组从验光机构招募，青光眼或青光眼可疑受试者从青光眼机构招募。这项研究得到了马里兰大学、巴尔的摩大学和国家卫生研究院（NIH）的机构审查委员会的批准，并按照赫尔辛基宣言进行。在登记之前，获得了所有参与者的知情同意。要获得入选资格，受试者必须年满18岁，在房角镜检查中具有开阔的视角，研究眼睛的最佳矫正视力至少为20/200，并被指定为对照组、青光眼或青光眼疑似患者。可疑青光眼的诊断包括具有青光眼特征的受试者，这些特征可能提示患有早期疾病，但不符合疾病的诊断标准，例如眼压升高但根据OCT或视野检查未检测到结构和功能损失的受试者。如果受试者对ICG、碘或贝类过敏，怀孕或哺乳，患有严重肝病或尿毒症，或正在参与任何其他试验药物研究，则被排除在外。
所有受试者均由经验丰富的青光眼专家（OJS）进行详细的眼科检查，然后根据美国眼科学会的首选实践模式，对青光眼、疑似青光眼或对照进行诊断。49,50对照组的视神经外观正常，杯盘比为0.4或更低，视网膜神经纤维层厚度正常，眼压在所有就诊时均小于21。两组之间糖尿病和高血压患者的人数没有显著差异。在马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院（NIH）的国家眼科研究所（NEI），招募了两名入选受试者进行AO-EMA成像（如下所述）。对于这些受试者，在NEI进行的手术获得了额外的知情同意。这些附加程序是在多次就诊期间进行的：在EMA前两周进行基线成像，以验证是否没有任何ICG信号；在马里兰大学进行AO-EMA成像，与EMA成像的当天进行（注射后2–3小时，以考虑旅行时间），并在首次AO-EMA成像后一天和两周随访成像。一年后，在一个受试者身上重复了AO-EMA。
共有22名受试者的37只眼接受了EMA成像。根据受试者完成成像程序的能力和产生的图像质量，每次分析都使用来自患者子集的图像(表S1). 为了量化FAZ中的红细胞淤积，分析了18名受试者的31只眼：排除了4名人类受试者中的6只眼，因为他们没有可用于准确识别FAZ的OCTA（OCTA仪器是在研究两年后获得的）。为了确定红细胞淤积分布的分析，对16名受试者的21眼进行了分析：12名受试人员的12眼有黄斑血管造影但没有乳头周围血管造影，1名患者的2眼没有乳头周围或斑点血管造影，由于过度的运动伪影或变异性，两名受试者的两眼被排除在外，使得图像配准和分析变得不可能。如上所述，两名受试者共同参与了AO的研究，并对这四只眼睛的图像进行了深入分析。
EMA准备
根据之前公布的程序，NHP和人类的红细胞标记过程相同。18简单地说，在成像之前，在手术当天抽取了17毫升血液。以无菌方式从全血中分离红细胞，装载ICG并准备用于自体注射。在NHP中静脉注射最多1 mL载ICG的自体红细胞，并在人体内静脉注射最多4 mL载ICG-的自体红血球。NHP的制备和注射在马里兰大学医学院进行，人类红细胞的制备与注射在马里兰大学医学中心的普通临床研究中心进行。注射前在显微镜下检查载ICG红细胞的物理形态。17
方法详细信息
NHP成像
注射前，NHP用氯胺酮（5–10 mg/kg）和甲苯噻嗪（0.2–0.4 mg/kg）麻醉，并用维库溴铵（40–60μg/kg，随后0.35–45μg/kg/min）麻痹。NHP用气管插管，并从异氟醚麻醉装置中给予100%氧气。在整个疗程中，使用保温毯保持体温。用1%托吡卡米扩张NHP，并用金属丝眼睑镜分离检查眼睑。卧姿时，使用海德堡视网膜血管造影仪+光学相干断层扫描（HRA+OCT）设备（德国海德堡工程有限公司）的自动实时跟踪（ART）平均功能，获得以黄斑为中心的平均15、20和30度视野（FOV）图像。使用相同的设备对黄斑进行光学相干断层扫描血管造影（OCTA）。在整个成像过程中使用平衡盐溶液来润滑角膜。NHP心率、血压、体温、呼吸频率、血氧饱和度（SpO2)以及在整个成像过程中监测潮末二氧化碳水平。每次成像结束时，将局部抗生素软膏（红霉素）涂抹在眼睑上，以防止眼部感染。
