iScience。2023年1月20日;26(1): 105730.
立克次体病原体通过色氨酸代谢产物介导的p38 MAP激酶激活抑制蜱细胞死亡
,1 ,2 ,1和1,三,∗
普拉奇·纳姆乔什
1田纳西大学兽医学院生物医学和诊断科学系,美国田纳西州诺克斯维尔,37996
穆斯塔法·达马尼
2美国马里兰州大学医学院帕克分校兽医系
Hameeda Sultana公司
1田纳西大学兽医学院生物医学和诊断科学系,美国田纳西州诺克斯维尔,37996
吉里什·内拉坎塔
1田纳西大学兽医学院生物医学和诊断科学系,美国田纳西州诺克斯维尔,37996
1田纳西大学兽医学院生物医学和诊断科学系,美国田纳西州诺克斯维尔,37996
2美国马里兰州大学医学院帕克分校兽医系
三引线触点
接收日期:2022年7月29日;2022年10月27日修订;2022年12月1日验收。
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总结
吞噬细胞无浆体调节哺乳动物细胞中的各种细胞信号通路以维持其生存。在这项研究中,我们报告说A类.吞噬细胞调节蜱色氨酸途径以激活节肢动物p38 MAP激酶,从而使该细菌及其载体宿主存活。色氨酸代谢产物黄嘌呤酸(XA)水平的升高在A类.吞噬细胞-受感染的蜱和蜱细胞。细胞死亡标记物水平较低,p38 MAPK总水平和磷酸化水平升高A类.吞噬细胞-受感染的蜱和蜱细胞。XA治疗可增加p38 MAPK磷酸化水平,并减少细胞死亡A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。此外,用p38 MAPK抑制剂治疗会影响细菌复制,降低磷酸化p38 MAPK水平,增加蜱细胞死亡。然而,XA逆转了这些影响。总之,我们提供了证据表明立克次体病原体调节节肢动物色氨酸和p38 MAPK通路以抑制细胞死亡,从而使其在蜱类中存活。
主题领域:生物科学、分子生物学、微生物学、寄生虫学
介绍
蜱是节肢动物载体,可将各种病原体传播给哺乳动物宿主。1,2
肩胛硬蜱是一种黑种蜱,是人畜共患立克次体病原体传播的主要媒介,A类.吞噬细胞各种宿主,如人类、马、牛、鹿和狗。三,4,5这些蜱在其生命周期中有四个发育阶段,包括卵、幼虫、若虫和成虫阶段。6不成熟时我.肩胛骨从一个A类.吞噬细胞-受感染的宿主,这种细菌通过血粉进入蜱类,然后在这些蜱类的不同发育阶段被跨界维持。7人类或其他脊椎动物在被A类.吞噬细胞-受感染的蜱虫。4,7
A类.吞噬细胞是一种专性细胞内革兰氏阴性细菌,可引起人类粒细胞无浆体病(HGA)。8在人类中,A类.吞噬细胞感染、驻留和复制中性粒细胞。9,10在进入宿主细胞后不久,A类.吞噬细胞驻留在主机派生的真空中并在其中繁殖。4宿主衍生的液泡在整个过程中都完好无损A类.吞噬细胞感染周期随着细菌数量的增加而增大。4据报道,宿主源性空泡的扩张可能是因为从自噬体、转高尔基体小泡和ER源性小泡获得膜。11,12,13此外,A类.吞噬细胞已知利用各种营养毒力策略,包括劫持宿主细胞的表观遗传机制,14获取宿主胆固醇,15调节囊泡运输,使其停留在液泡中,4避免自噬11延迟凋亡。4包括我们自己的几项研究报告称A类.吞噬细胞还调节各种信号级联以在蜱中存活。1,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29
在细菌、病毒和寄生虫感染中,宿主细胞诱导细胞死亡,最终导致感染病原体的下降。30然而,病原体已经开发出独特的策略来抑制宿主细胞死亡,以维持其生存和复制。细胞凋亡是一种典型的程序性细胞死亡机制。30几种病原体,包括A类.吞噬细胞,开发了抑制宿主细胞凋亡的策略。30,31在哺乳动物细胞中,A类.吞噬细胞抑制凋亡caspase级联的激活,增加抗凋亡基因的表达,并转移无浆体转运底物-1(Ats-1)以干扰细胞凋亡诱导。11,31此外,据报道,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号转导途径参与了细胞凋亡的延迟A类.吞噬细胞-受感染的人类中性粒细胞。32在病媒宿主中,A类.吞噬细胞抑制细胞凋亡我.肩胛骨细胞系ISE6通过下调线粒体孔蛋白。23在蜱类唾液腺中,A类.吞噬细胞抑制固有的凋亡途径,而在肠道中,这种细菌通过Janus激酶/信号转导物和转录激活物(JAK/STAT)途径抑制凋亡。26这些研究强调A类.吞噬细胞已开发出通过抑制凋亡在哺乳动物和载体宿主细胞中生存的策略。
在我们之前的工作中,我们报告说A类.吞噬细胞调节有机阴离子转运多肽(OATP)和色氨酸途径以在我.肩胛骨滴答声。17黄尿酸(XA)是色氨酸途径的代谢物,由3-羟基-L-氰尿酸通过氰尿苷氨基转移酶(KAT)活性合成。RNAi介导的isoatp4056或卡特表达,单独或组合,受到显著影响A类.吞噬细胞蜱和蜱细胞的生长。17外源添加XA导致A类.吞噬细胞蜱细胞和蜱唾液腺的负担。17此外,我们注意到A类.吞噬细胞调节色氨酸途径以防止蜱细胞中活性氧(ROS)水平的积累。18研究报道XA可诱导疟疾寄生虫的发育恶性疟原虫蚊子体内。33,34最近的一项研究报告了XA在埃及伊蚊蚊子。35在同一项研究中,有报道称缺乏XA会促进蚊子中肠上皮细胞死亡。35XA缺乏如何导致细胞死亡的分子机制尚不清楚。此外,没有证据表明病原体是否通过调节XA来防止宿主细胞死亡。在这项研究中,我们提供的证据表明A类.吞噬细胞不仅诱导蜱体内XA水平,还同时激活p38 MAPK通路以防止其载体宿主细胞死亡。
结果
用色氨酸代谢物XA进行外源性治疗可提高A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞
我们实验室以前的研究报告称A类.吞噬细胞调节色氨酸途径以使其在蜱类中存活。17,18,19外源添加的色氨酸代谢物XA在100μM时增加A类.吞噬细胞蜱虫和蜱细胞的负担。17,18,19为了测试XA是否对蜱细胞存活有任何影响,我们进行了活/死实验。在活/死试验中,活细胞染绿,死细胞染红。根据该试验,我们发现XA处理的未感染或A类.吞噬细胞-与相应的模拟治疗对照组相比,感染蜱细胞在感染后第1、3和6天的细胞死亡显著减少(A) ●●●●。在第1天、第3天和第6天观察到的细胞死亡对于本研究中使用的细胞系来说是正常的。模拟或XA处理的未感染或A类.吞噬细胞-感染细胞进一步证实了这些微观观察结果(B) ●●●●。我们注意到XA治疗的未感染或A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞与相应的模拟对照(B) ●●●●。这些结果表明,外源添加XA有助于提高蜱细胞的存活率。
XA外源治疗抑制蜱细胞死亡
