奶酪微生物的普遍驱动因素

总结

图形摘要

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集锦

介绍

奶酪的消费和生产都在增加。2014年，世界奶酪产量达到2100万公吨，预计到2026年，全球市场价值将达到1060亿美元。¹一般来说，奶酪是通过牛奶蛋白（酪蛋白）的凝结而产生的，酪蛋白是从牛奶的乳清中分离出来的。奶酪品种取决于生产的地理区域、加工方法和使用的成分，包括牛奶、凝固剂，在某些情况下还包括微生物发酵剂。干酪微生物群与它所在的干酪基质密不可分，驱动着成熟过程中复杂的生化变化。^2,三,4,5,6

奶酪微生物群主要由乳酸菌（LAB）组成，乳酸菌是乳酸菌目的成员，可产生乳酸作为碳水化合物发酵的最终产物。^7,8根据奶酪的类型，可以将特定的微生物或菌群接种到牛奶中，或从环境中获得，以开始成熟过程。这些微生物适应不同的非生物胁迫，包括pH值、盐度、温度或湿度的变化，以及生物胁迫，如个体或群落水平的竞争和入侵抗性。⁹在成熟过程中，奶酪微生物群受到原料奶质量、添加的发酵剂培养物和成熟条件的影响。^10,11这些细菌，尤其是乳酸菌，调节奶酪的外观、质地、香气、营养成分、质量和保质期，^12,13而不良微生物可能会对奶酪的质量和安全产生不利影响。¹⁴

与其他微生物学一样，奶酪微生物组学研究在过去二十年经历了一场革命，从依赖培养的方法转变为独立于培养的方法（即测序），以识别奶酪中的微生物，从而更全面地了解奶酪成熟过程中涉及的微生物。^11,15例如，发酵剂培养物中的乳酸菌通常是可培养的，在奶酪成熟的早期阶段含量丰富，而非发酵剂乳酸菌是成熟后期的主要成分和必需成分，但不太容易培养。^10,16近年来，基于序列的研究已被用于描述各种奶酪的微生物群特征，这些奶酪涵盖了各种牛奶类型、地理位置和生产方式。^2,17,18,19由于序列数据之间易于比较，基于测序的方法越来越流行，也促进了合成研究。^18,20

了解非生物因素（地理、奶酪pH值、成熟条件、牛奶类型等）如何驱动不同奶酪类型的微生物多样性，可以为改善成熟过程提供见解，揭示不同文化驯化如何产生不同的微生物群落，并阐明了奶酪微生物群生态组装的普遍模式。为此，我们在全球范围内首次对奶酪微生物组进行了系统综述和合成。从现有文献中，我们选择了公开的奶酪微生物组16S rRNA基因扩增子测序数据集，并研究了非生物因素如何塑造奶酪微生物组。除了确定当前奶酪微生物组研究中的差距外，本研究还首次对不同奶酪类型进行了全球调查，确定了其多样性的驱动因素。

结果

干酪微生物组研究趋势

在研究期间，我们发现，随着时间的推移，发表的以微生物为导向的奶酪研究数量（相关性检验，p=0.66）或执行扩增子测序的研究比例没有任何趋势(Χ²=23572，p=0.12；图1和​和2）。2). 大多数研究（75%）关注LAB，而不是整个奶酪微生物群(表S1).

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图1

ROSES流程图说明了文章的系统搜索、识别、筛选和最终选择

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图2

随时间推移，带有（深棕色）和不带有（浅棕色）16S rRNA基因扩增子测序（n=120）的奶酪微生物相关出版物

在所审查的120项研究中，71.7%的研究报告直接在生产点对奶酪进行取样，27.5%的研究报告对商用奶酪进行了取样，0.8%的研究报告没有披露其样品来源(图3A） ●●●●。大多数研究取样成熟奶酪（55.8%；图3B） 并且没有报告起始培养物的用途或组成（51.7%）。在报告了发酵剂使用情况的研究中，13.3%的人没有使用任何发酵剂，而20.8%、12.5%和1.7%的人分别关注使用商业、本地和未指定发酵剂制作的奶酪(图3C） ●●●●。只有2.5%的研究^2,19,21使用16S rRNA基因扩增子测序对奶酪生产中使用的发酵剂培养物进行测序(表S1). 少数研究报告了物理化学参数：平均盐度为2.5±1.1%（11%的研究报告），pH值为5.3±0.5（18%的研究报道），奶酪在10.7±5.5°C下成熟（26%的研究报道，图4). 奶酪成熟14至720天（46%的研究报告）。

