iScience。2023年1月20日；26(1): 105741.
合成人体3D体外淋巴模型增强B细胞存活和功能分化
,1 ,1 ,1 ,2 ,1,∗和1,三，∗∗
Maaike V.J.布拉姆
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
Rob S.van Binnendijk先生
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
安妮·玛丽·布伊斯曼
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
雷娜·梅比乌斯
2荷兰阿姆斯特丹Vrije Universiteit阿姆斯特丹大学医学中心阿姆斯特丹感染与免疫研究所分子细胞生物学和免疫学系
杰尔·德维特
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
Cécile A.C.M.van Els公司
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
1荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心
2荷兰阿姆斯特丹Vrije Universiteit阿姆斯特丹大学医学中心阿姆斯特丹感染与免疫研究所分子细胞生物学和免疫学系
三引线触点
2022年1月5日收到；2022年10月18日修订；2022年12月1日验收。
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- 补充资料
文件S1。图S1-S4和表S1
GUID:7E8DD3BB-A468-4406-A4B6-B2CDE9BB5E34
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总结
使用体外培养体系、关键因素和GC反应的相互作用需要准确模拟。本研究旨在改进体外使用3D培养技术的GC模拟。将人B细胞并入PEG-4MAL水凝胶中，以创建合成的细胞外基质，并由CD40L细胞、人扁桃体衍生淋巴基质细胞和细胞因子支持。CD19的分化和抗体产生+B细胞最好在5.0%-PEG-4MAL，2.0 mM-RGD肽组成中得到支持。3D培养显著增加血浆消融剂和血浆细胞数量以及抗体生成，与2D培养相比，B细胞死亡更少。初始CD19的类切换+免疫球蛋白D+B细胞朝向IgG+和IgA+观察到B细胞。大B细胞簇的形成表明了类GC结构的形成。总之，提出了一种特征明确且可控的基于水凝胶的人类3D淋巴模型，该模型支持增强B细胞存活、增殖、分化和抗体生成。
主题领域：生物科学、生物工程、细胞工程、组织工程
介绍
在免疫应答过程中，通过将其免疫球蛋白（Ig）B细胞受体（BCR）与遇到的抗原连接，原始B细胞被激活。激活后，次级淋巴组织会形成称为生发中心（GC）的特殊微环境。1在这些GC中，激活的B细胞与相邻的细胞类型复杂地相互作用，开始B细胞反应。这种B细胞反应包括增殖、分化和体细胞超突变，这是一个编辑BCR抗原结合区的过程，然后根据BCR亲和力选择B细胞，生成高亲和力抗体。2这些B细胞过程所需的支持GC细胞类型的示例是淋巴基质细胞（LSC）和T滤泡辅助细胞。T细胞与B细胞的相互作用也会引发类开关重组，这是一个将BCR的恒定区域替换为另一个同型的过程，从而产生具有特殊效应功能的抗体。2,三最终，GC B细胞以记忆B细胞或长寿浆细胞的形式退出GC。2,4在二次免疫应答期间，抗原重新计数后，GC内的记忆B细胞被重新激活，进行进一步的BCR编辑和分化，形成下一代记忆B细胞和浆细胞，作为后代，具有更好的BCR亲和力和功能。
GC具有细胞和非细胞成分，包含细胞外基质（ECM）蛋白质，如胶原蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白和玻璃体凝集素。5,6这些蛋白质对于基质网络的形成至关重要，B细胞和T细胞可以沿着基质网络迁移并相互作用。5ECM成分也在趋化因子的结合中发挥作用，形成梯度，引导B细胞和T细胞的迁移。7然而，大多数调控GC反应结果的因素仍不清楚。为了研究GC中发生的复杂细胞-细胞和细胞-基质相互作用，需要一个能够模拟这些过程的模型。
在过去的几十年中，已经使用2D进行了B细胞和GC反应的研究体外文化模型和3D体内动物模型。8,9,10,11,12小鼠等动物模型提供了在复杂的3D环境中研究B细胞的可能性；然而，将这些结果翻译给人类可能是一项挑战。13当前2D体外培养以研究B细胞体外基于用表达CD40L的细胞和各种细胞因子刺激B细胞。这些方法也有自己的挑战，在概括GC反应的复杂性方面面临局限。自然微环境通过细胞粘附到ECM向驻留的B细胞提供信号。14这些细胞-基质相互作用以及细胞-细胞相互作用对分化、增殖和细胞功能都很重要体内.15这也解释了为什么一些原发性（恶性）B细胞类型很难使用这些传统的2D系统进行培养，例如浆细胞、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病，因为它们依赖这些相互作用来生存和生长。16,17,18更好的代表性模型可以帮助研究感染或接种疫苗后记忆B细胞反应中与年龄和疫苗相关的差异，研究扩展能力、抗体产量、亲和力和功能，以及这些反应的各自刺激或T细胞依赖性。
研究GC的另一种方法是使用类器官或3D培养方法，为在人工3D环境中研究B细胞提供了可能性。3D培养模型可以使用3D水凝胶模拟周围的ECM和组织层次。19这为更准确地研究器官行为提供了可能性，模拟了相关的细胞基质以及细胞与细胞的相互作用，进一步弥合了2D细胞培养和体内过程。20
3D水凝胶及其在类有机物或3D中的应用体外模型已经被广泛研究。可以使用天然水凝胶，模仿天然ECM。21然而，天然水凝胶通常是动物源性的，面临着批次间的变化。合成水凝胶是为了克服这些问题，使惰性聚合物具有生物功能。22,23作为有机物中广泛使用的Matrigel的合成替代物，PEG凝胶被开发出来，其功能化具有最小的粘附线索。22,23,24,25,26已经研究了各种PEG制剂在3D中的应用体外GC小鼠模型，功能化PEG-4MAL支持小鼠B细胞扩增和生发中心样诱导。27
三维体外GC小鼠模型在B细胞生长、存活和抗体类别转换方面已超过经典2D培养。28,29,30为了更好地翻译体外研究结果在研究人类过程和疾病时，最好使用人类模型。最近，通过在单细胞悬浮液中培养人类扁桃体组织，开发了包括人类B细胞和基质细胞部分的模型。31然而，尽管扁桃体组织对GC反应最具代表性，但并不容易获得，而外周血单个核细胞（PBMC）则可以。人类PBMC衍生的B细胞和T细胞最近在一个细胞器芯片模型中进行了研究，该模型显示了生发中心的许多特征。32在本研究中，动物衍生水凝胶用作3D基质。这些基质成分复杂多变，33并可能引发不希望的免疫反应。22,34
本研究的目的是开发一个可访问的人类3D淋巴模型，作为对当前人类2D的改进体外系统，可作为一个平台，在模拟GC的环境中研究B细胞。开发的模型是基于我们小组在多发性骨髓瘤细胞培养的3D骨髓生态位模型中获得的经验。35,36,37,38根据细胞成分（LSC，39模拟T细胞共同刺激的CD40L细胞（CD40LCs），以及大块B细胞与原始或活化的B细胞）、细胞因子补充和3D水凝胶组成。添加的细胞因子是由目前未包括在模型中的GC细胞类型自然产生的；T滤泡辅助细胞（IL2、IL4、IL6、IL10和IL21）、滤泡树突状细胞（IL15）和髓样细胞如巨噬细胞（IFN-α、APRIL），并在B细胞的增殖、GC的形成和维持以及抗体反应中发挥作用。8,9,40,41作为3D水凝胶，使用了在每个末端带有马来酰亚胺基团的四臂聚乙二醇大分子单体（PEG-4MAL）。23,25,26,27该PEG-4MAL系统可以根据硬度进行定制，并使用ECM-模拟肽进行功能化。使用健康成人的人PBMC衍生的B细胞建立了这种人类3D淋巴模型。所开发的人类3D淋巴模型在支持B细胞和模拟GC环境方面超过了2D方法，使用了可访问的细胞类型和可调节的、特性良好的材料。
结果
二维B细胞培养优化
我们的第一个目标是确定一种最能支持培养的B细胞存活、增殖、分化和抗体生成的2D培养条件。2D培养物在培养基添加剂和支持细胞方面进行了优化。比较的培养方法旨在通过类toll受体（TLR）激活（模拟抗原激活）和/或CD40激活（模拟T细胞帮助）和添加细胞因子来模拟GC反应中发生的B细胞的激活和分化().