(A) 相位对比或荧光显微图像显示未感染的活(绿色)和死(红色)或A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。在处理后的第1、3和6天,用模拟或XA处理蜱细胞,并使用活/死染色试剂盒进行染色,然后使用荧光显微镜进行成像。比例尺指示200μm。
(B) 用XA处理的未感染或A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。开口和黑色条表示未感染或A类.吞噬细胞蜱细胞。使用Student’st吨测试并显示p值。
潜在细胞死亡标志物的序列分析我.肩胛骨
XA降低蜱细胞死亡的观察()促使我们研究蜱细胞死亡标记物。研究表明,磷脂酶D3(PLD3)、衰老标志蛋白30(SMP30)、突触蛋白和液泡蛋白分选26B(VPS26B)蛋白参与细胞死亡过程。36,37,38,39
我.肩胛骨蜱在基因组中编码所有这些基因(表S1). 的百分比标识我.肩胛骨SMP30型(图S1A) 、Syntaxin(图S1B) ,第3页(图S1C) 和VPS26B(图S1D) 氨基酸序列与同源蛋白智人(Hs),小家鼠(百万),黑腹果蝇(Dm),冈比亚按蚊(银),致倦库蚊(Cq)和A类.埃及语通过CLUSTALW比对测定(Aa)。我.肩胛骨SMP30氨基酸序列与人、鼠、,D类.黑腹食肉动物,A类.冈比亚人,C类.致倦五角肌、和A类.埃及语分别为SMP30正交曲线(图S1A和S2系列A) ●●●●。我.肩胛骨syntaxin氨基酸序列与人、小鼠、,D类.黑腹食肉动物,A类.冈比亚人,C类.致倦五角肌,A类.埃及语分别为合成蛋白直系物(图S1B和S2系列B) ●●●●。我.肩胛骨PLD3氨基酸序列与人、小鼠、人和人的同源性分别为41%、43%、46%、50%、48%和49%,D类.黑腹食肉动物,A类.冈比亚人,C类.致倦五角肌、和A类.埃及语分别为PLD3直方图(图S1C和S2系列C) 和我.肩胛骨VPS26B氨基酸序列与人、小鼠、,D类.黑腹食肉动物,A类.冈比亚人,C类.致倦,A类.埃及语VPS26B正交曲线(图S1D和S2系列D) ●●●●。领域分析我.肩胛骨syntaxin一级氨基酸序列显示在C末端存在跨膜区域结构域(279–293 aa)、一个SynN结构域(29–151aa)和t-SNARE结构域(192–259aa)(图S1E) ●●●●。领域分析我.肩胛骨PLD3一级氨基酸序列显示N端存在跨膜区域结构域(89–111 aa)、两个磷脂酶D活性位点(PLDc)基序(262–289 aa、480–506 aa)和PLD样结构域(Pfam:PLDc_3)(292–471aa)(图S1F) ●●●●。PLD3的系统进化树分析显示我.肩胛骨PLD3分组到不同的分支中,而不是其他直系族。(图S1G) ●●●●。PLD3正交D类.黑腹食肉动物形成一个接近人类和小鼠直系亲属的分支。而蚊子的PLD3同源基因形成了一个单独的分支(图S1G) ●●●●。序列分析我.肩胛骨Syntaxin、VPS26B和SMP30揭示蜱蛋白形成一个接近D类.黑腹食肉动物蚊子蛋白和人鼠蛋白形成了不同的分支(图S3). 翻译后修饰位点的生物信息学分析我.肩胛骨PLD3、SMP30、Syntaxin和VPS26B显示这些蛋白具有几个N-肉豆蔻酰化、蛋白激酶II磷酸化、N-糖基化、cAMP和cGMP以及蛋白激酶C磷酸化位点(图S4).
的表达式smp30型,合成蛋白,第3页和vps26b型受发育调节
滴答声有四个生命周期阶段。因此,我们分析了smp公司30,合成蛋白,可编程逻辑器件3和vps26b版转录本在蜱类发育的所有阶段都有表达(). qPCR分析表明,幼虫显著表达(p<0.05)较高水平的smp30型(A) 以及可编程逻辑器件3(C) 与若虫、雄性和雌性蜱的水平相比。Nymphs表达显著(p<0.05)较高水平的smp30型雄性和雌性蜱的mRNA比较(A) ●●●●。此外,若虫表达的可编程逻辑器件3mRNA与雄性蜱中记录的水平的比较(C) ●●●●。尽管在可编程逻辑器件3观察了若虫和雌蜱的mRNA水平(C) ●●●●。在表达合成蛋白在幼虫、若虫和成年雄性蜱之间检测到mRNA水平。然而,在表达合成蛋白雄性和雌性蜱之间的mRNA水平(B) ●●●●。幼虫和若虫显著表达(p<0.05)较高水平的vps26b版与雄性蜱的水平相比(D) ●●●●。然而,在vps26b版与雌蜱的水平相比,幼虫和若虫之间的水平(D) ●●●●。这些数据显示的变量表达式模式smp30型,语法素,第3页和vps26b版蜱类不同发育阶段的转录水平。
的级别smp30型,合成蛋白,pld3和vps26b不同发育阶段的转录本我.肩胛骨
(A–D)定量PCR(qPCR)分析显示smp30型(A) ,语法素(B) ,可编程逻辑器件3(C) ,vps26b版(D) 在未感染的未饲养蜱的不同发育阶段。若虫和成虫样本中的每个数据点代表单个蜱虫中记录的转录水平。对于幼虫样本,每个数据点代表五个混合幼虫的转录水平。图中的水平线表示数据点的平均值。这些基因的mRNA水平归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。使用ANOVA分析计算统计显著性。
A类.吞噬细胞下调smp30型,syntaxin和pld3若虫蜱和蜱细胞的转录水平
我们分析了A类.吞噬细胞调节细胞死亡标记物的表达。分析未感染或A类.吞噬细胞-未感染的若虫蜱以及未感染或A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞(). qPCR分析显示smp30型(A) ,语法素(B) ,可编程逻辑器件3(C) 但不是v第26b页(D) 在A类.吞噬细胞-感染蜱与未感染若虫蜱的水平进行比较。此外,我们注意到smp30型(E) ,语法素(F) ,可编程逻辑器件3(G) 和v第26b页(H) 英寸A类.吞噬细胞-将感染的蜱细胞与未感染的对照组中的表达进行比较。如预期,qPCR分析证实存在A类.吞噬细胞只有感染的蜱和蜱细胞(图S5A和S5B)。免疫印迹分析进一步证实PLD3在A类.吞噬细胞-感染蜱与未感染蜱的水平比较(我和第5章C、,表S3). 这些结果表明,细胞死亡标记转录物的表达在A类.吞噬细胞-受感染的蜱和蜱细胞。
吞噬细胞无浆体下调smp30型,syntaxin和pld3unfed中的mRNA水平我.肩胛骨若虫和蜱细胞