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图3

本研究中奶酪样品的特征

反映（A）奶酪来源、（B）奶酪状态和（C）发酵剂使用情况的奶酪样品特征（n=120）。

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图4

本研究中奶酪样品的成熟参数

（A–F）成熟参数包括成熟持续时间（A）、成熟温度（B）、盐度（C和E）以及pH值（D和F）因奶酪类型而异。虽然盐度不会影响常驻微生物群（E）的丰富度，但pH值与丰富度呈正相关。在（A–D）中，报告每个参数的研究百分比（120项中）显示在每个面板的右上角。面板（E和F）中的数据来自5到7个微生物组数据集，分别报告了盐度和pH值。回归线表示不同奶酪类型和研究的平均反应。带阴影的色带表示总体响应的95%置信区间，数据点根据其研究成员身份进行着色。在f中，总体趋势偏离零的概率为1。

全球奶酪微生物群

为了进一步研究奶酪的位置、成熟条件和其驻留微生物群之间的关系，我们从27项进行16S rRNA基因或转录扩增子测序的研究中获得了公开的序列(表1). 该数据集包括来自16个国家58种奶酪的序列(图5)分布在824个样本中。总的来说，我们检测到5521种不同的ASV。

表1

16S rRNA基因或转录扩增子测序研究的元数据

NCBI SRA加入	#样品	原始读取次数	筛选的读取	最终读数	分子	巴氏杀菌	酸碱度	氯化钠	平均富裕度	奶酪	动物种类	原产国	初学者培养	参考
PRJNA283170型	4	4076	3875	3557.5	DNA	不	纳	纳	17.7	格拉卡西奥、莫扎里拉、里科塔、斯卡莫尔扎	奶牛、绵羊	意大利	是的	康索尼和卡利亚尼22
PRJNA637891公司	4	442,000	442, 000	400,602	DNA	是的	纳	1.5	84.2	伊丹	奶牛	波兰	是的	Ritschard等人。23
项目编号：24792	6	80,642	80,601	79,068	DNA	是的	5.2	纳	33.5	塔菲	奶牛	阿根廷	不	Murugesan等人。24
项目编号：36556	22	189,222	188,652	183,195	DNA	是的	纳	纳	37.4	佩帕	奶牛	哥伦比亚	纳	Ramezani等人。25
PRJNA230456型	9	5541	5387	4982	核糖核酸	是的	纳	纳	20.4	丰蒂纳	奶牛	意大利	是的	De Pasquale等人。26
项目编号：238397	16	5401	5375	2155	核糖核酸	是的	5.2	3.275	13.9	卡内斯特拉托·普格利泽	绵羊	意大利	不	Delcenserie等人。27
项目编号：255096	18	8735	6759	6476	核糖核酸	是的	纳	纳	38.6	格拉纳	奶牛	意大利	是的	Alessandria等人。2
项目编号：72374	29	5849	5630	5434	DNA	是的	纳	纳	25.9	莫扎雷拉	奶牛	意大利	纳	Salazar等人。28
邮编277133	37	133,106	133,100	126, 003	DNA	是的	纳	纳	78.6	格拉纳·帕达诺	奶牛	意大利	纳	Zhu等人。29
PRJNA286758型	29	6265	5816	5178	核糖核酸	不	5.8	4.052	15.7	佩科里诺·托斯卡诺（Pecorino Toscano）、佩科里诺·西西里亚诺（Pecorino Siciliano）、菲奥里·萨多（Fiore Sardo）	绵羊	意大利	是的	Kamimura等人。30
项目编号：290349	40	5781	5473	5372	核糖核酸	是的	纳	纳	16.7	Caciocavolo Silano公司	奶牛	意大利	是的	Falardeau等人。31
PRJNA294953公司	6	12,685	12,663	10,588	核糖核酸	是的	纳	纳	39	格拉纳·帕达诺	奶牛	意大利	是的	Dugat-Bony等人。32
PRJNA295825号	三	13,529	13, 493	11,698	DNA	是的	纳	纳	146.3	瑞士半硬	奶牛	瑞士	纳	Frétin等人。33
PRJNA311540型	18	3997	3871	3737	DNA	是的	5.3	纳	5.4	卡斯特尔弗朗科的卡西奥瓦洛	奶牛	意大利	是的	Giello等人。18