表1
| 时间点 | CK1型 | CK2型 | CK3（CK3） |
|---|
| 第0-4天 | CPG ODN、IL2、IL10、IL15 | CPG ODN、IL2、IL4、IL10、IL15、IL21 | IL4、IL21 |
| 第4-7天 | IL2、IL6、IL10、IL15 | IL2、IL4、IL6、IL10、IL15、IL21 | IL4、IL21 |
| 第7-11天 | IL6、IL15、干扰素α | IL4、IL6、IL15、IFNα、IL21 | IL4、IL21 |
| 第11-14天 | IL6，4月 | 4月IL4、IL6、IL21 | IL4、IL21 |
首先，人类PBMC-derived CD19+B细胞与辐射后表达人CD40L（CD40LCs，A） ，作为常用的2D体外系统。42,43潜在的培养方法基于先前描述的2D B细胞培养系统。8,9,42Jourdan等人。旨在使用CPG ODN、IL2、IL10、IL15、IL6、IFN-α和APRIL（CK1）和Marsman等人。代表T2B财团，43使用IL4和IL21（CK3）优化T细胞依赖性激活B细胞的协议。这两个B细胞培养系统结合在CK2中()，并通过查看结果数量进行比较(B） 培养CD19的分化状态+B细胞随时间变化。分析了六种不同的B细胞亚型，即原始B细胞（CD19+CD20型+CD27型−CD38细胞−CD138型-)，过渡型B细胞（CD19+CD20型+CD27型−CD38型+CD138型-)生发中心B细胞（CD19+CD20型+CD27型+CD38型+CD138型-)，记忆B细胞（CD19+CD20型+第27页+CD38型−CD138型-)，血浆消融术（CD19+CD20型−CD27型+CD38型+CD138型-)和浆细胞（CD19+CD20型−CD27型+CD38型+CD138型+) (C） ●●●●。输入单元格主要包含原始CD27−B细胞类型（69.17%±12.72%原始B细胞和过渡B细胞）以及CD27+记忆B细胞和生发中心B细胞（30.49%±12.59%，图S1). 生殖中心B细胞CD38表达较低，但仍表达CD20，这是一种尚未向血浆消融剂转化的生后中心表型。44所产生抗体的浓度和同种型通过多重免疫分析测定。
测试了三种不同的细胞因子混合物随时间支持不同B细胞亚群的潜力体外
CD19编号+B电池（n=3，另见图S1)在细胞因子混合物1（CK1）、细胞因子混合物2（CK2）或细胞因子混合物3（CK3）中与CD40L细胞（CD40LCs）在2D共同培养().
（A） 所研究的2D共培养条件的示意图概述。
（B） 存活CD19的绝对数量+B细胞随时间变化。
（C） 六个B细胞亚群的选通策略。
（D） 每个培养孔内细胞绝对数量的B细胞亚群（总细胞数）以及六个B细胞亚组中第7天和第14天的（E）相对频率。
（F） 第7天和第14天培养上清液中产生IgX（IgM、IgG和IgA）。
（G） 总产生的IgX归一化为培养物中随时间推移出现的抗体生成细胞（血浆消融剂和浆细胞）的总量。
（H） 第7天和第14天培养上清液中产生IgX（IgA、IgM和IgG）的相对频率。
（B，D-H）所有数据比较使用CK1、CK2或CK3培养的B细胞，显示平均值（n=3）。误差线表示SD。*=p>0.05，*=p>0.01，**=p>0.001。
在所有三种介质成分（CK1-3、，)，细胞在培养14天内存活，并分化为成熟的血浆消融剂和血浆细胞表型(D） ●●●●。与CK2和CK3相比，CK1支持更广泛的B细胞增殖。CK1增殖分布不均匀，但主要发生在培养前7天的原始B细胞群和培养后7天的过渡B细胞群中(D和1E）。
第7天CK1中细胞数量的显著增加并未导致累积抗体生成的增加。在第14天，与CK3相比，CK1和CK2中测得的总IgX抗体生成量（IgA、IgG和IgM的总和）显著增加(F） ●●●●。在每种情况下，当将这种抗体生成量标准化为抗体生成细胞（血浆消融剂和血浆细胞）时，CK2的抗体生成量明显较高(G） ●●●●。从IgA、IgG和IgM的相对频率来看，与CK2和CK3相比，CK1的IgM频率更高，后两种抗体的三种同型分布更均匀(H） ●●●●。
总之，CK1在细胞增殖方面优于CK2和CK3；然而，B细胞的增加可能主要归因于未激活、非抗体产生的B细胞亚型。随着时间的推移，CK2和CK3导致B细胞亚型的相对频率更稳定，其中CK2具有最高的抗体产生细胞的相对频率，以及标准化的抗体产生。因此，对于所有后续实验，从三个实验中选择CK2。
接下来，对支持细胞的使用进行了优化。人PBMC-derived CD19+B细胞与辐射后表达人CD40L（CD40LCs）的小鼠成纤维细胞L细胞共同培养，作为金标准。测试的替代方法是人类扁桃体衍生基质细胞（LSCs）和CD40LC和LSCs的组合(A） ●●●●。培养CD19的数量和分化状态+随时间推移评估B细胞亚群(B和2C）。荧光显微镜证实，支持细胞在所有时间点都存在，为每种条件下培养的B细胞提供了不同的支持环境(D） ●●●●。CD40LC支持B细胞存活、增殖、分化和抗体生成14天。与CD40LC相比，LSC在第4天的B细胞数量显著增加(E） ●●●●。在第4天，抗体水平显著升高(F） ●●●●。这些较高的抗体水平在第7天仍然存在；然而，B细胞的数量没有进一步增加，而CD40LC培养的B细胞在第7天的数量确实增加。在培养14天期间，LSC不能支持存活、增殖和分化的B细胞，在第11天和第14天B细胞数量迅速下降。CD19的三重培养+B细胞、CD40LC和LSC从第7天起显著增加B细胞数量，随后抗体生成也增加(E和2F）。因此CD19的文化+以CD40LC和LSC支持的B细胞为最佳培养条件。
CD40L细胞（CDLCs）、淋巴基质细胞（LSCs）或CD40LCs+LSCs与CD19共同培养+CK2中的B细胞()并测试其长期支持不同B细胞亚群的潜力体外（二维）
（A） 所研究的2D共培养条件的示意图概述。
（B） 存活CD19的绝对数量+B细胞随时间变化。
（C） 其中一名分析供体的流式细胞术结果，说明了第14天共同培养的B细胞上受试支持细胞组合之间的差异。
（D） 共同培养中添加的支持细胞类型的荧光图像（蓝色=DAPI，红色=指骨苷，比例尺代表200μm）。