(A-I)定量PCR分析显示第30页(A和E),合成蛋白(B和F),可编程逻辑器件3(C和G),vps26b版(D和H)未感染或A类.吞噬细胞-受感染的蜱虫(A–D)和未受感染的或A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞(E–H)在48小时p.i.打开的圆圈代表未感染的(UI),关闭的圆圈表示感染的(i)蜱或蜱细胞。在面板(A–D)中,每个圆圈代表从一个蜱虫产生的样本中获得的数据,而在面板(E–H)中,每个圆圈代表从板中一个独立培养板产生的蜱细胞样本中获得的数据。图中的水平线表示数据点的平均值。这些基因的mRNA水平被归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。学生的p值t吨显示了测试。
(一) 免疫印迹分析显示未感染(UI)或A类.吞噬细胞-受感染的(I)未饲养的若虫蜱。考马斯蓝染色凝胶总蛋白图谱图像在免疫印迹分析中用作负荷控制。M表示美国BioRad的Precision Plus蛋白质全蓝色标记。
A类.吞噬细胞增加若虫蜱和蜱细胞内色氨酸代谢产物XA的内源性水平
我们之前的研究报告称A类.吞噬细胞上调isoatp4056和犬尿氨酸氨基转移酶(卡特)促进蜱和蜱细胞中细菌复制的基因。17,18,19因为我们注意到蜱细胞的细胞存活率增加(A和1B)和细胞死亡标记物水平降低A类.吞噬细胞感染(),我们检查了A类.吞噬细胞影响蜱和蜱细胞内XA的内源性水平(). 内源性XA水平的定量是通过一种基于XA和N个,N个-二乙基-对-苯二胺(DE-PPD)氧化偶联。40该测定法对XA测定具有高度特异性,不测量犬尿烯酸(KA)(A) ●●●●。我们注意到,在非胎牛中内源性XA水平显著增加(p<0.05)A类.吞噬细胞-感染若虫与未感染对照组中记录的水平进行比较(B) ●●●●。同样,我们观察到内源性XA水平在A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞与未受感染的对照组相比(C) ●●●●。这些结果表明A类.吞噬细胞显著增加蜱和蜱细胞内色氨酸代谢产物XA的内源性水平。
吞噬细胞无浆体诱导蜱和蜱细胞产生内源性XA
(A–G)(A)在750 nm处测量的不同浓度下XA和KA标准品吸光度的图形表示。未感染(UI)或A类.吞噬细胞-感染的(I)未喂养的若虫蜱(B)或蜱细胞(C)。开/闭圆圈分别表示从未感染(UI)/感染(I)蜱或蜱细胞获得的数据。在B中,每个圆圈代表从五个扁虱池中生成的样本,在C中,每个圆代表一个培养皿中一个独立培养皿的数据。图中的水平线表示数据点的平均值。qPCR分析显示四个基因的表达:smp30型(D) ,合成蛋白(E) ,可编程逻辑器件3(F) ,vps26b版(G) 模拟(M)或黄尿酸(XA)处理A类.吞噬细胞受感染的蜱细胞。在所有面板中,开圈表示模拟处理的数据,闭圈表示XA处理的感染蜱细胞的数据。每个圆圈代表一个独立培养皿中的数据。图中的水平线表示数据点的平均值。这些基因的mRNA水平归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。学生的p值t吨显示了测试。
色氨酸代谢物XA下调的外源治疗smp30和pld3基因表达在里面A类.嗜吞噬细胞-受感染的蜱细胞
然后我们研究了模拟和XA处理的细胞死亡标记基因的mRNA表达水平A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。qPCR分析显示smp30型(D) 和可编程逻辑器件3(F) XA治疗组的转录物显著减少(p<0.05)A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞与模拟处理的对照细胞中的水平进行比较。此外,我们注意到胱天蛋白酶基因表达A类.吞噬细胞-受感染的XA处理的蜱细胞与模拟处理对照组的表达比较(图S5D) ●●●●。然而合成蛋白(E) 或v第26b页(G) 在XA处理后A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞和模拟治疗的对照。如预期,qPCR分析证实存在A类.吞噬细胞在模拟或XA处理的蜱细胞中(图S5E) ●●●●。总的来说,这些结果表明A类.吞噬细胞通过激活色氨酸途径调节一些蜱细胞死亡标记的表达。
的表达式p38丝裂原活化蛋白激酶受发育调节
p38 MAPK磷酸化增加与细胞凋亡延迟有关A类.吞噬细胞-受感染的人类中性粒细胞。32因为我们观察到A类.吞噬细胞-XA治疗感染蜱细胞后,我们推断p38 MAPK通路是否在A类.吞噬细胞-受感染的蜱虫。我们首先梳理了我.肩胛骨基因组,鉴定蜱类p38 MAPK同源序列,并对蜱类p38 MAPK进行序列分析。的百分比标识我.肩胛骨p38地图(A) 氨基酸序列与同源蛋白H(H).智者(Hs),M(M).肌肉(百万),D类.黑腹果蝇(Dm),C类.致倦五角肌(Cq)和A类.埃及语通过CLUSTALW比对测定(Aa)。这个我.肩胛骨p38MAPK氨基酸序列与人、小鼠、,D类.黑腹食肉动物,C类.致倦五角肌和A.埃及语p38MAPK正交(A) ●●●●。翻译后修饰位点的生物信息学分析我.肩胛骨p38 MAPK揭示了四个蛋白激酶C磷酸化位点,两个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、三个N-糖基化位点、十一个酪蛋白激酶II磷酸化位点和三个N-肉豆蔻酰化位点(B) ●●●●。领域分析我.肩胛骨p38 MAPK一级氨基酸序列显示存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域(21–305 aa)(C) ●●●●。序列分析表明我.肩胛骨p38 MAPK与其他直系亲属属于不同的分支。(D) ●●●●。然而,我.肩胛骨p38 MAPK形成一个与人类和小鼠同源基因相近的分支(D) ●●●●。这些分析表明我.肩胛骨p38 MAPK序列是保守的,保留了其他同源序列中明显的功能域。
序列分析p38 MAPK蛋白以及p38丝裂原活化蛋白激酶不同发育阶段的转录本我.肩胛骨
(A) 饼图表示的标识百分比我.肩胛骨p38 MAPK氨基酸序列与来自智人(Hs),小家鼠(百万),黑腹果蝇(Dm),致倦库蚊(Cq)和埃及伊蚊(Aa)。
(B) 在PROSITE分析p38 MAPK蛋白中预测的翻译后位点数量。
(C) 的示意图我.肩胛骨p38 MAPK蛋白结构如图所示。领域分析我.肩胛骨p38 MAPK一级氨基酸序列显示存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域(21–305 aa)。
(D) 的序列分析我.肩胛骨p38 MAPK氨基酸序列与其他同源序列显示。使用邻接连接(BIONJ)方法和BIONJ算法在DNASTAR中生成系统发育树。
(E) qPCR分析显示p38地图在未感染的未饲养蜱的不同发育阶段。若虫和成虫样本中的每个数据点代表单个蜱虫中记录的转录水平。对于幼虫样本,每个数据点代表5个混合幼虫中记录的转录水平。图中的水平线表示数据点的平均值。mRNA水平归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。使用ANOVA分析计算统计显著性。