PRJNA316626型	17	43,316	42,829	42,265	DNA	不	纳	纳	27.9	阿多贝拉、萨卡特卡斯、奇瓦瓦、辛乔、瓦哈卡、卡纳斯托、阿萨德罗、曼切戈、阿多贝拉·梅萨、科蒂亚、帕内拉·巴斯图里扎多、帕内拉·阿尔特萨纳尔、乔科克、恰帕斯、墨西哥埃斯塔多牧场、韦拉克鲁斯牧场	奶牛	墨西哥	纳	Kamilari等人。34
PRJNA319425型	5	71,453	65, 868	65,128	核糖核酸	是的	5	纳	50.6	利克万	绵羊	伊朗	纳	Ruvalcaba-Gómez等人。35
PRJNA379167型	15	35,083	35,039	33,302	DNA	是的	纳	纳	12.3	佩科里诺克罗地亚语	绵羊	意大利	是的	Haddaway等人。36
PRJNA382370型	89	109,117	104,938	102,021	DNA	纳	5.4	1.491	14.5	高达牌手表	奶牛、山羊	美国、荷兰、未知	纳	布恩和科佩拉37
PRJNA413466型	15	34, 232	34,167	32,655	DNA	是的	纳	纳	26.8	库拉	牦牛	中国	纳	Quast等人。38
项目编号21256	24	60,069	58,602	57,947	DNA	是的	纳	纳	19.1	坎塔尔	奶牛	法国	是的	Turnbaugh等人。39
PRJNA476316型	180	82,455	81, 258	75,293	DNA	是的	纳	纳	38.2	塞拉诺（Serrano）、塞拉多（Cerrado）、阿拉善（Araxa）、Colonial、Curd、CampodasVertentes、塞罗（Serro）、卡纳斯特拉（Canastra）、塞拉多（Cerlado），凯皮拉（Caipira）、坎波达斯维滕特斯（Campodas Vertendes）、塞拉多（Cerrad）、凯皮拉、黄油（Ca，	奶牛	巴西	是的	Engel等人。40
PRJNA499132型	43	278,760	278,576	233,882	DNA	不	纳	纳	33.1	布里、切达、贾尔斯堡、格鲁耶尔	奶牛	加拿大	是的	Chao等人。41
PRJNA523139公司	97	24,883	24,056	24,003	DNA	是的	5.2	纳	13.6	卡门伯特；Reblochon公司	奶牛	法国	是的	McMurdie等人。42
PRJNA578621公司	32	31,487	24,489	24,239	DNA	是的	纳	纳	14.9	圣奈塔雷	奶牛	法国	是的	Oksanen等人。43
PRJNA598815公司	18	141, 051	140,017	137,710	DNA	是的	纳	纳	43.7	哈卢米	山羊、绵羊、混合	塞浦路斯	纳	摩根44
项目编号：673975	40	63,315	63,035	61,401	DNA	是的	纳	纳	6.5	切达干酪	奶牛	澳大利亚	纳	Afshari等人。19
PRJNA681198型	8	144,153	137,781	132,221	DNA	是的	纳	纳	169.6	阿多贝拉	奶牛	墨西哥	不	Kolde等人。45

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原始阅读、过滤阅读和最终阅读的数量显示为每个研究的平均值。NA，不可用；脱氧核糖核酸；RNA，核糖核酸。

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图5

本研究中奶酪样品的地理分布和丰富度

（A和B）本研究中奶酪样品的地理分布（A和B）及其丰富度（B）。在（B）中，每个点代表一个样本。

在所有样品中，平均丰度为29±25 ASV，但不同奶酪类型之间存在差异。Castelfranco（意大利）奶酪的Caciocavolo平均丰度最低（5±6 ASV），而瑞士半硬奶酪的平均丰度最高（146±12 ASV）(图5). 奶酪的微生物群主要由厚壁菌门和变形杆菌门的成员组成。值得注意的是，Castelfranco、Cheddar、Chiapas、Chihuahua、Gruyere和Jarlsburg奶酪的Caciocavolo微生物群以厚壁菌为主（>85%的社区），Adobera mesa、Canasto和Ranchero Veracruz的微生物群以变形杆菌为主（>80%的社区）。此外，发现Halloumi、Grana和Edam奶酪的微生物群中含有<5%的蓝细菌，而蓝细菌是奶酪中不常见的一个门类。

