THOC5与DDX5、DDX17和CDK12的复合物调节R环结构和转录延伸率

细胞培养与慢病毒转导

如前所述，用对照shRNA（shCr）和靶向THOC5（shTHOC5）的shRNA培养并转导HEK293细胞。¹⁹si-和shRNA序列列于表S5表达Dox诱导RNA Pol II突变体的HEK293细胞⁴⁹用200μg/mL潮霉素B和6.5μg/mL杀囊虫素维持。用靶向THOC5的对照shRNA和shRNA转导这些细胞。1至3天后，用2.0μg/mL多西环素处理对照组和THOC5缺失细胞12至16小时，再用2.5μg/mLα-阿马尼汀处理42小时，此时所有细胞系都是活的，内源性Pol II不活跃。所有细胞系均无支原体污染。

RNA分离

如前所述，分离了细胞质RNA。⁸使用NEBNext®PolyA+mRNA磁性分离模块（美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室）从细胞质RNA中分离PolyA+mRNA。

RNA测序和数据处理

PolyA+RNA（500 ng）用于纳米孔直接RNA测序。根据制造商的协议，使用直接RNA测序试剂盒（SQK-RNA002，牛津纳米孔技术有限公司）制备文库。文库在R9.4流式细胞上测序48小时。使用Guppy（牛津纳米孔）进行基本调用。使用minimap2将基准数据与人类参考基因组GRCh38对齐。⁵¹

3′端解理分析

用于识别3′解理位点的工具NanoFilt⁵⁰（长读取测序数据的过滤和修剪）用于将mRNA序列从5′端修剪为均匀长度，以便保留最后200个核苷酸（python get_read_ends.py--bases_from_end 200 reads.fastq.gz | gzip>last_200_bp.fastq.gz）。使用minimap2将修剪后的读数与GRCh38或GRCh37人类基因组参考值对齐。使用人类polyA数据库对Seqmonk进行3′切割定量。⁵²选择包含两个以上注释性聚腺苷酸化位点（PAS）和5个以上远端PAS位点读取的基因进行下游分析。计算近端和远端卵裂部位之间的比率。

染色质免疫沉淀（ChIP）

如前所述进行ChIP实验。⁸简单地说，将5×106个细胞的等分试样固定在1%（v/v）多聚甲醛中5分钟，然后在125 mM甘氨酸中淬火。分离核部分并将其重新悬浮在超声缓冲液中（0.1%SDS、50 mM TrisHCl、pH 8.0、0.2 mM EDTA、1x蛋白酶抑制剂混合物（Sigma））。根据制造商的说明，使用Covaris AFA™（美国马萨诸塞州沃本市自适应聚焦声学）技术将染色质剪切成500 bp的DNA片段。剪切后，添加NaCl和NP-40，最终浓度分别为150 mM和1%。使用预涂有抗RNA聚合酶II（Abcam，Cambridge，GB）、THOC5、CDK12、FLAG M2抗体或对照IgG的G蛋白琼脂糖PLUS（Santa Cruz Biotechnology Inc.，TX，USA）对提取物的等分试样进行免疫沉淀。在4°C下旋转4 h后，在RIPA缓冲液中洗涤珠子三次（150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，50 mM TrisHCl，pH值为8），在洗涤缓冲液中清洗珠子两次（500 mM NaCl，1%NF-40，0.1%SDS，100 mM Tris HCl，pH值8）。在65°C（250 mM NaCl）下，在RNA酶A的存在下，将交叉链颠倒8 h。在55°C下蛋白酶K消化1 h后，使用NucleoSpin Extract II（德国杜伦市马切里·内格尔）分离结合DNA部分。

ChIP测序和数据分析

使用TruSeq ChIP library preparation Kit（Illumina，CA，USA）对5 ng ChIP衍生DNA进行文库制备。库是根据制造商的协议编制和索引的。将索引文库合并并在Illumina HiSeq 2500（Illumina）上测序。FASTQ文件由CASAVA生成（v1.8.2）。Galaxy工作流(网址：www.usegalaxy.org)用于后续数据分析。使用Bowtie2（Galaxy版本2.3.4.1）将读数映射到人类参考基因组（GRCh38）。使用MarkDuplicates（Picard）检测并删除PCR重复项。使用deepTools 2.0进行元基因分析。⁵³使用Seqmonk进行MACS峰值调用，以识别每个数据集中丰富的峰值。原始数据存储在{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE173374”，“term_id”：“173374”}}GSE173374标准.