然后我们分析了p38丝裂原活化蛋白激酶在所有蜱类发育阶段(E) ●●●●。qPCR分析显示,幼虫表达显著(p<0.05)高水平的p38丝裂原活化蛋白激酶与若虫相比,雄性和雌性成虫蜱。Nymphs表达显著(p<0.05)较高水平的p38地图mRNA与成年雄性蜱的比较(E) ●●●●。No significant (p > 0.05) differences in the levels ofp38丝裂原活化蛋白激酶记录到若虫和雌蜱之间或雄蜱和雌虱之间的转录本(E) ●●●●。这些数据显示了p38丝裂原活化蛋白激酶不同蜱类发育阶段的转录本。
A类.嗜吞噬细胞感染调节p38地图蜱和蜱细胞中的表达
然后我们分析了A类.吞噬细胞调节p38丝裂原活化蛋白激酶.成绩单等级p38丝裂原活化蛋白激酶在未感染或A类.吞噬细胞-感染的蜱和蜱细胞(A和6B)。qPCR分析显示p38丝裂原活化蛋白激酶(A) 年显著增加A类.吞噬细胞-与未感染蜱的水平相比,感染蜱。同样,我们还观察到p38丝裂原活化蛋白激酶在里面A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞与未受感染的对照组相比(B) ●●●●。免疫印迹分析显示A类.吞噬细胞受感染的蜱(C、,S6系列A、 S6B和表S3)和蜱细胞(D、,S6系列C和表S3)与未受感染的对照中的水平相比。这些结果表明A类.吞噬细胞上调蜱和蜱细胞中p38 MAPK的总水平和激活水平。
吞噬细胞无浆体上调未饲养若虫蜱和蜱细胞中p38 MAPK的水平
(A和B)定量PCR分析显示p38丝裂原活化蛋白激酶未受感染或A类.吞噬细胞-受感染的蜱(A)或蜱细胞(B)。开圆圈表示未感染(UI)的数据,闭圆圈表示感染(I)蜱或蜱细胞的数据。每个圆圈表示来自一个刻度(A)的数据或从板(B)中的一个培养板孔收集的样本。图中的水平线表示数据点的平均值。这些基因的mRNA水平被归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。学生的p值t吨显示了测试。
(C) 免疫印迹分析显示未感染(UI)或A类.吞噬细胞-受感染的(I)未饲养的若虫蜱。
(D) 免疫印迹分析显示未感染(UI)或A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。考马斯蓝染色凝胶总蛋白图谱图像在免疫印迹分析中用作负荷控制。M表示美国BioRad的Precision Plus蛋白质全蓝色标记。
A类.吞噬细胞调节XA介导的节肢动物p38 MAPK通路激活以减少蜱细胞死亡
因为我们看到p38丝裂原活化蛋白激酶转录物和增加的p38 MAPK总水平和磷酸化水平A类.吞噬细胞-我们分析了外源性添加XA对p38 MAPK激活的影响。qPCR分析显示p38丝裂原活化蛋白激酶模拟或XA处理的转录水平A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞(A) ●●●●。然而,免疫印迹分析显示p38 MAPK在A类.嗜吞噬细胞-感染的XA处理的蜱细胞与模拟处理对照中的水平相比(B、,S6系列C和表S3). 分析是否A类.吞噬细胞XA同时介导p38 MAPK的激活,防止蜱细胞死亡,我们使用BIRB796,一种p38 MAPK所有亚型磷酸化的泛抑制剂。41用不同浓度的BIRB796处理蜱细胞,发现10和100μM时磷酸化p38 MAPK水平受到抑制(图S7和表S3). 此外,免疫印迹分析显示,未感染BIRB796治疗组和未感染组的磷酸化p38 MAPK水平均降低A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞与相应模拟治疗对照组比较(C、,第8节和表S3). 然而,即使在BIRB796存在的情况下,XA的加入也恢复了p38 MAPK的激活(C和第8节). 在未感染和A类.吞噬细胞-用XA+BIRB796处理的受感染的蜱细胞,与仅用BIRB796处理的对照中的水平相比(C和第8节). 此外,A类.吞噬细胞BIRB796治疗组的负担显著降低(p<0.05)A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞与模拟治疗对照组的细菌负荷比较(D) ●●●●。然而,外源性XA治疗显著(p<0.05)挽救了BIRB796介导的细菌负荷减少(D) ●●●●。此外,MTT分析结果显示显著降低(p<0.05)A类.吞噬细胞-与模拟治疗对照组相比,BIRB796治疗后感染蜱细胞的存活率(E) ●●●●。然而,XA+BIRB796治疗组的细胞存活率显著提高(p<0.05)A类.吞噬细胞-感染细胞与BIRB796-alone处理或模拟处理对照中观察到的存活率的比较(E) ●●●●。总的来说,这些结果表明A类.吞噬细胞诱导XA介导的p38 MAPK通路激活在抑制蜱细胞死亡中起重要作用。
外源添加黄尿酸可增加p38地图mRNA水平和抑制细胞死亡A类.吞噬细胞-感染的蜱细胞
(A) qPCR分析显示p38地图模拟(M)或黄尿酸(XA)处理A类.吞噬细胞受感染的蜱细胞。开圆圈表示模拟处理的数据,闭圆圈表示XA处理的感染蜱细胞的数据。每个圆圈代表一个培养皿中一个独立培养皿的数据。图中的水平线表示数据点的平均值。这些基因的mRNA水平归一化为蜱类β-肌动蛋白mRNA水平。学生的p值t吨显示了测试。
(B) 免疫印迹分析显示模拟(M)或XA处理的p38 MAPK磷酸化水平A类.吞噬细胞受感染的蜱细胞。
(C) 免疫印迹分析显示未感染(UI)或A类.吞噬细胞-用模拟(M)、BIRB796(Birb)或XA和BIRB796[XA+Birb]处理的受感染(I)蜱细胞。考马斯蓝染色凝胶总蛋白图谱图像在免疫印迹分析中用作负荷控制。
(D) qPCR分析显示A类.吞噬细胞模拟、BIRB796或XA和BIRB797处理的蜱细胞的负荷。开放圆圈表示模拟处理的数据,闭合圆圈表示BIRB796处理的数据;闭合三角形表示XA和BIRB796-处理的感染蜱细胞的数据。每个圆圈和三角形表示一个独立培养皿中的数据。图中的水平线表示数据点的平均值。mRNA水平第44页基因被归一化为扁虱5.8S rRNA水平。
(E) 显示MTT分析结果。经处理的模拟(M)、BIRB796(Birb)或XA和BIRB795(XA+BirbA类.吞噬细胞-显示了感染的蜱细胞样本。对于D和E面板,使用ANOVA分析计算统计显著性,并显示p值。