（E） 6个B细胞亚群中第4天、第7天、第11天和第14天的细胞绝对数的每个培养孔内的B细胞亚组（细胞总数）。
（F） 在第4、7、11和14天培养上清液中产生IgX（IgM、IgG和IgA）。
（E和F）显示平均值±SD的数据（n=3）。*=p>0.05，**=p>0.01，**=p>0.001，***=p>0.0001。
三维B细胞培养优化
优化CD19的2D培养基后+B细胞，建立3D培养。六种水凝胶条件（PEG1-PEG6，)研究了它们对CD40LC和LSCs共同培养的CD19的影响+B细胞。水凝胶的聚合物含量（4.0%（w/v）和5.0%（w/v）PEG-4MAL）和肽组成（2.0mM RGD、1.0mM RGD和1.0mM REDV或2.0mM REDV）不同，模拟纤连蛋白（RGD）中的最小整合素结合基序，45和/或由整合素α4β1或VLA-4（REDV）识别的纤维连接蛋白中的基序。RGD肽促进整合素刺激的细胞在3D环境中的粘附和扩散，46REDV通过VLA-4促进BCR介导的B细胞与纤维连接蛋白的粘附。47
表2
| 水凝胶名称 | PEG-4MAL浓度 | RGD浓度 | REDV浓度 | GPQ-W浓度 |
|---|
| 水凝胶1（PEG1） | 4.0%（w/v） | 2.0毫米 | – | 4.9米 |
| 水凝胶2（PEG2） | 5.0%（w/v） | 2.0毫米 | – | 6.6米 |
| 水凝胶3（PEG3） | 4.0%（w/v） | 1.0毫米 | 1.0米 | 4.9米 |
| 水凝胶4（PEG4） | 5.0%（w/v） | 1.0毫米 | 1.0米 | 6.6米 |
| 水凝胶5（PEG5） | 4.0%（w/v） | – | 2.0毫摩尔 | 4.9米 |
| 水凝胶6（PEG6） | 5.0%（w/v） | – | 2.0毫米 | 6.6米 |
与含有RGD或RGD和REDV的组合的PEG1-PEG4相比，仅含有REDV肽的PEG5和PEG6随着时间的推移形成了不太稳定的凝胶。PEG5和PEG6中的整体细胞活力（包括LSC活力）降低(图S2A-S2C）。PEG1-PEG4形成了一种稳定的水凝胶，随着时间的推移不会影响细胞活力(图S2A-S2G）。进一步选择这四种水凝胶条件来分析其作为3D B细胞环境的潜力(A） ●●●●。其中，与4%（w/v）PEG-4MAL凝胶相比，5%（w/v）PEG-4-MAL凝胶显示出更高的压缩模量趋势(图S2D） ●●●●。与这些结果一致，5%（w/v）PEG-4MAL凝胶在水凝胶制造后的第一个小时和第二天显示出溶胀比的急剧增加较小，与4%（w/v）PEG-4-MAL凝胶相比，水凝胶降解较少，这表现为较高的稳定溶胀比(图S2F和S2G）。
优化用作3D矩阵的功能化水凝胶体外B细胞共培养（另见图S2)
CD19+B细胞（n=3）、CD40LC和LSC被纳入不同的水凝胶成分（3D、，)并在CK2中培养().
（A） 所研究的3D共培养条件的示意图概述。
（B） 存活CD19的绝对数量+B细胞随时间变化。
（C） 6个B细胞亚群中第4天、第7天、第11天和第14天每孔绝对细胞数的每个3D培养中的B细胞亚组（总细胞数）。
（D） 第7天和第14天培养上清液中产生IgX（IgM、IgG和IgA）。
（B-D）显示平均值±SD的数据（n=3）。**=p>0.01。
（E） 所选PEG2 5.0%（w/v）PEG-4MAL和2.0 mM RGD功能化水凝胶的示意图，使用GPQ-w交联肽交联时形成稳定的3D水凝胶。CD19编号+B细胞、CD40LC以及LSC在交联后均匀分布在整个水凝胶中。
（F） 40μL交联PEG2（5.0%（w/v）PEG-4MAL和2.0 mM RGD）3D共培养的Brightfield图像，比例尺代表1000μm。
（G） PEG2 3D共培养的荧光图像，说明了细胞追踪和染色的可能性。蓝色+绿色+红色单元格为CD19+B细胞，蓝色+黄色+红色细胞为CD40LC，蓝色+红色细胞是LSC（蓝色=DAPI，绿色=CD19免疫染色，黄色=DiI标记，红色=指骨样蛋白，标尺代表150μm）。
当比较B细胞存活、增殖和分化时，所分析的四种稳定水凝胶之间没有发现显著差异(B和3C）。然而，趋势是明显的，PEG2中存在更多存活的B细胞，伴随着更高的抗体水平。在第14天将PEG2与PEG3和PEG4进行比较时，发现这种差异非常显著(D） ●●●●。在14天的培养过程中，PEG2中的细胞包裹并未导致水凝胶降解增强(图S2E） ●●●●。因此，选择PEG2水凝胶，得到含有5.0%（w/v）PEG-4MAL和2.0mM RGD的优化3D培养物，如图所示E.其次是培养细胞类型的流式细胞仪分析，以及亮场显微镜(F） 和荧光显微镜可以在生成的3D培养物上识别组织工程环境中的各种细胞类型(G） ●●●●。
CD19的3D培养+B细胞诱导B细胞和抗体生成显著增加
使用所有优化的培养条件，比较2D和3D培养物(A、，表S1). 添加PEG2 3D矩阵不会导致特定B细胞亚群或同型的优先生长，如ViSNE图中的可比较聚类所示(B） ●●●●。3D培养条件确实导致B细胞在第7天和第14天显著增加，第4天和第11天的趋势相似，比较了每个时间点的细胞绝对数量(C） ●●●●。3D培养物中的抗体产量增加，与B细胞数量的增加一致(D和4E）。在每种情况下，当将这种抗体生成量标准化为抗体生成细胞（血浆消融剂和血浆细胞）时，3D培养物在第11天的抗体生成量明显较高。在其他时间点没有观察到这种差异(F） ●●●●。B细胞的2D培养确实导致细胞死亡增加（大的7AAD阳性细胞簇），而3D培养的B细胞中没有这种现象(G和4H）。在这两种情况下，血浆消融剂和浆细胞出现在IgM、IgG和IgA簇中，最大的抗体生成细胞簇不再表达膜结合免疫球蛋白(G） ●●●●。三维培养条件并没有导致特定B细胞亚群或同型的优先生长，ViSNE图中的可比较聚类和一致的表面标记表达说明了这一点(G和4H）。
CD19二维与三维共培养的比较+B细胞
CD19+B细胞（n=3）培养在CD40LC和LSC（2D）之上，或与CD40LC及LSC合并在CK2的PEG2（3D）中（另见表S1).
