iScience。2023年1月20日；26(1): 105708.
嵌合RNARRM2-C2第48页在NNK诱导的肺癌的发展中起致癌作用
,1,三 ,1,三 ,2 ,1 ,1和1,4,∗
周佳珍
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
新潮关
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
许恩武
2中国人民解放军南方战区总医院胸外科，广州510010
周嘉欣
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
芮雄
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
杨巧媛
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
1广州医科大学公共卫生学院化学致癌研究所，广州市番禺区新造，邮编511436
2中国人民解放军南方战区总医院胸外科，广州510010
三这些作者贡献均等
4引线触点
2022年10月2日收到；2022年10月24日修订；2022年11月29日验收。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
总结
嵌合RNA已被用作多种癌症的生物标记物和治疗靶点。然而，它们在肿瘤形成中的作用机制却很少受到关注。在这里，我们报道了高表达嵌合RNARRM2-C2第48页在74名肺癌患者和多个肺癌细胞系中发现了由4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）诱导的恶性转化的BEAS-2B细胞。的表达式级别RRM2-C2第48页与淋巴结转移、远处转移、肿瘤淋巴结转移（TNM）分期和吸烟显著相关。过度表达RRM2-C2第48页促进细胞生长，加速NNK诱导肺癌的进程。RRM2-C2第48页击倒抑制了RRM2-C2第48页-BEAS-2B细胞过度表达。最后，我们确定miR-219a-2-3p作为的潜在目标RRM2-C2orf48与肺癌总之，嵌合RNARRM2-C2第48页加速NNK诱发肺癌的进程miR-219a-2-3p可能与此过程有关。
主题领域：分子生物学、细胞生物学、癌症
介绍
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因。1它是男性癌症相关死亡的主要原因，也是女性癌症相关死亡第二常见原因。新发肺癌病例和死亡人数每年都在增加。据全球癌症观察站（Global Cancer Observatory）统计，2020年新发肺癌病例数超过220万，占全部癌症病例的11.4%，肺癌死亡人数超过179万，占所有癌症相关死亡人数的18.0%。2自2018年以来，新发肺癌病例和相关死亡人数有所增加，其中报告新发肺癌209万例，死亡176万例。三
肺癌的危险因素包括性别、年龄、社会经济地位、种族和地理位置，但吸烟仍是主要的危险因素。4,5烟草烟雾中含有6000多种不同的化学物质，包括尼古丁、芳香胺、N-亚硝胺、醛类和多环芳香烃。6最大的担忧之一是尼古丁和生物碱的硝化作用会产生烟草特有的亚硝胺，即4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK），其中尼古丁的存在是烟草特有亚硝胺的最大比例。7近年来，越来越多的研究关注NNK。这些研究发现，NNK对人体有多种不利影响，包括DNA损伤、氧化应激和磷酸化。在烟草相关致癌物中，NNK是肺癌进展和不良预后的最有力风险因素。8它促进肺部肿瘤的发生9增加肺癌细胞的侵袭能力。10,11NNK还影响生物降解和代谢，并与动物体内的DNA和血红蛋白结合，导致高度致癌性。12虽然已发现NNK通过多种机制诱发肺癌，但其致癌机制尚未完全阐明。