(F) 黄原尿酸在A类.吞噬细胞-显示了蜱细胞存活的相关调节。吞噬细胞无浆体通过上调转录激活蛋白-1(AP-1)激活进入蜱细胞的色氨酸代谢途径,从而增加内源性黄尿酸(XA)的生成并抑制活性氧(ROS)的生成。此外,有机阴离子转运多肽将有助于外源性XA的摄入。内源性和外源性XA都激活p38 MAPK信号。此外,A类.吞噬细胞感染导致细胞死亡标记物下调,提示蜱细胞死亡减少。XA介导的p38 MAPK信号激活导致蜱细胞存活率增加,最终有利于细菌在其载体上的长期定植。图片未按比例绘制。
讨论
据报道,在感染各种病原体的过程中,诱导宿主细胞死亡途径,如细胞凋亡、pyroptosis、肿瘤学和自噬。30,42宿主细胞试图通过诱导细胞死亡途径来限制入侵细菌、病毒和寄生虫的生长,最终清除病原体。30,42然而,细胞内病原体为了在宿主细胞中生存而调节几个信号级联,包括抑制细胞死亡途径。4,31,42在这项研究中,我们发现A类.吞噬细胞通过色氨酸代谢产物介导的p38 MAPK激活抑制蜱细胞死亡。
我们实验室先前的研究表明A类.吞噬细胞调节色氨酸途径和OATP。17两者都有isoatp4056和卡特研究人员发现,这些基因在小鼠的唾液腺中表达上调A类.吞噬细胞-受感染的若虫蜱。17上调卡特基因A类.吞噬细胞-感染蜱表明内源性XA的产生增加。17XA水平升高的观察结果A类.吞噬细胞-本研究中受感染的蜱和蜱细胞证实了我们之前的发现。据报道,摄入24小时血液后,蚊子肠道中XA的浓度增加到毫摩尔水平。35然而,用糖喂养的蚊子体内XA含量很低。35此外,据报道,大鼠大脑区域,如嗅球和海马体,XA的浓度约为1μM。43作者推断,1μM水平的XA可以有效参与大鼠大脑中的信号传递。43因此,在目前的研究中,观察到未饲养的若虫蜱和蜱细胞在微摩尔水平上XA水平较低,并参与p38介导的细胞死亡抑制并不令人惊讶。
我们根据先前研究的结果选择了细胞死亡标记物(SMP30、syntaxin、PLD3和Vps26B)。36,37,38,39蜱蛋白的氨基酸序列与节肢动物的同源性比与人类或小鼠蛋白的同源性高。在幼虫、若虫、雄性和雌性中检测到这些蛋白质的转录本,表明这些蛋白质在蜱类所有发育阶段的重要性。下调vps26B版转录水平A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞而不是蜱中的蜱表明体外和体内样品。ISE6细胞是从胚胎化的蜱卵中产生的,这些细胞具有神经样表型。44研究表明,蜱类和蜱细胞之间几种转录物的表达存在差异。27,45因此,在vps26B版蜱和蜱细胞之间的表达。此外,观察到vps26B版XA处理在蜱细胞中的表达表明该蛋白在蜱细胞中具有XA非依赖性作用。
P38 MAPK参与各种细胞过程,包括分化、炎症、增殖和细胞存活。46观察到的增加p38丝裂原活化蛋白激酶幼虫阶段的转录物与若虫或成虫阶段的转录水平相比,表明这种全球调节器在蜱类的未成熟阶段发挥着重要作用。幼体蜱需要吸血才能蜕皮到若虫阶段。P38 MAPK水平的升高有助于抑制幼蜱蜕皮至若虫期的细胞死亡。序列分析表明,蜱类p38 MAPK与几种节肢动物的同源基因以及人类和小鼠的同源基因很接近。一些研究表明,多种信号通路(p38 MAPK、PI3K、p42/44 ERK)可以延迟人类中性粒细胞的凋亡。47,48,49,50保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域的存在以及与哺乳动物同源序列的高比例同源性表明节肢动物p38 MAPK也可能在蜱的各种细胞信号事件中发挥作用。p38 MAPK被磷酸化激活。蜱类p38 MAPK上几个磷酸化位点的存在(B) 并且用磷酸化p38 MAPK抗体检测其表明通过磷酸化激活蜱p38 MAPK。本研究中使用的磷酸化p38 MAPK抗体在Thr180/Tyr182识别人类p38 MAPK上的磷酸化位点。这些残基是蜱类p38 MAPK中的Thr177/Tyr179,表明该激酶激活的保守磷酸化模式。BIRB796是p38 MAPK所有亚型的有效抑制剂。41在BIRB796处理的蜱细胞中观察到磷酸化p38 MAPK水平显著降低,这表明这些残基对蜱p38 MAPK的激活至关重要。
也有报道称,p38 MAPK通过保护哺乳动物细胞免受ROS积累而介导其生存。51作者指出,p38 MAPK通过各种机制增加抗氧化酶的表达:超氧化物歧化酶1(SOD-1)、SOD-2和过氧化氢酶,以保护ROS免受损伤。51在我们之前的研究中,我们报告了在A类.吞噬细胞-蜱细胞感染。18然而,外源性添加XA抑制了ROS水平的增加。18此外,我们注意到RNAi介导的卡特基因表达导致活性氧生成增加,最终导致细菌清除。18在本研究中,观察到p38 MAPK的磷酸化水平在A类.吞噬细胞和/或XA表明,该细菌调节色氨酸途径,激活p38 MAPK途径,以抑制活性氧水平的增加,防止蜱细胞死亡。我们最近报道说A类.吞噬细胞上调激活蛋白-1(AP-1)激活卡特基因启动子。16KAT是一种催化XA生成的酶。因此,我们认为A类.吞噬细胞通过上调AP-1基因表达诱导XA合成。此外,还发现p38 MAPK激活AP-1。52总p38 MAPK转录和蛋白水平升高的观察A类.嗜吞噬细胞-受感染的蜱虫表明,这种细菌通过AP-1调节反馈机制,同时调节色氨酸和p38 MAPK途径,以使其在载体宿主细胞中存活。
根据我们之前的观察16,17,18以及当前的研究,我们提出了一个模型A类.吞噬细胞抑制蜱细胞死亡(F) ●●●●。A类.吞噬细胞进入蜱细胞并在宿主衍生的液泡中繁殖(F) ●●●●。进入蜱类细胞后,A类.吞噬细胞上调激活色氨酸途径的OATP和AP-1,以增加内源性XA水平,从而抑制活性氧(ROS)生成(F) ●●●●。OATP水平增加可能导致更多外源XA进入蜱细胞(F) ●●●●。内源性和外源性XA水平的增加激活p38 MAPK通路,从而抑制蜱细胞死亡。细胞死亡标记物的下调进一步表明A类.吞噬细胞-受感染的蜱细胞。
总之,我们提供的证据表明A类.吞噬细胞不仅调节色氨酸-甲基苯丙氨酸介导的p38 MAPK激活,而且揭示了这些途径的激活对该细菌及其载体宿主的生存至关重要。此类研究对于了解细胞内立克次体病原体如何调节细胞信号以在载体宿主中生存至关重要。
研究的局限性
在这项研究中,我们提供了细胞内细菌病原体如何调节节肢动物的两条重要途径(色氨酸和p38 MAPK)以使其在蜱类中存活的证据。这项研究的局限性之一是缺乏使用p38丝裂原活化蛋白激酶或卡特基因敲除蜱和研究蜱细胞存活。虽然产生蜱类基因敲除的工具正在出现,但它们非常费力,而且不常用。本研究的另一个局限性是,我们没有讨论色氨酸和p38 MAPK通路的变化是否由细菌直接调节。A类.吞噬细胞向宿主细胞分泌几种效应蛋白。因此,需要更多的工作来解决蜱细胞存活是否直接受A类.吞噬细胞效应蛋白。
STAR★方法
关键资源表