（A） 所研究的2D与3D共培养条件的示意图概述。
（B） 第14天连接（n=3）2D和3D数据的viSNE点图显示B细胞的重叠聚集。
（C） 6个B细胞亚群中第4、7、11和14天每个孔的绝对细胞数的每个2D或3D培养中的B细胞亚组（总细胞数）。
（D） 第7天和第14天培养上清液中IgX（IgM、IgG和IgA）的产生（上图），以及第7天到第14天膜结合免疫球蛋白（IgD、IgM，IgG，和IgB）的表达（下图）。
（E） 存活CD19的绝对数量+B细胞随时间变化。
（F） 总产生的IgX归一化为培养物中随时间推移出现的抗体生成细胞（血浆消融剂和浆细胞）的总量。
（G和H）viSNE图显示2D和3D培养的B细胞在第14天的表面标记（CD19、CD20、CD27、CD38、CD138）、膜结合免疫球蛋白（IgD、IgM、IgA、IgG）的表达，以及存活和增殖（7AAD和细胞迹蓝），蓝色表示低表达，黄色表示中间表达，红色表示高表达。
（C-F）显示平均值±SD的数据（n=3）。*=p>0.05，**=p>0.01，***=p>0.001。
三维模型中培养的B细胞的增殖、类别转换和形态特征
为了研究B细胞的增殖，所有CD19+使用细胞追踪蓝追踪B细胞随时间的变化。第7天，阳性细胞数量急剧下降，大部分CD19+B细胞为细胞示踪剂阴性。第14天，所有存活CD19+B细胞的细胞痕迹蓝为阴性，表明所有CD19的增殖+B细胞，随着时间的推移，导致细胞痕迹蓝消失(A） ●●●●。
三维模型中B细胞的增殖和类别转换
CD19编号+B细胞（n=3）进一步分选为CD19+免疫球蛋白D+和CD19+免疫球蛋白D−B电池（另请参见图S3和S4系列).
将所有三种B细胞条件与CD40LC和LSC合并在PEG2（3D）中，并在CK2培养基混合物中培养().
（A） 三维培养CD19细胞的蓝细胞增殖染色+第0天、第7天和第14天的B细胞。（B） CD19的培养动力学+散装，CD19+免疫球蛋白D+或CD19+免疫球蛋白D−随时间推移分类的B细胞，显示第0天、第7天和第14天B细胞亚群的B细胞亚组（总细胞计数）（另请参见图S4). （C） 在第0天、第7天和第14天，每孔B细胞绝对数量的膜结合免疫球蛋白（IgD、IgM、IgG和IgA）的表达。（D） 在第4天、第7天和第14天培养上清液中产生IgM、IgG和IgA。显示平均值±SD（n=3）的数据。**=p>0.01。
为了研究3D模型中培养的B细胞的潜在类别转换，将B细胞分类为一个原始群体（CD19+免疫球蛋白D+)和成熟人群（CD19+免疫球蛋白D−,图S3)并与未分类的CD19进行比较+B细胞。三种比较条件下的B细胞随时间的推移数量相等。在CD19中+免疫球蛋白D+培养，与CD19相比，血浆消融剂和血浆细胞随着时间的推移而减少+免疫球蛋白D−培养基中，与未分类的CD19相比，随着时间的推移，有更多的血浆消融剂和血浆细胞生成+B细胞(B） ●●●●。当使用流式细胞术分析B细胞同种型时，未分类的CD19+B细胞培养显示，随着时间的推移，IgD和IgM数量减少，IgG和IgA数量增加。天真的CD19+免疫球蛋白D+B细胞也显示出IgD数量减少，随着时间的推移，IgM数量更大、更稳定，IgG和IgA数量增加(C） ●●●●。由于在第0天的条件下没有成熟的IgG和IgA细胞，在培养的前4天内没有产生IgG或IgA(D） ，这种增加可归因于幼稚CD19的类别转换+免疫球蛋白D+B细胞。
培养的成熟CD19+免疫球蛋白D−随着时间的推移，B细胞显示出稳定的IgA群。然而，与未分类的CD19相比，IgG种群随着时间的推移而减少+并对CD19进行排序+免疫球蛋白D+B细胞培养(C） ●●●●。在CD19中+免疫球蛋白D−分类培养基，CD27较高+CD38型+CD138型+人群，即IgD−免疫球蛋白M-免疫球蛋白A-免疫球蛋白G-，在第14天被发现。CD19中的人口减少+免疫球蛋白D+排序的区域性(图S4). IgG的丢失+因此，B细胞可归因于IgG的成熟+B细胞趋CD27+CD38型+CD138型+B细胞，失去其膜结合免疫球蛋白。CD19上清液中的IgG生成量显著增加，支持了这一点+免疫球蛋白D−在第14天对培养物进行分类(D） ●●●●。
3D B细胞共培养的显微镜显示，形成了更大的类GC B细胞簇，平均直径为482μm±223μm，明显大于2D B细胞共培育形成的细胞簇（91μm±39μm）(). B细胞簇可以从形态上区分为圆形细胞和伸展的粘附基质，也可以通过免疫细胞化学染色来区分CD19的表达。所有3D B细胞的生长都显示出与周围基质细胞室的复杂联系().