人体标准EMA
在基线检查时监测患者的心率、呼吸频率、血压和体温，并在整个疗程中进行记录。在红细胞注射之前，在马里兰大学医学中心，人类参与者使用1%的热带酰胺进行瞳孔扩张。使用SLO（德国海德堡工程有限公司海德堡视网膜血管造影仪2）获得视网膜血管造影术。使用15度水平乘以7.5度垂直FOV，以每秒24.6帧的速率分别以视盘或中央凹为中心，在每只研究眼睛的乳头周围和黄斑区域进行血管造影。还获得了视网膜的平均30度视野自动实时跟踪（ART）图像。以黄斑为中心进行OCTA。
AO-EMA公司
在成像之前，每个受试者的眼睛在NEI处用1%的托匹卡米进行扩张。进行了多模态AO-SLO成像27使用结合共焦反射的定制仪器，29非焦点分裂检测，51和AO-ICG。28这三个成像通道主要用于分别显示反射性锥体光感受器、视网膜内血管和脉络膜毛细血管/ICG载红细胞。简单地说，该系统使用790 nm超发光二极管（SLD）（S-790-G-I-15-M，爱尔兰Superlum）进行成像，使用880 nm SLD（SLD-mCS-341-HP1-SM-880，爱尔兰Super lum）用于波前传感。AO-ICG成像使用5 Airy圆盘直径针孔进行，预计轴向分辨率为～35μm。52对于每只眼睛，在黄斑附近的不同位置总共采集了40到80个视频，每个视频的长度为20秒到2分钟（每秒16.7帧）。在图像采集过程中，受试者被要求观看计算机控制的注视目标53自然眨眼。
在所有访视中，使用能够检测ICG的市售SLO在30°FOV上对受试者进行成像，以确定任何停滞红细胞的位置（Spectralis HRA+OCT，Heidelberg Engineering GmbH，Germany）。在基线检查时，使用SLO和AO图像来确认血瘀期没有红细胞。在EMA成像当天，在SLO成像后立即在已识别的停滞细胞位置进行AO-SLO成像（视网膜上的方形视野范围为1至2°）。在选定的停滞位置，在不同的焦平面上连续采集一系列AO图像。在AO-SLO成像采集之间，每小时重复一次SLO成像，以跟踪停滞状态下红细胞的动力学，总共持续三到四个小时，包括成像过程中的频繁中断。一天后进行随访，以确认是否存在ICG载红细胞处于停滞状态。在EMA注射后两周的最后一次就诊时，重复SLO成像，然后进行AO-ICG血管造影，以在静脉注射溶于3 mL水溶液中的25 mg ICG染料后绘制脉络膜毛细血管。10
数据处理和分析
预处理
对于标准EMA，对在人体成像过程中收集的血管造影进行注册，以最小化眼球运动的影响，并使用自定义MATLAB（MathWorks，vR2019a）脚本进行对比，以优化对停滞期细胞的检测。54,55
对于AO-EMA，按照标准程序纠正眼球运动，56和平均AO图像被组合成一个较大的蒙太奇，并注册到SLO图像中进行比较。
FAZ中的红细胞淤积（标准EMA）
为了确定脉络膜循环中处于停滞状态的红细胞，对NHP和人类FAZ内的静止细胞进行了计数。使用至少25个连续帧的时间平均EMA图像来识别处于停滞状态的细胞。En脸OCTA图像叠加在平均EMA图像上，允许描绘FAZ边界，该区域缺乏视网膜血管。统计FAZ内停滞的细胞数。
停滞事件的分布（标准EMA）
对于每一张血管造影，我们使用25个连续EMA帧的时间平均值（TA）来观察红细胞在至少一秒钟内处于停滞状态。这导致每个视频中有5到15个图像被分析，以评估红细胞在不同视网膜位置的分布。使用经验证的神经网络识别乳头周围和黄斑区淤积的红细胞，详情如下（参见“数据集注释”).