试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
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抗体 |
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抗-PLD3 | 赛默飞世尔科技公司 | 类别号PIPA5104016;RRID:AB_2853347号 |
抗磷p38 | 细胞信号技术 | 类别#9211S;RRID:AB_331641号 |
总计-38 | 细胞信号技术 | 类别号9212;RRID:AB_330713号 |
HRP结合山羊抗兔二级抗体 | 细胞信号技术 | 产品目录#7074S;RRID:AB_2099233号 |
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细菌和病毒株 |
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吞噬细胞无浆体隔离NCH-1 | BEI资源、NIAID、NIH | NR-48807编号 |
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生物样品 |
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肩胛硬蜱(幼虫、若虫、成年雄性和雌性) | BEI资源、NIAID、NIH | NR-44115、NR-42510、NR-44116 |
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化学品、肽和重组蛋白质 |
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硫酸钾 | 阿法埃莎 | 类别号A13975 |
IMDM媒体 | 费希尔科学公司 | 目录号SH3025901 |
L-谷氨酰胺 | 美国吉布科 | 分类号25030-081 |
FBS公司 | VWR,美国 | 分类号89510-186 |
Leibovitz的L-15中型粉剂 | 吉布科 | 货号41300-039 |
磷酸色氨酸肉汤 | MP生物医学,美国 | 类别号ICN1682149 |
牛胆固醇脂蛋白浓缩物: | MP生物医学,美国 | 类别号ICN19147625 |
黄尿酸(XA) | 西格玛,美国 | 类别号D120804-5G |
氢氧化钠 | 大众汽车(VWR) | 类别号1310-73-2 |
二甲基亚砜 | 西格玛,美国 | 目录号D5879-500毫升 |
比尔796 | 托克里斯,美国 | 类别号59-891-0 |
MTT(噻唑蓝四唑溴化物) | 西格玛,美国 | 目录号MKCR0748 |
RIPA裂解缓冲液 | 美国生物科学 | 货号786-490 |
无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒 | 罗氏公司 | 分类号:11836170001 |
莱姆利样品缓冲液 | BioRad公司 | 产品目录号161-0737 |
30%丙烯酰胺 | 美国BioRad | 分类号1610156 |
SDS公司 | 西格玛,美国 | 类别号L3771-500G |
辅助电源 | 美国哥伦布化学工业公司 | 分类号053500 |
氨基甲烷盐酸盐 | 美国生物分析 | 分类号AB02005-01000 |
Tris底座 | 西格玛,美国 | 类别号T6066-1 KG |
甘氨酸 | 西格玛,美国 | 类别号G8898-1 KG |
盐酸(HCl) | Macron精细化学品 | 类别号H613-46 |
考马斯蓝 | 美国BioRad | 分类号1610400 |
硝化纤维膜 | 美国通用电气公司 | 目录号10600002 |
英国标准协会 | 西格玛,美国 | 分类号9048-46-8 |
吐温20 | 美国生物分析 | 分类号AB02038-00500 |
Clarity Western ECL基板 | 美国BioRad | 分类号1705061 |
醋酸盐缓冲液 | 美国热科学公司 | 目录号J60964.AK |
iTaq通用SYBR绿色Supermix | 美国BioRad | 类别号L001752 B |
2X通用SYBR绿色快速qPCR混合物 | 美国ABclonal | 分类号RM21203 |
N个,N个-二乙基-对-苯二胺(DE-PPD) | 阿法埃莎 | 类别号A17832 |
辣根过氧化物酶(POD) | 美国热科学公司 | 目录号J60026.MC |
氰尿酸(KA) | 西格玛,美国 | 类别号K3375-1G |
过氧化氢 | 美国热科学公司 | 产品目录号BP2633-500 |
蛋白质+梯子 | 美国BioRad | 分类号1610373 |
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关键商业分析 |
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Aurum Total RNA迷你试剂盒 | 美国BioRad | 货号732-6820 |
DNeasy血液和组织试剂盒 | 凯杰 | 分类号69506 |
iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad,美国 | 目录号1708891 |
Bradford(BCA)蛋白质检测试剂盒 | 皮尔斯/热科学公司,美国 | 类别号23227 |
活/死细胞成像套件 | 赛默飞世尔科技公司 | 猫#{“类型”:“中心核苷酸”,“属性”:{“文本”:“R37601”,“术语id”:“795057”,“词条文本”:R37601美元 |
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实验模型:细胞系 |
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勾选细胞系ISE6 | 美国标准菌库 | 类别号CRL-11974 |
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实验模型:生物体/菌株 |
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滴答声-肩胛硬蜱 | BEI资源、NIAID、NIH | NR-44115、NR-42510、NR-44116 |