DRB/TT公司_化学品-序列

如前所述执行DRB/TTchem-seq。²³治疗方案如所示图2D.简单地说，为每个时间点、实验样品或对照准备一个10厘米的培养皿，其中HEK293细胞的汇合率为70%。释放后每个时间点用100μM 5,6-二氯苯并咪唑（DRB）处理细胞3.5小时。在预热至37°C的10 mL PBS中，通过三次洗涤释放DRB抑制。PBS洗涤后，将含有1 mM 4SU的新鲜培养基直接添加到细胞中，如图2使用TRIzol试剂分离D.RNAs，并在166 mM NaOH冰上破碎20分钟。将3μL生物素缓冲液（833 mM Tris-HCl，pH 7.4，和83.3 mM EDTA）和50μL 0.1 mg/mL MTSEA生物素-XX连接剂（Biotium，CA，USA）添加到200μL片段RNA中以生物素化4SU-RNA，并在室温下黑暗培养30分钟。通过添加等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1（v/v/vol））分离生物素化RNA，然后在NaCl/异丙醇中沉淀。然后使用μMACS链霉亲和素微球从非生物素化片段中分离生物素化RNA片段（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）。使用斑点杂交分析测试4SU的掺入(图S1A） ●●●●。在生物分析仪上分析生物素化RNA(图S1B） 在进行配对测序之前（Illumina，SD，USA）。

为了测量Pol II分子进入基因体的进展，我们应用了Gregersen等人描述的管道。用于从DRB/TT-seq时间序列数据中调用RNA Pol II转录波峰值位置和延伸率。该管道首先创建了一组基因组区间，代表标准染色体（4591个基因）宽度为60-300 kb的非重叠蛋白质编码基因的TSS区域（−2 kb:+120 kb）。然后计算读取覆盖率并将其归一化为测序深度。

为了计算伸长率，应用了“单个基因的波峰调用”模块。该模块在第一个样本（例如，10分钟）中过滤出表达不良的基因（例如，−2 kb:+120 kb区域的总基带覆盖率<100 rpm）和波峰<2 kb的基因，以减少TSS区域的噪音。

核质和染色质相关组分的分离

HEK293电池（10⁷)用细胞质裂解缓冲液（50 mM TrisHCl，pH 8.0，140 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂，0.5%NP-40，核糖核酸酶抑制剂，1 mM DTT）。离心（800xg，2分钟）后，除去上清液（细胞质部分），并将沉淀重悬于60μL NUN1缓冲液（20mM Tris-HCl（pH 7.9）、75mM NaCl、0.5mM EDTA和50%（v/v）甘油）中。600μl冰镇NUN2缓冲液（20 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、300 mM NaCl、0.2 mM EDTA、7.5 mM MgCl₂然后将1%（v/v）NP-40和1 M尿素）添加到悬浮液中，旋转并在冰上进一步培养15分钟。离心后，收集上清液作为核质部分。将颗粒与Turbo DNAse I（美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司）在37°C的高盐缓冲液（含500 mM NaCl，1x蛋白酶抑制剂混合物（Sigma））中培养20分钟（染色质相关部分）。对于联合免疫沉淀研究，染色质相关部分用含0.5%NP-40的50 mM Tris-HCL pH 8缓冲液按1:3稀释。

使用染色质相关组分的共免疫沉淀（Co-IP）

将染色质相关提取物在50 mM Tris-HCl（pH 8）中稀释至150 mM NaCL浓度，然后添加NP-40至0.5%（v/v）浓度。用蛋白G琼脂糖-PLUS和小鼠单克隆抗THOC5、FLAG M2抗体或RNAse A存在下的对照IgG对稀释的提取物进行免疫沉淀。在4°C下旋转8小时后，将珠洗五次。提供输入和结合样品用于免疫印迹或相互作用组分分析。