在4项报告盐度的研究中（84个样本），我们发现丰富度和盐度之间没有一致的关系（斜率估计值0.04±0.08，后验概率0.69）。相比之下，在7项报告pH值的研究（119个样本）中，我们发现丰富度和pH值之间存在着强烈的正相关关系（后验概率为1），斜率为7.87±2.59，截距为-24.23±14.81(图4).

我们发现巴氏杀菌奶酪和未经巴氏杀菌的奶酪的丰富度没有差异（差异的后验概率=0.51，图S2A） ●●●●。平均而言，用山羊奶制成的奶酪的丰度最高（44±1 ASV），并且始终比牛奶和羊奶制成的芝士丰度高。由羊奶制成的奶酪的丰度最低（23±5 ASV），且始终低于牛奶或牛奶混合物制成的奶酪（所有比较的后验概率为1，图S2B） ●●●●。我们还发现不同地理区域的奶酪之间没有差异（所有比较的差异后验概率<0.79，图S2C） ●●●●。

为了评估乳酸菌在群落中的比例是否影响群落丰富度，我们检查了乳酸菌目成员的相对丰富度与整个群落丰富性之间的关系。我们发现丰富度和LAB丰富度之间存在强烈的负相关（后验概率为1），斜率为−18.13±1.28，截距为49.07±6.81(图S3).

在所有研究中，奶酪类型几乎没有重叠，只有三种奶酪类型（阿多贝拉、切达和格拉娜·帕达诺）被不止一项研究测序。实验变量的基于距离的方差划分（使用的提取试剂盒、研究身份、使用的测序器类型以及DNA或RNA扩增子是否测序）解释了55.6%的属级群落组成变异(图S4A） ；然而，在这种变异中，48.5%是由一个以上的变量共享的。值得注意的是，研究本身解释了7.1%，而研究和提取试剂盒的组合解释了32.7%的群落组成变化。

奶酪成熟条件（奶酪类型、巴氏杀菌、原产国和奶源）的基于距离的方差划分解释了65.5%的群落组成变化(图S4B） ●●●●。正如预期的那样，所有这些变异都嵌套在奶酪类型中，仅奶酪类型就解释了29.9%的群落组成变异。重要的是，原产国和奶酪类型的组合解释了群落组成的额外25.7%的变化，而巴氏杀菌仅解释了群落构成变化的一小部分（1.8%）。虽然这些嵌套方差部分的显著性不可测试，但整个模型具有统计显著性，表明这些成熟条件对微生物群具有一致的相关影响。

为了研究奶酪之间的相似性，我们对所有类型的奶酪进行了聚类分析，共有三份样品（n=805）。我们发现对四类奶酪的支持最强，这四类奶酪表现出明显的优势群落(图6). 奶酪微生物第1组包括来自23种奶酪的280个样品，主要是乳球菌属类似地，微生物第2组包括来自12种奶酪类型的236个样品，主要是乳球菌属但均匀度和丰富度低于第1组（所有Wilcoxon试验p<0.05，图S5). 微生物组第3组包括来自18种奶酪的230个样品，主要是链球菌，和微生物群第4组包括来自8种奶酪类型的59个样品，这些奶酪类型以该属的成员为主乳酸杆菌。第4组丰富度最高（所有Wilcoxon成对检验均p<0.05，图S5). 在聚类分析中包括的39种奶酪类型中，17种奶酪类型的样品被分为多组。相反，群体似乎反映了地理起源：第1组主要由来自北美和南美的样品组成（88.6%的样品），而第3组和4以欧洲原产样品为主（分别占95.2%和91.5%，图6).第2组样本来源多样，其中19.9%来自北美和南美，55.5%来自欧洲，16.9%来自澳大利亚。