最近的研究已经确定嵌合RNA是肺癌诊断和预后的新的潜在生物标记物。嵌合RNA是一种RNA分子，由来自不同位点的两个或多个RNA序列组成，而这些RNA序列通常不存在于同一基因中。13嵌合RNA是一种新的RNA分子，具有或不具有编码能力，经常发挥重要的致癌作用。14嵌合体RNA最早于20世纪60年代被检测到，被认为是由染色体重排产生的基因融合而产生的。15例如，一些嵌合RNA通常存在于癌症组织中。这些包括BCR-ABL1型慢性粒细胞白血病16和KIF13B-RET公司和CD74-NRG1号机组在肺癌中。17,18这些典型嵌合RNA具有良好的特征，并且已知以癌症特异性模式表达。13,19一些嵌合RNA已被用作癌症临床治疗的靶点。例如，NTRK融合抑制剂和EML4-确认-融合阳性肺癌用克里唑替尼治疗。20,21
已经发现嵌合RNA是由反式-拼接和顺式-相邻基因之间的剪接(顺式-SAGe），无基因组畸变。22最近的研究表明，嵌合RNA由顺式-SAGe在人类的正常生物功能中发挥着潜在的重要作用。23很少有关于顺式-SAGe嵌合RNA，因为只有少量的顺式-剪接RNA嵌合体已在哺乳动物细胞中得到实验证实。24尽管如此顺式-已被实验证实的SAGe嵌合RNA在细胞生长调节中发挥重要作用，并可能作为癌症诊断和预后的生物标记物。25,26例如，两个顺式-SAGe嵌合RNA，BCL2L2-PABPN1型和CHFR-GOLGA3公司，在膀胱癌组织中的表达水平高于邻近正常组织。这两种融合主要富集在细胞核部分，表明其潜在的长非编码RNA（lncRNA）作用。27类似地顺式-SAGe公司SLC45A3-ELK4型在前列腺癌中高表达，其表达水平与前列腺癌进展相关。28
SLC45A3-ELK4型作为一种lncRNA，通过其转录物控制前列腺癌细胞增殖，因为它不产生翻译蛋白。29此外，D2HGDH-GAL3ST2型在前列腺癌样本中比在正常组织样本中更常见。沉默这种嵌合体会导致细胞增殖率和细胞运动性显著降低。30高水平的RRM2-C2第48页表达可能是鼻咽癌患者转移潜能的有用预测因子，对鼻咽癌的诊断和治疗具有潜在意义。31此外，RRM2-C2第48页促进结直肠癌细胞的增殖，并具有与其亲本基因不同的表达模式和功能。32此前的许多研究表明顺式-SAGe形成一种新的RNA分子，其功能类似于mRNA或lncRNA，这些融合RNA通常在癌症中高度表达。33然而，目前还没有关于吸烟对这些嵌合RNA影响的研究报道。
在这项研究中，我们鉴定了三种嵌合RNA，SLC35A3-HIAT1型,RRM2-C2第48页、和CTBS-GNG5使用NNK处理恶性转化的BEAS-2B细胞的RNA测序。此外，我们证明了RRM2-C2第48页促进细胞生长，并与NNK诱导的肺癌的发展有关。这是首次证明嵌合RNARRM2-C2第48页参与环境致癌物NNK诱发肺癌。
结果
NNK治疗恶性转化BEAS-2B细胞中复发嵌合RNA的鉴定
为了鉴定可能导致NNK诱导的肺癌的嵌合RNA，对经NNK（2B-NNK）治疗恶性转化的正常人支气管上皮BEAS-2B细胞和正常BEAS-2B细胞进行RNA测序。为了降低嵌合RNA鉴定的假阳性率，我们使用了两种嵌合RNA鉴定软件工具SOAPfuse和INTEGRATE进行了综合分析。如所示A和1B，SOAPfuse在BEAS-2B细胞中鉴定出407个嵌合RNA候选基因，在2B-NNK细胞中鉴定了254个，而INTEGRATE在BEAS-2 B细胞中识别出26个嵌合RNA候选基因，而在2B-NK细胞中则鉴定出24个。至少在两个样本中检测到嵌合RNA，并进一步研究在BEAS-2B和2B-NNK细胞中检测到的嵌合RNA(C） ●●●●。最后，三个嵌合RNA，SLC35A3-HIAT1型,RRM2-C2第48页、和CTBS-GNG5，符合标准。如所示D、 每个嵌合RNA的上游和下游区域位于同一染色体上，发现两个基因之间的距离小于3Mb，这表明这些嵌合RNA可能是通过顺式-拼接。以前的研究表明RRM2-C2第48页,SLC35A3-HIAT1型、和CTBS-GNG5表单由顺式-拼接。31,32,34此外，对嵌合RNA融合位点的详细分析表明SLC35A3-HIAT1型包含了SLC35A3型和感觉链的第二外显子HIAT1公司,RRM2-C2第48页包含第九外显子的感觉链建议零售价2和感觉链的第二外显子C2或48、和CTBS-GNG5包含反义链的第六外显子全面禁试条约和反义链的第三外显子全球导航卫星系统5.