2D和3D CD19的荧光成像+B细胞共培养
（A） 2D和（B和C）3D共培养的荧光图像。蓝色=DAPI，绿色=CD19免疫染色，红色=卵磷脂。比例尺代表150μm（A和B）或200μm（C）。
讨论
在本研究中，开发并优化了基于合成聚合物的人类3D淋巴模型，用于培养人类B细胞。开发的模型超过了2D人类B细胞培养系统，使用3D培养技术更好地再现了GC反应的组织复杂性。添加的特性良好的水凝胶类似GC的组织层次和自然周围ECM。这更准确地模拟了相关的细胞-细胞以及细胞-基质相互作用，进一步弥合了2D细胞培养和体内GC过程。增强了3D环境的添加体外与2D共培养相比，B细胞存活、增殖、分化和抗体生成。这一更具代表性的模型可用于研究人类记忆B细胞在衰老、感染或接种疫苗后的反应，或评估B细胞功能的特征或健康和疾病中的异常。
PBMC分离人B细胞的研究体外培养物是免疫表型、功能和储备研究的宝贵资源。通过培养B细胞体外随着时间的推移，细胞生存面临新的挑战体内发生的过程，如复杂的GC反应。激活的B细胞的增殖和存活需要通过CD40L和IL4刺激模拟T细胞相互作用来持续刺激受体。48成熟浆细胞在培养时会迅速死亡体外没有支持性基质环境。49通过补充细胞因子并与基质细胞共培养（作为辐照CD40L表达细胞源或作为功能性人类LSC），可以模拟自然细胞B细胞环境。然而，添加这些因素仍然没有考虑到自然ECM和3D环境的影响。ECM蛋白已被证明在GC B细胞反应和抗原特异性抗体产生中至关重要。50对于许多信号分子来说，与ECM组件结合的能力对其功能至关重要。B细胞迁移和淋巴组织结构的关键调节因子CXCL13在由纤维母细胞网状细胞（FRCs）分泌后与ECM结合。这种结合和固定限制了其扩散，形成3D浓度梯度。7只有在3D文化模型中，才能在能够支持这种结构组织的环境中研究GC功能。
开发功能性3D人体体外淋巴模型，我们验证了其相对于传统金标准2D模型的附加值。以先前开发的2D B细胞培养系统为基础，通过补充细胞因子的变化进行比较8,9,42,51和支持细胞源。骨髓和LSC在健康和发病机制中对B细胞存活的支持作用已在前面描述过。49,52然而，当人类扁桃体LSCs与CD40LC共同培养时，与使用CD40LC或LSCs作为支持细胞的单一B细胞共同培养相比，B细胞的存活、增殖和分化得到了明显更好的支持，这清楚地表明了淋巴组织样包埋的好处。与仅含有LSC或CD40LC的B细胞共培养相比，含有CD40LC和LSC的B细胞联合培养上清液含有较高水平的APRIL、BAFF和IL-10（数据未显示）。未来的研究将集中于产生的细胞因子的动力学，以及作为潜在产生者的多种共培养细胞类型之间的区别。
理想情况下，模拟这种ECM的水凝胶不仅反映淋巴组织的三维空间结构，而且还反映ECM的生物组成。Matrigel是一种天然的基于ECM的水凝胶，已用于先前的多发性骨髓瘤细胞培养的3D骨髓生态位模型中，35,36,37,38人类淋巴滤泡细胞芯片模型，32也被广泛用于生成类有机物。53,54,55然而，作为Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞产生的天然产物，该基质没有明确定义，并且存在批次间的差异。33,56组织工程应用中使用的其他天然ECM模拟物，如胶原蛋白、透明质酸和硫酸软骨素水凝胶，主要来自牛或猪，21,57因此面临着批次间的变化。此外，内毒素的存在可能会引发不希望发生的免疫反应。34在我们的免疫学应用中，需要一种不必要免疫反应风险低的水凝胶。因此，作为替代方案，我们使用了定义明确的非动物源性基质，以及合成PEG聚合物主链，该主链可以用所选生物成分进行功能化。22,24,26具有不同末端基团的PEG聚合物此前已针对其与小鼠B细胞的培养进行了优化，27显示了使用PEG-4MAL的最佳结果，随后用于3D小鼠免疫组织的形成，用于GC B细胞的研究。27,30在我们的研究中，探索了合成PEG-4MAL水凝胶在不同聚合物浓度和肽组成下对人类而非小鼠B细胞培养物的影响。添加REDV，通过VLA-4促进BCR介导的B细胞与纤维连接蛋白的粘附，47仅次于RGD并没有提高B细胞存活率和抗体生成。RGD肽（PEG2）的增加支持了更普遍的整合素刺激的人类基质细胞在3D环境中的粘附和扩散，46被证明能更有效地提高B细胞存活率。更僵硬的(图S2D） 5.0%（w/v）PEG-4MAL和2.0 mM RGD功能化水凝胶（PEG2）最能支持B细胞存活和抗体生成，因此其聚合物含量高于所述的4.0%（w/v）PEG-4MAL及2.0 mM RGD水凝胶，26但7.5%（w/v）PEG-4MAL凝胶用于小鼠3D B细胞模型时聚合物含量较低，29,30强调需要针对每个预期应用优化ECM-模拟水凝胶。
当比较3D优化培养系统和2D培养系统时，发现添加生物活性3D基质后，培养14天后B细胞显著增加，抗体生成增加。这些增强的过程相互关联，因为抗体生成的增加可能是B细胞增殖增加导致更多抗体分泌细胞的结果，也可能是分化改变和每个细胞抗体分泌增加的结果。3D培养物中成熟B细胞数量的增加可能是由于3D中存在细胞-基质相互作用，或是由于添加了缺氧3D环境，58研究表明，缺氧条件能提高人浆细胞的存活率体外.59最有可能的是，这是一个过程的组合，需要进一步调查才能解开。
重要的是，我们的人类3D B细胞模型支持B细胞分化的主要过程，即类别转换为IgG和IgA等型，以及记忆B细胞分化为IgM、IgG或IgA分泌细胞。值得注意的是，在研究CD19的类转换时+免疫球蛋白D−3D模型中的分选细胞，随着时间的推移，观察到表达表面IgG而非表面IgA的B细胞丢失。结合这些培养物中增强的IgG生成，这表明当前的3D模型和细胞因子条件促进了IgG记忆B细胞向产生IgG的血浆消融剂或血浆细胞的快速分化。表达IgG的B细胞仍存在于总CD19中+B细胞培养，可以通过同时将幼稚B细胞转换为IgG来解释+在CD19中观察到的B细胞+免疫球蛋白D+排序的文化。在未来的研究中，人类3D B细胞模型可能有助于进一步解开驱动等型特异性类别转换和浆细胞分化的因素和细胞相互作用。以前，类开关重组被认为是在体细胞超突变发生后GC反应期间发生的过程，因此是功能性GC反应的指示物。60最近，重新研究了类开关重组的时间，因为它发生在GC形成之前。三因此，在我们的3D模型中发生的类开关重组应被视为功能性B细胞激活和B-T细胞模拟相互作用的指标，发生在附近的淋巴B细胞区，而不是在GC中。
开发的人体3D体外淋巴模型为在模拟3D淋巴环境中研究B细胞提供了机会。PBMC的使用为研究和比较B细胞在健康和疾病中的功能提供了机会，因为PBMC在临床研究中被广泛收集和储存。对健康和疾病中B细胞功能的研究可能包括病原特异性免疫反应、B细胞介导的自身免疫和B细胞恶性肿瘤。三维模型中成熟B细胞存活率的提高有助于研究自身反应性浆细胞，这在自身免疫疾病的研究中可以发挥重要作用。61同样，无法使用常规2D系统培养的原发性恶性B细胞类型，如慢性淋巴细胞白血病，也可以使用开发的3D淋巴模型进行研究。在此范围内B单元功能的比较体外三维模型体内数据，尤其是B细胞相关疾病的数据，可以进一步说明这个3D模型的相关性。