随后分析了对照组和青光眼受试者椎间盘和黄斑区细胞密度的数量和分布。在该分析中，青光眼和青光眼疑似受试者被分组在一起，并与对照组进行比较。比较这两组黄斑和乳头周围区域中细胞的绝对数量以及相对数量（以解释标记红细胞浓度的变化），其特征是使用乳头周围区域与黄斑区域中的细胞比率（乳头周围与黄斑比率，PMR）。使用一个广义估计方程来解释使用同一对象的两只眼睛。
红细胞淤积轴向定位（AO-EMA）
由于与SLO相比，AO-SLO系统使用更大的成像光束，因此AO-SLOC系统具有更高的轴向分辨率57与本研究中使用的SLO系统相比。基于不同焦平面上每个细胞ICG信号分布的半高宽值的计算，这使得停滞期每个ICG标记细胞的轴向定位更好，范围从视网膜内层到脉络膜附近（FWHM值预计在细胞聚焦时最小，而在细胞失焦时较大）。使用相应的共焦反射和分裂检测图像确定焦平面的轴向位置。当焦平面设置在视网膜内侧附近时，在分裂检测通道中可以看到视网膜血管；当焦平面同时设置在感光层和脉络膜毛细血管层附近时，共焦反射通道中可以看见锥形感光体。10为了评估不同AO焦平面上FWHM测量值的变化，将脉络膜毛细血管焦平面设置为原点，并基于改进的Bennett-Rabbett模型眼将焦移从屈光度转换为毫米，其中轴向长度、角膜曲率和前房深度测量（IOL Master，Zeiss）使用了受试者的放大眼睛。
绘制脉络膜毛细血管和FAZ（AO-EMA）
体内绒毛膜毛细血管的图像是通过AO-SLO成像ICG染料获得的。10简言之，在静脉注射ICG染料后，在过渡期的最初两分钟内测量ICG荧光信号随时间的变化情况。正如预期的那样，发现了多个荧光峰，对应于染料最初通过眼睛和随后的染料再循环。通过从初始团块通过期间（注射后10至20秒）的平均ICG信号中减去染料再循环后（注射后1至2分钟）的平均ICG信号来获得脉络膜毛毛虫图像。每个受试者最多可获得两张脉络膜毛细血管图像，方法是将3mL ICG总剂量分为两个连续给药剂量（1mL ICG和2mL ICG）。同时获得的锥体感光器图像用于将脉络膜毛细血管图像与其他AO图像进行联合配准。
副中央凹视网膜毛细血管的图像是通过将焦平面设置在视网膜内部获得的非焦点分割检测AO视频获得的。根据运动对比度增强计算血管结构。23,58简单地说，对于每个视频，在眼动校正视频上计算逐像素标准偏差图像。由于眼球运动使视网膜在不同帧之间的位置发生了变化，所以每张图像边缘的一些像素都不可见。因此，对可用像素的子集执行标准偏差计算。对灌注视网膜血管的结果图像进行蒙太奇处理，以绘制FAZ。与上述类似，同时采集的感光器共焦反射图像被用于将副中央凹毛细血管的图像与其他AO图像进行联合配准。
AO-ICG脉络膜毛细血管分割
如前所述，对脉络膜毛细血管进行分割。10首先，基于Hessian的Frangi滤波器59使用MATLAB（MathWorks，vR2021a）将其应用于AO-ICG脉络膜毛细血管图像，从而生成血管段的二进制掩码。接下来，通过在脉络膜毛细血管图像上叠加二进制掩模来进行手动校正，以校正分割中的任何错误(图S2). 为了比较多个EMA程序中处于停滞状态的细胞的位置，基于视网膜标记将图像空间注册到二值化的脉络膜毛细血管图。然后根据成像方式和时间点对所有观察到的停滞期细胞进行标记和分类。
使用单侧二项检验评估停滞期细胞定位于脉络膜毛细血管血管段的概率，预期成功概率设置为图像中与脉络膜毛细血管管腔相对应的像素百分比（68%）。
基于深度学习的红细胞淤积自动检测
数据集注释
对于每只眼睛，选择四个扫描激光检眼镜（SLO）图像，其中两个15×7.5度ROI位于视神经头中心（不包括视神经头本身），两个15 x 7.5度ROIs位于黄斑区中心(A和5B）。如果视神经头和黄斑ROI之间存在重叠，则进一步修剪黄斑RO以排除重叠区域。两名专业分级员在总共24张图像中手动识别出处于停滞状态的红细胞，从这些图像中，使用逐像素标记生成二进制掩码。来自两个评分者的不一致标签由第三个专家评分者进行仲裁，以获得最终的一致性注释。