小鼠C57BL/6J | 美国杰克逊实验室 | 分类号000664 |
小鼠B6.129S7-Rag1tm1Mom/J(RAG−/−) | 美国杰克逊实验室 | 类别号002216 |
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寡核苷酸 |
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qPCR引物 | 这篇论文 | 集成DNA技术 |
RNAi分析引物 | 这篇论文 | 集成DNA技术 |
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软件和算法 |
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GraphPad棱镜 | GraphPad,美国 | 版本6 |
图像J | 美国国立卫生研究院ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
DNASTAR CLUSTALW校准 | 美国DNASTAR | 拉塞根17 |
实验模型和主题细节
细菌
A类.吞噬细胞隔离NCH-1(从BEI Resources,NIAID,NIH获得),称为A类.吞噬细胞,在整个研究中使用。A类.嗜吞噬细胞维持在HL-60细胞中并从这些细胞中分离。16,17,19简单地说,将感染的HL-60细胞在2950×g、4°C的温度下离心10分钟,并用无菌1XPBS冲洗颗粒两次。然后将细胞重新悬浮在1×IMDM培养基中,并进行冷冻/解冻循环处理,然后通过25和27号针进行6-8次。随后将所得溶液在260×g下离心3 min,以获得上清液中的无宿主细胞细菌。这种上清液用于感染。
滴答声
我.肩胛骨本研究中使用的蜱类(幼虫、若虫、成年雄性和雌性)来自NIH NIAID BEI Resources。蜱类饲养在实验室湿度室中进行,湿度室由装有硫酸钾和水的橡胶盆组成,以将湿度提高到饱和点。湿度室的底部覆盖着硫酸钾,并在上面添加了1英寸的水。滴虫小瓶放在架子的顶部,不放在溶液中。滴答声保持在73°F。
勾选单元格线
这个我.肩胛骨蜱细胞系ISE6购自ATCC,在由Leibovitz的L-15培养基制备的L15B300培养基中生长,该培养基粉末含有5%的胰蛋白酶磷酸盐肉汤、5%的热灭活FBS和0.1%的牛脂蛋白浓缩物,pH 7.2。ISE6培养物保持在34°C。16,17
方法详细信息
老鼠和蜱类喂食
C57BL/6J和B6.129S7-Rag1tm1Mom/J(RAG−/−)(雌性,4-6周,美国杰克逊实验室)小鼠用于本研究。A类.吞噬细胞感染维持在B6.129S7-Rag1tm1Mom/J(RAG−/−)老鼠。未感染的幼虫蜱用未感染或A类.吞噬细胞-感染小鼠并蜕皮为若虫。未受感染或A类.吞噬细胞-对感染的若虫蜱进行DNA、RNA或蛋白质提取,并用于定量实时PCR分析、免疫印迹和ELISA。
道德声明
本研究中进行的所有动物实验均符合田纳西大学诺克斯维尔动物护理和使用机构委员会(IACUC,动物保证编号:D16-00397)批准的方案2801-0221。在将蜱虫放在小鼠身上之前,给动物服用乙酰丙胺嗪作为镇静剂,并尽一切努力减少痛苦。
总RNA、DNA分离和qPCR数据分析
蜱类(未饲养/饲养)若虫和蜱细胞的总RNA(2×105)按照制造商说明,使用Aurum Total RNA Mini试剂盒(美国BioRad)提取。18,19,53cDNA是使用iScript cDNA合成试剂盒(美国BioRad)从总RNA中生成的,18,19,53并用作放大smp30型,可编程逻辑器件3,合成蛋白,vps26b版和持家基因(蜱-β-肌动蛋白和5.8S rRNA)。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen,USA)提取蜱、蜱细胞和鼠组织的DNA。本研究中使用的所有寡核苷酸均在表S4.qPCR使用iQ-SYBR Green Supermix(美国BioRad)或2X Universal SYBR Green fast qPCR Mix(美国ABclonal)和CFX96触摸系统(美国BioSRad)进行。18,19,53qPCR方案如下:95°C持续3分钟,然后进行40次95°C循环10秒,58°C持续10秒,72°C持续30秒,最后在95°C下变性10秒。作为内部控制并使模板量正常化,对蜱类β肌动蛋白或5.8S rRNA扩增子进行量化。使用已知数量的各基因片段从1到0.000001 ng/μL的10倍系列稀释液制备标准曲线。
用黄尿酸(XA)进行蜱细胞系实验
蜱细胞在34°C下孵育。用XA进行蜱细胞系实验。18在0.5 N NaOH溶液中制备XA(Sigma,USA)储备液(10 mM)。18在1×PBS中制备1:10稀释的储备液,最终浓度为1mM,并用于所有实验。模拟溶液以类似的方式制备,但没有XA。刻度单元格(1×105)将其接种到12孔板上并培养16–20小时。培养后,用100μM浓度的XA处理蜱细胞4小时,然后A类.吞噬细胞(与2×10隔离5NCH-1感染HL-60细胞)感染。将等体积的模拟溶液(相当于100μM体积)添加到对照细胞中。然后将细胞培养48小时,进一步处理以提取RNA或DNA,然后进行qPCR以测量细胞死亡标记基因转录物或细菌负载量。
p38 MAPK抑制剂BIRB796的蜱细胞系实验
在二甲基亚砜(DMSO)溶液中制备BIRB796(Tocris,USA)原料(10 mM)。用蜱细胞培养基将储备溶液稀释至最终浓度10μM。模拟溶液的制备方法类似,但没有BIRB796。刻度单元格(1×105)将其接种到12孔板上并培养16–20小时。培养后,用10μM BIRB796处理蜱细胞4小时,然后A类.吞噬细胞(与2×10隔离5NCH-1感染HL-60细胞)感染。将等体积的模拟溶液(相当于10μM体积)添加到对照细胞中。然后将细胞培养24小时,并进一步处理以提取RNA和蛋白质,以测量p38丝裂原活化蛋白激酶转录物和蛋白质水平。在其他实验中,在电镀后16–20小时后,用100μM XA和20μM BIRB796处理蜱细胞4小时,然后A类.吞噬细胞感染。向对照细胞中加入等体积的模拟溶液(对应于100μM XA和20μM BIRB796体积)。将细胞孵育24小时,并进行DNA提取以测量细菌负荷。
活/死分析