在3D模型的当前设置中，可用的2D模型作为比较和优化的基础，其中广泛的细胞因子补充对于B细胞的生存和成熟都是必要的。对于三维模型的开发，保持条件相等并进行比较，从而可以建立合成三维矩阵的附加效果。该3D模型甚至可以进一步优化，包括例如人类T细胞，以取代当前表达人类CD40L或滤泡DC的小鼠CD40L细胞源。通过在模型中同时存在初级人类LSC和人类T细胞，这两种细胞都可以通过细胞相互作用和细胞因子的产生促进B细胞的存活和成熟，需要重新评估补充的细胞因子。进一步优化的3D系统可能会作为一个自立系统发挥作用，不再需要补充细胞因子，存在基本细胞类型和相互作用，为培养的B细胞提供关键信号和支持。激活B细胞仍然是必要的，但可能包括通过BCR（最好是通过人类T细胞）对B细胞进行抗原特异性刺激，从而模拟同源T-B相互作用。通过这样做，可以进一步研究抗原特异性抗体的成熟度（例如超突变、亲和力成熟），而不是目前使用的通过TLR激活B细胞的多克隆。未来的计划还可能包括分析已形成的B细胞簇内的趋化因子表达，以及在当前观察到的B细胞生长中可能形成的亮区和暗区。
总之，人类3D体外与传统2D培养技术相比，本研究开发的淋巴模型提高了B细胞的存活、增殖、成熟和类别转换。该模型包含定义明确的3D ECM模拟水凝胶、T细胞模拟CD40LC和人类扁桃体衍生LSC。后者在模型中添加了人类基质室，表达FRC特征的标记。39在培养14天期间，3D模型中大B细胞簇的形成表明了类GC结构的形成，可以通过显微镜观察。开发的3D淋巴模型提供了一个可访问的人类平台，可用于在模拟自然周围微环境的3D环境中研究健康和患病的B细胞。
研究的局限性
人类3D体外淋巴模型提供了在模拟的3D淋巴环境中研究B细胞特征的机会。然而，目前开发的模型仍然是自然淋巴环境的简化版本，仅模拟选定的方面。第一个限制是目前细胞来源的选择，研究从PBMC分离的健康B细胞，而不是淋巴组织。后一种细胞来源更能代表参与自然GC反应的细胞。包括原代淋巴基质细胞（LSC），但来源于异基因。使用自体LSC在技术上更具挑战性，但更可取。第二个限制是，目前使用表达人CD40L的小鼠CD40L细胞源来模拟T细胞的帮助。尽管在纳入模型之前进行了照射，但一个全人类模型，通过自体原代T细胞为所研究的人类B细胞提供必要的T细胞帮助，可以进一步改进该模型。另一个限制是，目前通过人工补充细胞因子来支持B细胞的存活和分化，就像在传统的2D培养物中所做的那样。补充的细胞因子可以通过B细胞与LSC的相互作用控制系统中发生的任何自然细胞因子的产生。一个由所有必要的自体细胞类型组成的自支撑3D模型最适合研究生发中心过程。
STAR★方法
实验模型和主题细节
原代细胞和细胞系
通过Ficoll-Hypaque梯度密度梯度离心法（法玛西亚生物技术公司）从健康成人献血者的浅黄色外套（荷兰阿姆斯特丹Sanquin blood Supply）中分离出PBMC。PBMC在50%RPMI、40%胎牛血清（FCS；Greiner Bio-One）和10%二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich）中冷冻，并在−135°C下保存，直至使用。
人类扁桃体衍生的LSC之前已被分离和鉴定。39人类扁桃体衍生的LSC表达FRC标记物足蛋白（PDPN），但缺乏内皮标记物CD31，因此被归类为FRC。表达人CD40L（CD40LCs）的小鼠成纤维细胞L细胞，由Garrone等人产生。，62,63在培养物中用作CD40结扎的来源。CD40LC在使用前接受γ射线照射（2000 rad/20 Gy）。
所有棕黄色大衣的捐赠都是在获得书面知情同意后获得的，使用的方案都是根据《赫尔辛基宣言》由当地医学伦理委员会批准的。
CD19的隔离+B细胞和子集
根据制造商协议（Easysep，Stemcell技术），通过CD19阳性选择从冷冻保存的PBMC中分离出B细胞。用于进一步分类CD19+B细胞亚群，用抗CD19（1:300，PE-Cy7，J3-119，Beckman-Coulter）、抗IgD（1:100，BV510，IA6-2，Biolegend）和7AAD（1:200，559925，BD Biosciences）在FACS缓冲液（PBS（Gibco），5mg/mL BSA（Sigma）和2mM EDTA（Sigma））中对细胞进行染色，并在4°C黑暗中孵育30分钟。培养后，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，然后重新悬浮在分选缓冲液中（FACS缓冲溶液加上25 mM HEPES（Sigma））。CD19编号+B细胞被分类为CD19+免疫球蛋白D+公元7年−和CD19+免疫球蛋白D-公元7年−使用BD FACSChorus应用程序（Becton Dickinson）在FACSDelody Cell Sorter上使用纯度排序模式的种群。
细胞培养条件
使用Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）、10%（v/v）FCS、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素扩大LSC和CD40LC（Gibco，Life Technologies）。使用含有10%FCS（v/v）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Gibco，Life Technologies）的Iscove改良定义培养基（IMDM；Gibco，Life Technologies）培养B细胞和B细胞共培养物。向这些培养物中加入细胞因子和分子的不同组合（细胞因子混合物1（CK1）、细胞因子混合物2（CK2）或细胞因子混合物3（CK3）；)最终浓度为10 ng/mL重组人IL-2（Peprotech，200-02，50 ng/mL重组人IL-21（Peprotech，200-21）、50 ng/mL重组人APRIL（Peprotech，310-10C）、10μg/mL CpG ODN2006（Invivogen，tlrl-2006-1）和500 U/mL重组人类IFN-alpha A（alpha 2a）蛋白（R&D Systems，11100-1）。
2D和3D文化