染色质相关THOC5相互作用蛋白的分析

沉淀的THOC5蛋白复合物和对照IgG在10%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用简单的蓝色考马斯安全染剂染色（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。沉淀的THOC5蛋白复合物和对照IgG在10%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用简单的蓝色考马斯安全染剂（Thermo Fisher Scientific）染色。在200 mM碳酸氢铵（40%（v/v）乙腈）中重复培养，切除蛋白质带并去除其染色。凝胶片在乙腈中用3次洗涤液干燥，然后在37°C下过夜胰蛋白酶化（胰蛋白酶重新悬浮在100 mM碳酸氢铵、5%（v/v）乙腈中）。通过在50%（v/v）乙腈、0.1%（v/v）甲酸中孵育从凝胶片中提取肽，将肽干燥并重新悬浮在3%（v/w）乙腈，0.1%（v/v）甲酸，20 mM柠檬酸，pH 2.7中。对于每次分析，将10%的肽样品加载到纳米ACQUITY UPLC Symmetry C18 Trap（5μm，180μm×20 mm）（Waters Corporation，MA，USA）上，并将流量设置为15%（v/v）乙腈、0.1%（v/v）甲酸和20 mm柠檬酸的15μL/min，持续5分钟。使用纳米ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，75μm×250 mm）（Waters Corporation）对肽进行分析分离。简而言之，肽在91min的溶剂梯度上从3%（v/v）乙腈、0.1%（v/v）甲酸到40%（v/w）乙腈和0.1%（v/v）甲酸在线分离到LTQ Orbitrap Velos（Thermo Fisher Scientific）。使用信息相关采集方法采集数据，其中，对于每个周期米/z（z）300–1700是在Orbitrap中以60000米/赫兹400的分辨率获得的，自动增益控制目标为106。每次完整扫描后，选择20个最强烈的离子；CID（碰撞诱导解离）和MS/MS分析在LTQ Orbitrap Velos仪器（Thermo Fisher Scientific）中进行。选定离子被排除在进一步分析之外60秒。未分配电荷或电荷为+1的离子被拒绝。

使用Mascot（美国伊利诺伊州矩阵科学公司）软件分析数据；参数为：Uniprot数据库、允许有多达1个缺失卵裂的胰蛋白酶、允许有可变修饰的氧化蛋氨酸、磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸修饰，以及对MS/MS耐受的0.025和0.03 Da的肽耐受性。

丢弃在对照IgG和沉淀的THOC5复合物中检测到的蛋白质。然后，进一步选择吉祥物>30的THOC5互动伙伴进行Ingenuity®路径分析（IPA）。

免疫印迹程序

免疫印迹的细节已经在前面描述过。⁵⁴本研究中使用的抗体列于关键资源表.

半定量RT-PCR和qRT-PCR分析

如前所述进行半定量RT-PCR和qRT-PCR。⁵⁵每个PCR的引物对如所述表S6.

DNA-RNA斑点杂交

使用QIAmp DNA Mini试剂盒分离基因组DNA（德国希尔登市齐根，51304）。基因组DNA（500 ng）在37°C下用10U RNase H（新英格兰生物实验室，M0297S）处理8小时，然后加载到斑点印迹上，并转移到N+膜上（德国杜伦市马切里·纳格尔）。在1200μJ的紫外线交联后，将膜封闭在5%牛奶/PBS吐温（0.05%吐温20）中，并与S9.6（1:1000）或ssDNA（Novus，FL，USA）抗体孵育过夜。最后一次清洗后，将膜与二级抗体（山羊抗鼠辣根过氧化物酶）在RT下孵育1小时。用PBS-Tween（0.05%Tween 20）洗涤三次10分钟后，将膜短暂干燥，并与Super-Signal West Femto化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）孵育2分钟。通过将膜暴露于ImageQuant™LAS 4000（美国伊利诺伊州GE Healthcare）检测化学发光信号。

实验

重组GST、GST-THOC6 WT和GST-THOC6突变体与纯化的THOC5、50 pmol的R-loop或ssDNA在4°C下孵育2 h。洗涤后，通过THOC5、R-loop（S9.6抗体）或生物素特异性免疫印迹分析输入和结合组分。

链霉亲和素下拉试验

生物素化R-loop或ssDNA与纯化的FLAG-THOC5、THOC6 WT或THOC6 RK-mutant在4°C下培养16小时或在37°C下培育2小时。通过FLAG M2、R-环（S9.6抗体）或生物素特异性免疫印迹分析输入和结合组分。