XA对未感染或A类.吞噬细胞-按照制造商的说明,使用LIVE/DEAD细胞成像试剂盒对感染的蜱细胞进行分析。19简言之,2×105将蜱细胞接种在L15B300培养基上的12孔板上,培养24小时。24小时后,向细胞中添加100μM XA,然后A类.吞噬细胞感染。在感染后第1、3和6天处理细胞进行活/死染色,并使用EVOS成像系统(Invitrogen/TermoScientific Inc.)在GFP通道和Texas Red通道进行成像。捕获不同的图像,并使用TECAN分光光度计(TECAN,USA)在570/602nm的激发/发射波长下测量死细胞的荧光强度。至少考虑五次测量来计算荧光强度的平均值。ImageJ(NIH)软件用于合并从EVOS成像系统在GFP和Texas Red频道拍摄的图像,以生成如图所示的叠加图像。
MTT分析
采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物]测定法测定A类.吞噬细胞-XA或20μM BIRB796处理后感染的蜱细胞。54简单地说,蜱细胞的密度为4×104细胞在96 well板中每孔培养。16小时后,向细胞中添加100μM XA或20μM BIRB796。治疗4小时后,细胞感染A类.吞噬细胞(与2×10隔离4NCH-1感染的HL-60细胞)。感染后24小时(p.i.)后,去除20μL旧培养基,并向所有微孔中添加20μL MTT(5 mg/mL)储备液。用铝箔覆盖板,并在37°C下培养4小时(直到看到紫色沉淀)。培养后,添加100μL二甲基亚砜溶剂,并在37°C下进一步培养平板15分钟。在570 nm处读取吸光度。在690 nm处读取参考读数。从570 nm处获得的吸光度值中减去690 nm参考读数的吸光度,以确定蜱虫细胞的存活率。
蛋白质印迹分析
10只未感染未喂养的若虫和10只A类.吞噬细胞-用颗粒杵无绳电机(Biospec,OK)和颗粒杵(VWR,USA)将感染的未饲养若虫压碎并均质,在添加了无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒的改良RIPA裂解缓冲液中,分别从未感染或感染的蜱中产生蜱裂解物。在添加无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒的改良RIPA缓冲液中制备模拟或XA处理的蜱细胞裂解物。刻度单元格(1×105)将其接种到12孔板上并孵育16-20小时。孵育后,用100μM XA或20μM BIRB796处理蜱细胞,然后A类.吞噬细胞感染。向对照细胞中添加等量的模拟溶液。然后培养细胞24小时,然后收获细胞,在添加EDTA游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒的改良RIPA缓冲液中制备总细胞裂解物。蛋白质浓度由Bradford(BCA)蛋白质检测试剂盒测定,并符合制造商的建议。将蜱或蜱细胞裂解物(10–15μg)与Laemmli样品缓冲液混合,煮沸5 min,并在12%还原SDS-PAGE凝胶上溶解。凝胶在110 V下运行。凝胶随后用考马斯蓝染色或转移到硝酸纤维素膜上。考马斯染色凝胶图像用作加载控制。在1X TBST(1X TBS,0.05%吐温20)中用5%BSA封闭膜段。针对PLD3、磷酸化或总-p38的一级抗体以1:500的稀释度在1X TBST中的5%BSA中使用。HRP缀合的山羊抗兔二级抗体以1:5000的稀释度在1X TBST中的5%BSA中使用。使用BioRad ChemiDoc Touch Imaging System(BioRad,USA)观察化学发光底物的开发。
内源性XA测量
采用比色法测定内源性XA。40简单地说,8 mM溶液N个,N个-二乙基-对-用水制备苯二胺(DE-PPD)(美国热电科学公司)、300 IU/mL辣根过氧化物酶(POD)(美国热科学公司),XA或氰尿酸(KA)(美国西格玛公司)标准品(2.5–150μM),0.1M醋酸盐缓冲液(pH 4.3)。未受感染或A类.吞噬细胞-感染的若虫蜱或蜱细胞在水中均质,上清液用作测试样本。使用特异性引物通过qPCR确认感染A类.吞噬细胞.对于蜱细胞系实验,2×105将蜱细胞接种在L15B300培养基上的12孔板上,培养24小时。孵化后,一组蜱细胞被感染A类.嗜吞噬细胞另一组保留为未感染对照组。在48 h p.i.后制备蜱细胞样品。加入187.5μL 0.1M醋酸盐缓冲液(pH 4.3)、46.8μL DE-PPD、46.8µL蜱/蜱细胞样本或XA/KA标准品、9.37μL POD、9.37µL 30 mM过氧化氢,混匀。让混合物在室温下静置3分钟。对于空白溶液,使用9.37μL水代替过氧化氢。反应混合物的吸光度在5 min内750 nm处测量。
序列比对和分析
本研究中使用的序列的GenBank登录号见表S1和S2系列使用DNASTAR CLUSTALW比对软件对不同生物体的PLD3、Syntaxin、SMP30、VPS26B和p38 MAPK同源序列进行氨基酸序列比对。对以下各项进行了序列分析我.肩胛骨PLD3、Syntaxin、SMP30、VPS26B和p38 MAPK与各种生物体。使用DNASTAR中的BIONJ算法,使用邻居连接方法(BIONJ)构建系统发育树。蛋白质序列我.肩胛骨PLD3、Syntaxin、SMP30、VPS26B和p38 MAPK蛋白从GenBank下载并在PROSITE单独分析(http://prosite.expasy.org/)用于预测N-糖基化、肉豆蔻酰化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化和cAMP或C-GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点。55,56,57
致谢
以下试剂由疾病控制和预防中心提供,供BEI Resources、NIAID、NIH分销:肩胛硬蜱成人(现场),NR-42510,幼虫(现场)、NR-44115和Nymph(现场)和NR-44116。以下试剂通过BEI Resources,NIAID,NIH获得:吞噬细胞无浆体,应变NCH-1,NR-48807。本研究得到了美国国立变态反应和传染病研究所(NIAID)、美国国立卫生研究院(NIH)(奖励编号:R01AI130116)对G.N.和田纳西大学诺克斯维尔分校对H.S.和G.N.的启动资金支持。
作者贡献
P.N.、M.D.和G.N.进行了实验。P.N.、M.D.、H.S.和G.N.分析了数据。P.N.、H.S.和G.N.设计了研究,H.S.与G.N.提供了试剂。所有作者都阅读、编辑并批准了手稿。P.N.和G.N.写了这篇论文。G.N.对研究进行了概念化和构思,并监督了总体调查。
数据和代码可用性
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工具书类
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