隔离CD19+B细胞或分类的亚群与支持细胞（CD19）以1:5的比例培养+B细胞：CD40LC和CD19+B细胞：LSC）或1:2.5:2.5比率（CD19+B细胞：CD40LCs：LSCs），存在指定的细胞因子和分子混合物(). 在2D中，支持细胞在组织培养处理的48 well板（Cellstar Cell culture Multiwell Plates，Greiner Bio-One）的底部形成一个汇合层，CD19位于板的顶部+培养B细胞。3D，CD19+将B细胞、CD40LC和/或LSC均匀地并入所示水凝胶组合物中()通过再悬浮，将20μL凝胶浇铸在非问题培养处理的48-well板（Nunc non-treated Multipales，ThermoFisher）的中心，以防止细胞从3D水凝胶中生长。所有共培养物在37°C、5%co的增湿培养箱中培养4、7、11和/或14天2在2D和3D中，每孔30000个细胞的数量和添加的培养基体积保持相等。在每个时间点，收集每个单独培养孔中的所有细胞，并对其进行整体测量，从而得出绝对总细胞数，可以根据不同条件随时间进行比较。每周刷新培养基两次，每孔添加250μL，将每个时间点的上清液储存在−20°C下，以供进一步分析。
方法详细信息
水凝胶
根据Cruz-Acuña等人的协议，创建模块化细胞封装水凝胶的方法，其中包含粘附肽和蛋白酶可降解交联肽。26简而言之，每个末端带有马来酰亚胺基团的四臂聚乙二醇大分子单体（PEG-4MAL，MW 20 kDa，Laysan Bio）与含半胱氨酸的粘合肽RGD（GRGDSPC，AAPPTec，自定义合成，纯度：>95%，三氟乙酸（TFA）去除）和REDV去除）并使用GPQ-W交联（GCRDGPQGIWGQDRCG，AAPPTec，定制合成，纯度：>95%，（TFA）去除）。允许达到室温的等分PEG-4MAL大分子单体、粘附RGD肽和交联剂GPQ-W。称量所需量的GPQ-W和RGD，并使用20 mM HEPES缓冲液（Sigma）溶解，然后将PH调整为7.4。将两种溶液转移至单独的Costar Spin-X离心管（康宁）进行过滤。将PEG-4MAL大分子单体溶解在无菌、预过滤的20 mM HEPES缓冲液中。PEG-4MAL和RGD溶液以2:1的比例混合，并在37°C下培养15分钟，以生成功能化PEG-4MAC前体溶液。这些细胞将包含在水凝胶中，在水凝胶结合后旋转，然后去除上清液。将细胞重新悬浮在B细胞培养基中（所需最终水凝胶体积的20%），然后添加功能化PEG-4MAL前体（所需的最终水凝胶容量的60%）。将交联肽溶液（GPQ-W）添加到每个孔的底部，位于48 well多孔板的中心（所需最终水凝胶体积的20%）。将包含官能化PEG-4MAL前体和细胞混合物（所需最终水凝胶体积的80%）的混合物移到交联肽溶液的顶部并快速重新悬浮。浇铸水凝胶后，将平板在37°C下培养20分钟，使其交联，然后将培养基添加到每个孔中。在我们的人类3D淋巴模型的水凝胶优化过程中，测试了六种不同的水凝胶成分().
力学分析
PEG-4MAL水凝胶的压缩模量（或刚度）随PEG-4MAL含量和肽功能化程度的变化而变化（PEG1:4%（w/v）PEG-4MAPL、2.0 mM RGD、4.9 mM GPQ-w、PEG2:5%（w/v）PEG-4MAL、2.0 mM-RGD、6.6 mM-GPQ-w、PEG3:4%，6.6 mM GPQ-W）通过使用动态力学分析（DMA、Q800、TA仪器）的无侧限压缩测定。样品在含有10%FCS（v/v）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Gibco，Life Technologies）的Iscove改良定义培养基（IMDM）中溶胀24小时后进行测量（每种条件3个）。链霉素的pH值为7.4，37°C。压缩模量是根据5–15%应变下应力-应变曲线的线性导数计算得出的。
膨胀率
膨胀率（Q米)PEG-4MAL水凝胶，具有不同的PEG-4MAL含量和肽功能化（PEG1:4%（w/v）PEG-4MAX、2.0 mM RGD、4.9 mM GPQ-w、PEG2:5%（w/v）PEG-4-MAL、2.0 mM-RGD、6.6 mM-GPQ-w、PEG3:4%（w/v）PEG-4MAL、1.0 mM RGD:1.0 mM REDV、4.9 mmM GPQ-v、PEG4:5%（w/v）PEG-4MAL、1.0mM RGD-1.0 mM REMV、，6.6 mM GPQ-W）。水凝胶（40μL）在含有10%FCS（v/v）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素（pH 7.4，37°C）的IMDM中培养。仔细取出培养基后，在第1、2、3和4小时后，以及在第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第11天和第14天收集水凝胶样品，测量其膨胀后的质量（MS公司). 然后将水凝胶在70°C的烘箱中干燥24小时，然后将其干燥质量（MD类)已测量。在每个时间点测量每种类型的三种水凝胶。基于水凝胶质量的溶胀比使用Q计算米=MS公司/M（M）D。
流变学分析
使用discovery HR-2混合流变仪（TA Instruments）测量5%（w/v）PEG-4MAL、2.0 mM RGD、6.6 mM GPQ-w（PEG2）水凝胶的储存模量（G′），该流变仪具有平行板几何形状，带有直径为20 mM的丙烯酸上板，温度为21°C，频率为1–10 rad/s，恒定应变为2%。水凝胶样品，有细胞和无细胞（CD19+制备B细胞、CD40LC、LSC）。水凝胶样品的直径为5 mm，厚度为1 mm。样品在含有10%FCS（v/v）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的IMDM中溶胀后进行测量，37°C时pH值为7.4。在第1天、第4天、第7天、第11天和第14天进行测量之前，仔细移除水凝胶周围的介质。每隔一段时间测量G′，用流变学分析间接测量PEG2随时间的降解，有无细胞存在。在每个时间点测量每种类型的三种水凝胶。
流式细胞术特征
从2D B细胞共培养中收集非粘附细胞。使用溶于B细胞培养基中的250 U/mL 1型胶原酶（17018029，Thermo Fisher）在第4、7、11和14天解交联3D B细胞共培养物，并在37°C下培养1小时。将细胞重新悬浮在含有抗体的FACS缓冲液中，并在4°C的黑暗中培养30分钟。培养后，将细胞清洗2次，然后使用FACS缓冲液重新悬浮。流式细胞术数据是使用FACS LSR Fortessa（Becton Dickinson）采集的。
用于流式细胞术的抗人抗体有：抗CD19（1:300，PE-Cy7，J3-119，Beckman Coulter），抗CD19，抗CD138（1:150，PE，MI15，Biolegend），抗CD154（1:200，AF647，24-31，Bioledeng），抗IgA（1:100，APC，IS11-8E10，Miltenyi Biotec），抗-IgD。为了排除死细胞，添加了7AAD（1:200，559925，BD Biosciences）或Fixable Viability Stain 700（1:4000，564997，BD Horizon，BD bioscience）。根据制造商的协议，使用5μM细胞追踪蓝鉴定增殖细胞(｛“type”：“entrez nucleotide”，“attrs”：｛“text”：“C34568”，“term_id”：“2370709”，“term_text”：“C34568”｝｝C34568号，赛默飞世尔）。