网络架构、培训、评估
红细胞检测网络是使用基于回归的神经网络在PyTorch中实现的60如所示图S3.网络设计遵循U-net架构61除了使用地面真值二元掩码的距离变换生成的回归图进行训练外。与二进制掩模相比，距离图保留了红细胞的空间信息，同时增强了对细胞质心位置的预测重要性，同时削弱了对细胞边界的预测重要性。在训练过程中，以基于补丁的方式进行数据增强，其中48×48像素随机裁剪的图像补丁在随机变换（旋转、镜像和平移）后进行增强。使用Adam算法优化网络参数，初始学习率为3×10−4，β=（0.9,0.999）。
训练后，使用水平和垂直方向步长均为16像素的滑动窗口将细胞检测模型应用于全尺寸SLO图像。合并所有滑动窗口的输出，以在全尺寸SLO图像上重建距离图预测。红细胞位置被确定为使用一组5乘5的相邻像素构建的距离图的局部最大值。检测到的单元格示例如所示图S3B和S3C。
采用六重交叉验证策略（离眼）进行评估。具体而言，在每个交叉验证文件夹中，来自五只眼睛的20张图像（每只眼睛4张图像）用于网络训练，来自其余眼睛的4张图像用于网络验证。根据线性赋值Kuhn-Munkers算法，将预测细胞与地面真实细胞进行匹配62基于笛卡尔距离代价函数。总的来说，自动细胞检测算法实现了良好的检测精度，六倍的F1平均得分为93.8±2.8%（平均值±SD）(表S2). 尽管存在一些错误的预测，但整个数据集的整体细胞计数预测与地面真实细胞计数高度相关（R2=0.9827，p<0.001；图S3D） ●●●●。平均相对计数误差（绝对计数误差与总细胞计数的比值）为1.27%。这些结果证明了基于回归的U-net模型在EMA图像上自动检测红细胞的性能。
量化和统计分析
数据表示为平均值±标准偏差（SD）。显示了n的精确值。使用二项式检验计算不同访视中观察到的所有停滞细胞位于脉络膜毛细血管管腔内的可能性（见“红细胞淤积的相关多模式成像揭示脉络膜微血管的定位”). 采用广义估计方程比较了对照组和青光眼之间停滞期细胞相对分布的差异(). 所有测试都是使用Matlab或Python进行的。统计显著性设为p<0.05。
鸣谢
我们感谢D.Cunningham、M Arango、G Babilonia-Ayukawa、B.Gildersweeve、D.Claus、S.Suy和C.Appleman在NIH NEI眼科诊所的研究程序方面提供的帮助。我们还感谢T.Liu对AO数据进行了有益的技术讨论。本研究部分得到了NIH NEI校内研究计划、马里兰大学巴尔的摩分校、临床与转化研究所（ICTR）以及国家转化科学促进中心（NCATS）临床转化科学奖（CTSA）拨款1UL1TR003098的支持。该研究也得到了NIH/NEI拨款R01EY031731的支持。EW Lai和C.Simon得到了巴尔的摩马里兰大学学生和导师发起的研究项目（PRISM）的资助。
作者贡献
概念和研究设计：JT和OJS，数据采集和分析：JL、DW、JP、AJB、SA、EWL、CS、LI、LAH、JT、OJS。数据解释：JL，DW，JP，AJB，SA，LAH，YT，JT，OJS；患者转诊：OJS。
利益声明
OJ Saeedi获得了海德堡工程公司的财务和非财务支持。其他作者声明没有竞争利益。
数据和代码可用性
•
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本研究中使用的已发表文献中之前未描述的自定义代码可从引线触点应合理要求。 •
重新分析本文中报告的数据所需的任何其他信息可从引线触点应合理要求。
工具书类
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