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图6

奶酪微生物群分为四大类

聚类是使用Dirichlet多项式混合模型确定的，并在顶部边缘标记。展示了最丰富或最流行的属。在所有样本中，这14个属平均占群落的83.5±21.9%，并且在左侧边缘显示了目成员。左边的树反映了属间丰度分布的相似性。在每个集群中，奶酪按类型排序，每个集群中的奶酪类型显示在下边缘。每个样本的地理来源显示在顶部边缘。

讨论

随着全球奶酪消费和生产的持续增长，^1,46了解奶酪中微生物多样性的驱动因素对于确定最终产品的价值、消费者的享受、质量和安全以及保质期至关重要。从生态学角度来看，奶酪微生物群是不同人类文化数百年驯化的产物，⁴⁷从而可以作为微生物生态学研究的简化模型系统。¹⁵我们通过合成表征了奶酪微生物群的全球分布。

虽然测序技术在食品科学中的使用预计在未来会增加^14,48; 我们发现，在短时间内，奶酪微生物组的研究数量没有增加。我们还发现奶酪最常在生产点取样。关于发酵剂培养物的使用和组成以及非生物因素（包括奶酪盐度和pH值）的信息很少有报道；然而，我们的研究强调了这些变量如何影响奶酪微生物群的多样性和组成^11,49在报告pH值的16S rRNA基因扩增子测序研究中，我们发现微生物群丰富度与pH值之间存在一致的正相关关系。低pH值产生选择压力，可能有利于奶酪微生物群中少数细菌的生存和优势。⁵⁰相反，我们发现奶酪盐度和丰富度之间没有关系。这与现存文献相反^51,52; 然而，大多数可用的研究都是针对特定的奶酪类型，因此重点关注特定的奶酪微生物群。事实上，盐度增加会影响奶酪的微生物组成和生长、生化变化和酶活性、微生物演替以及奶酪质量。^11,51,53我们的发现表明，虽然盐度可以调节特定的微生物群，但它并不能解释不同奶酪类型中发现的不同微生物群落组成。然而，我们的分析受到少数报道非生物参数的微生物组研究的限制。

在现有的奶酪微生物组学文献中，75%的文献关注LAB，而不是整个微生物组，这可能是因为它们在奶酪成熟过程中起着核心作用，而且它们对健康也有好处。^54,55,56,57有趣的是，我们发现奶酪样本中乳酸杆菌的相对丰度与群落丰富度之间存在负相关关系，这表明随着时间的推移，很少有专门的乳酸杆菌菌株能在成熟奶酪中击败其他常驻微生物。众所周知，在奶酪基质中，LAB可以竞争性地排除和对抗一系列共存微生物的发展，尤其是可能污染奶酪质量和安全并产生负面影响的潜在破坏者。⁵⁸

根据奶酪类型和可能存在的病原体引起的安全问题，为奶酪生产收集的牛奶通常进行巴氏杀菌。巴氏灭菌会影响本地非致病性牛奶微生物群，也会使一些微生物分泌的抗菌化合物失活。^46,59,60然而，我们发现巴氏杀菌和非巴氏杀菌奶酪的丰富度没有差异，这与之前对Herve奶酪微生物组的研究一致，其中巴氏杀菌与非巴氏灭菌奶酪微生物组之间缺乏差异是由于其制造过程中的相似性。²⁷奶酪的质量和安全最终会受到牛奶中细菌的影响，尤其是那些能够耐受巴氏杀菌的细菌。^52,61我们的研究表明，这一过程不会影响奶酪微生物群的丰富度，只会轻微但显著地影响其组成。

我们发现牛奶的来源对奶酪微生物群的丰富度和组成有很大影响。牛奶微生物群的组成是动态的，与动物的生理状态、内源酶的存在和活性、挤奶次数、，^2,16,46,62它们具有物种特异性，并受到畜牧业和农场管理、乳头微生物群以及与挤奶设备和储存容器相关的卫生实践的影响。¹¹例如，在成熟的生牛奶干酪中检测到的27%的细菌也出现在乳头表面。⁶³此外，其中一些细菌包括LAB(干酪乳杆菌/副干酪,春港乳球菌/棉铃虫、和乳酸乳球菌),短杆菌亚麻布、和马葡萄球菌已知参与不同奶酪感官特性的发展以及脂肪和蛋白质的代谢。^11,63