ViSNE分析
每个条件下合并生物和技术三倍，从该数据中均匀地再取样10000个细胞。生成的图显示了标记表达水平的颜色编码，总体维度降低的单细胞viSNE数据显示了在不同时间点比较2D与3D培养物或原始与激活B细胞时，三个集合供体中原始、激活和分化的B细胞亚群以及B细胞亚类的聚类。
免疫细胞化学
第14天，将2D和3D培养物固定在4%（v/v）缓冲甲醛（VWR Chemicals）中，并用PBS洗涤。在pH 8.0的0.5M EDTA缓冲液（Invitrogen，ThermoFisher）中，在90°C下对所有样品进行热介导抗原回收15分钟。使用0.2%（v/v）Triton X-100（Merck Millipore）在PBS中渗透细胞10分钟，并用PBS洗涤。然后在室温（RT）下用50mg/mL BSA在PBS中封闭样品1小时，随后在PBS中洗涤。通过与纯化的抗人CD19抗体（10μg/mL，SJ25C1，Biolegend）孵育进行免疫检测或纯化的抗人CD138抗体（10μg/mL，MI15，Biolegend）在RT下过夜，然后生物素化羊抗鼠抗体（1:200，RPN1001；GE Healthcare）在RT上1小时，Alexa Fluor 488抗链霉亲和素（4μg/mL，S32354；Thermo Fisher Scientific）在RT中1小时，全部在含有50 mg/mL BSA的PBS中，并在摇床上培养（150 rpm）。使用前离心所有抗体（13000 rpm，持续5分钟）。在染色步骤之间，用0.1%吐温20（v/v，Merck Millipore）在PBS中清洗样品。然后用Phalloidin–Atto 700（0.4 nmol/mL，79286，Sigma-Aldrich）和DAPI（100 ng/mL，D9542，Sigma Aldrich。
荧光成像
使用徕卡EL6000光源和徕卡LASX采集软件，使用徕卡DMi8荧光显微镜拍摄荧光图像。四个检测通道从使用的荧光色素中收集以下波长的荧光信号：钙黄绿素（527/30）和乙炔同二聚体-1（605/75），它们分别被赋予绿色和红色的假色，或DAPI（460/50）、Alexa Fluor 488（527/30）、DiI（605/75）和Phalloidin–Atto 700（700/75），它们被赋予假色蓝色、绿色、黄色和红色。
抗体测量
使用基于荧光珠的多重免疫分析法，使用Luminex技术测定培养上清液中的IgA、IgM和总IgG抗体浓度。将培养上清液在分析缓冲液中稀释至1:5（第4天和第7天）和1:15（第11天和第14天）。在含有0.1%（v/v）吐温20和3%（w/v）BSA的PBS中进行稀释。标准曲线、对照物（67/099，美国国家生物标准与控制研究所（NIBSC））和空白物包含在每个平板上清液旁边（均测量两次）。珠子在室温下以25 rpm的恒定转速在黑暗中孵育45 min，然后用PBS洗涤3次。在最后的洗涤步骤后，将珠子重新悬浮在100μL PBS中，并在Bio-Plex 200仪器（Bio-Rad Laboratories）中进行分析之前摇晃。
量化和统计分析
使用FlowJo v10.6.2软件分析流式细胞术数据。在细胞库溢价中对流式细胞术数据进行viSNE分析(https://premium.cytobank.org).64所有运行都使用相同的随机种子和默认的t-SNE参数（迭代次数=1000，复杂度=30，θ=0.5）。使用ImageJ 1.53c软件处理荧光z堆栈图像，以创建单个最大投影。使用徕卡LASX软件的马赛克功能合并3D文化的图像概述，使用平滑和线性混合将图像拼接在一起。使用Bio-Plex Manager（4.1.1版）软件（Bio-Rad）对多重免疫分析数据进行5参数拟合分析。
所有实验组均为技术性三联。结果显示为图图例中所示捐赠者数量（n）的平均值±SD。p值基于多个假设的普通双向方差分析（双向方差分析），在比较3种或更多实验条件下的多个结果时使用Tukey的多重比较事后检验，或在比较2种实验条件下多重结果时使用Sidak的多重比较后检验。使用GraphPad Prism 9.3.1进行数据分析。软件。在所有测试中，p值<0.05被认为具有统计学意义。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
致谢
我们要感谢：Mylène de Ruijter（荷兰乌得勒支大学医学中心骨科）帮助测量PEG-4MAL凝胶的机械性能。Reza Nadafi（荷兰阿姆斯特丹大学医学中心分子细胞生物学和免疫学系），负责分离LSC。Martien Poelen和Maarten Emmelot用于CD40LC的辐射。Pieter Dingemanse、Gaby Smits和Pieter van Gageldonk协助建立和使用基于荧光珠的多重免疫分析。Nening Nanlohy帮助测量培养上清液和随后的分析（均为荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心）。
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本研究是Target-to-B联盟的一部分，该合作项目由顶级生命科学与健康部门向Samenwerkende Gezondheidsfondsen（SGF）提供的PPP津贴资助在荷兰，项目编号为LSHM18055-SGF，以刺激作为SGF一部分的卫生基金会的公私伙伴关系和共同融资。我们感谢患者合作伙伴、私人合作伙伴和Target-to-B联盟的积极同事的支持（参见网站：网址：www.target-to-b.nl). 资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或文章准备中没有任何作用。
作者贡献
M.V.J.B.设计并执行了实验，并对数据进行了分析。R.S.V.B.、A.M.M.B.、R.E.M.、J.D.W.和C.A.C.M.V.E.支持数据分析。M.V.J.B.写了这篇文章。R.S.V.B.、A.M.M.B.、R.E.M.、J.D.W.和C.A.C.M.V.E.修订了该条。J.D.W.和C.A.C.M.V.E.监督了实验。
数据和代码可用性
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