DNA-RNA免疫沉淀（DRIP）

如前所述执行DRIP。⁵⁶简单地说，用冰镇PBS清洗细胞（1×107），并将其重新悬浮在1.6 mL TE缓冲液中。然后，添加50μL 20%（w/v）SDS和5μL 20 mg/mL蛋白酶K，并在37°C下进一步培养12 h。将DNA裂解液直接倒入Maxtract锁相凝胶管（Qiagen）中，并添加1 vol（1.6 mL）苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。用NaAc沉淀DNA。将DNA颗粒风干并在TE缓冲液中静置。在37°C下使用限制性内切酶混合物（BsrGI、EcoRI、HindIII、SspI和XbaI）消化提取的基因组DNA过夜。然后使用酚-氯仿沉淀法分离消化的DNA。8μg提取的DNA在DRIP结合缓冲液（10 mM磷酸钠，pH 7，140 mM氯化钠和0.05%（v/v）Triton X-100）中稀释。将20微克S9.6抗体添加到稀释的DNA中，并在4°C下进一步培养14-17小时。然后添加蛋白质G PLUS琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology Inc.），并在4°C下培养2 h。使用NucleoSpin Extract II（Macherey-Nagel）分离沉淀。

螺旋酶解旋分析

在MOPS缓冲液（25 mM MOPS（吗啉丙基磺酸）、pH 7.0、60 mM KCl、0.2%吐温20、2 mM DTT、5 mM ATP、5 mM-MgCl）中进行展开分析₂). 将DDX5或DDX17和标记的DNA-RNA双链体（100 nM）底物在37°C的MOPS缓冲液中培养60分钟，然后在37℃的五分之一体积的停止缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 7.5和2 mg/mL蛋白酶K）中脱蛋白30分钟。用生物素抗体免疫印迹法证实R环的拆分。

R环免疫荧光（IF）

细胞在冰镇甲醇中固定10分钟，然后在染色缓冲液（含0.1%BSA的TBST）中培养10分钟。酶处理在37°C下，在含有1:100稀释的RNAse H（NEB）和ShortCut RNAse III的RNAseH缓冲液中进行4小时。随后用染色缓冲液孵育10分钟，摇晃，清洗样品。对于初级免疫标记，样品在含有1:200倍鼠S9.6抗体（Kerafast）稀释液的染色缓冲液中，在RT下摇晃培养2h。然后用染色缓冲液清洗样品一次，用1:200稀释的二级抗鼠TRITC结合物（Sigma）培养，并用DAPI进行复染。使用尼康NIS元件D 3.0软件对荧光进行定量。仅量化病灶和核S9.6信号强度。

R-loop联合免疫沉淀（co-IP）

根据制造商的说明，使用Covaris AFA™（Adaptive Focused Acoustics，Woburn，MA，USA）技术对含有1x蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的RIPA缓冲液中的核提取物进行超声处理。离心（4°C下13000 rpm，10 min）后，使用预先涂有S9.6抗体或对照IgG的蛋白G琼脂糖-PLUS（美国德克萨斯州圣克鲁斯生物技术公司）对提取物进行免疫沉淀。在4°C下旋转4小时后，在RIPA缓冲液中清洗珠子三次。使用免疫印迹法观察沉淀的R-环或结合的蛋白质。对于S9.6点杂交，在随后的R-loop纯化之前，用蛋白酶K处理输入、IgG和S9.6 IP的等分样品。

邻近连接分析（PLA）

用FLAG标记的THOC5、THOC6和空载体转染HeLa细胞两天。细胞在4%PFA中固定15分钟，然后用0.2%Triton X-100渗透5分钟。样品在37°C下封闭在邻近连接试验的封闭缓冲液中1h。封闭后，将样品与S9.6和FLAG抗体（兔，Sigma）（抗体稀释缓冲液中1:200稀释）在37°C下培养2h。用洗涤缓冲液A洗涤2次后，将样品与预先混合的Duolink PLA正负探针在37°C下孵育1小时。根据制造商的说明，使用Duolink®PLA荧光试剂盒（Sigma）执行近端结扎分析的后续步骤。

作者贡献

D.D.H.T.和T.T.构思了这项研究。M.P.、A.B.A.、S.B.d.L、A.P.和B.G.进行了实验。M.P.、D.D.H.T.、O.E.B.、A.P.和L.W.分析了数据。D.D.H.T.、A.P.、A.H.和A.D.W.提供试剂，并根据所有作者的意见起草手稿。