我们的研究揭示了干酪微生物群的强大地理特征，与干酪类型及其相关生产过程无关。我们确定了不同奶酪类型的四种主要成分。有趣的是，17种奶酪类型的样品（在39种进行聚类分析的奶酪类型中）存在于多个聚类中，这表明聚类不是由奶酪类型的差异驱动的。第2组和第3组奶酪之间的差异是由乳球菌属和链球菌分别是。相比之下，第1组和第2组奶酪之间的差异是由优势模式决定的：两组奶酪的优势是乳球菌属，但第1组的微生物群比第2组的微生物群具有更高的均匀度和丰富度，这表明群落更复杂。这两组奶酪在地理来源上表现出显著差异，具有更丰富、更均匀社区的奶酪大多产自北美和南美，而丰度和均匀度较低的奶酪则主要产自欧洲。同样，第4组奶酪中的微生物群的丰富度和均匀度高于第2组和第3组。这些集群可能是由全球各地在本土化和质量法规方面的地方差异驱动的。例如，各国接受牛奶的法定体细胞计数（SCC）阈值水平各不相同，到目前为止，乳品行业尚未就SCC可接受限值达成全球共识。欧盟（EU）、澳大利亚、新西兰、挪威和瑞士的SCC限值为<400000个/mL，而美国、南非和巴西的SCC极限值分别为750000、500000和1000000个/mL。^46,64,65,66然而，有几个国家的乳品行业对牛奶的可接受性没有法定的SSC限制，这不仅会影响奶酪微生物群的变异性，还会影响乳制品的整体安全和质量。

在过去几年里，几种奶酪获得了原产地保护标志（PDO）的地位。PDO在奶酪上的应用越来越多，这不仅确定了其特定的地理来源，而且有助于确保奶酪质量，保护消费者免受欺诈。^22,67由于带有PDO商标的奶酪必须使用严格在PDO区域内饲养的动物所产的牛奶生产，因此其感官和微生物相关特性在其他地理区域不易复制。与特定地理区域/地区相关的环境条件决定了牛奶和奶酪的独特特性，成为奶酪性质、质量和安全的主要决定因素。²²最终，了解奶酪微生物群区域差异的驱动因素，可以深入了解丰富微生物群成员的功能潜力、多样性以及在奶酪典型特征中的有益作用。有必要进行进一步研究，以确定这些优势模式的差异是否是由于制造工艺、成熟做法、畜牧业和食品安全法规或当地环境微生物群的区域差异造成的。

奶酪和其他发酵食品的微生物群被反复提出作为理解和管理微生物群多样性的模式微生物系统。^14,68然而，我们的研究表明，奶酪微生物群在全球范围内各不相同，受奶酪生产过程和环境（即pH）的驱动。本研究提供的见解可能有助于将新发现与所有奶酪微生物群的全球背景联系起来，而不是局限于一个局部的单一奶酪类型。随着这些领域的研究不断发展（例如。，⁶⁹). 因此，我们的研究可以作为未来奶酪微生物组研究的通用参考点，并有助于优化食品生产，同时突出奶酪微生物组中微生物多样性的驱动因素。例如，未来的工作可能会利用为本研究创建的已处理序列数据（可在https://github.com/drcarrot/Cheese_ssynthesis网站/)将他们的奶酪中的微生物群与同一地区的、由相同牛奶制成的或具有类似非生物参数的奶酪进行比较。

从奶酪取样到分子技术、测序和生物信息学，发展共识工作流方法可能会大大加快奶酪微生物组的研究。类似的方法在人类和环境微生物组研究中被证明是非常宝贵的，^39,70,71,72并且可以促进奶酪研究领域的跨学科合作，从而更好地进行全球微生物组学诊断，优化监控和奶酪生产、质量和安全策略。特别是，一致采用16S rRNA基因的单一高变区、元数据标准（即技术元数据以及关键的非生物参数，如盐度和pH值）和一致的方法报告（即取样奶酪的区域）可以大大提高研究之间的可比性，而不影响生成微生物组数据所需的人力或资源。对奶酪微生物群及其驱动因素的全球视角可以帮助研究人员（跨多个学科）、生产商、食品监管机构和决策者了解并有效追踪奶酪相关微生物群的区域多样性、特性和趋势。

STAR★方法

致谢

笔记

发布日期：2023年1月20日

脚注

工具书类