嵌合RNA鉴定
（A和B）使用（A）SOAPfuse和（B）INTEGRATE在BEAS-2B和2B-NNK细胞中检测到的总嵌合RNA。
（C） 使用SOAPfuse和INTEGRATE进行综合分析，以实现更高的重复检测率。选择三个嵌合RNA进行进一步研究。
（D） 嵌合RNA的形成。
肺癌细胞系和组织中嵌合RNA的验证
RT-PCR和Sanger测序用于验证嵌合RNA。设计了与亲本基因退火并位于融合连接位点两侧的引物。RRM2-C2第48页,SLC35A3-HIAT1型、和CTBS-GNG5显示了预期大小的PCR产物，但SLC35A3-HIAT1型在RT-PCR检测中显示出额外的非特异性产物(A） ●●●●。PCR产物经Sanger测序证实为相应的嵌合RNA(B） ●●●●。为了检测这些嵌合RNA在肺癌中的表达水平，对四种人类肺癌细胞系（2B-NNK、A549、H1299和95D）和一种正常人类支气管上皮细胞系（BEAS-2B）进行了qRT-PCR。RRM2-C2第48页在所有四种肺癌细胞系中的表达水平均高于BEAS-2B细胞。CTBS-GNG5在2B-NNK、H1299和95D细胞系中表现出较高的表达水平，但在A549细胞中的表达水平低于BEAS-2B细胞，而SLC35A3-HIAT1型与BEAS-2B细胞相比，A549细胞中的表达水平显著升高（均p<0.05，C、 2D和2E）。RRM2-C2第48页发现在肺癌细胞系中最优先表达。
嵌合RNA及其在肺癌细胞中表达的验证RRM2-C2第48页不同临床病理特征肺癌组织中的表达
（A） 肺癌细胞系和正常人支气管上皮细胞系BEAS-2B嵌合RNA的RT-PCR产物的代表性琼脂糖凝胶图像。
（B–E）嵌合RNA RT-PCR产物Sanger测序结果的代表性图像。嵌合RNA的表达水平（C）SLC35A3-HIAT1型，（D）RRM2-C2第48页、和（E）CTBS-GNG5型在肺癌细胞系中。
（F–J）RRM2-C2第48页在74对肺癌组织和非癌肺组织中。非参数评估RRM2-C2或4874例肺癌患者的表达水平和（G）淋巴结转移、（H）远处转移、（I）临床分期和（J）吸烟。数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。学生的t吨测试用于数据分析。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
因此，我们使用qRT-PCR进一步检查RRM2-C2第48页在肺癌患者中高水平表达。一致地，RRM2-C2或48与相应的非癌肺组织相比，74例肺癌组织中的表达水平显著上调（p<0.05，F） ●●●●。与此同时，更高RRM2-C2第48页在淋巴结转移患者中观察到表达水平（N期，p<0.05，G） ，有远处转移（M期，p<0.05，H） 晚期肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段（p<0.05，一） 吸烟组（p<0.05，J） 与无N期、无M期、无晚期TNM期或不吸烟的患者相比。因此，增加了RRM2-C2第48页与N期、M期、晚期TNM期和吸烟有关。然而，在RRM2-C2第48页表达水平与年龄、性别、肺癌亚型或最大肿瘤维度有关（p>0.05，).
表1
非参数评估临床病理因素与RRM2-C2第48页74例肺癌患者的表达水平
| 临床特征 | 患者人数（n=74） | RRM2-C2orf48表达平均值±标准偏差 | P值 |
|---|
| 年龄（岁） | | | 0.897 |
| ≥60 | 38 | 5.47 ± 3.43 | |
| <60 | 36 | 5.82 ± 3.76 | |
| 性别 | | | 0.292 |
| 男 | 48 | 5.95 ± 3.75 | |
| 女性 | 26 | 5.06 ± 3.21 | |
| T级 | | | 0.881 |
| T型1-2 | 4 | 6.59 ± 5.48 | |
| T型3-4 | 70 | 5.58 ± 3.49 | |
| N级 | | | <0.001 |
| N个0 | 44 | 4.42 ± 3.04 | |
| N个1-2 | 30 | 7.53 ± 3.56 | |
| M阶段 | | | <0.001 |
| M（M）0 | 64 | 4.91 ± 2.76 | |
| M（M）1 | 10 | 10.34 ± 4.70 | |
| TNM阶段 | | | <0.001 |
| I–II级 | 37 | 3.49 ± 1.69 | |
| III–IV类 | 37 | 7.79 ± 3.67 | |
| 组织学亚型 | | | 0.96 |
| LUSC公司 | 29 | 5.52 ± 2.84 | |
| LUAD公司 | 40 | 4.96 ± 2.96 | |
| SCLC公司 | 4 | 13.13 ± 6.33 | |
| LCLC公司 | 1 | 6.37 ± 0 | |
| 肿瘤最大尺寸（cm） | | | 0.604 |
| >3.0 | 38 | 5.75 ± 3.48 | |
| ≤3.0 | 36 | 5.52 ± 3.71 | |
| 吸烟史 | | | 0.001 |
| 吸烟者 | 32 | 7.00 ± 3.70 | |
| 非吸烟者 | 42 | 4.60 ± 3.14 | |
RRM2-C2第48页上调，NNK治疗加速了BEAS-2B细胞的恶性转化
根据上述观察结果，吸烟与RRM2-C2第48页需要进一步调查。因此，我们研究了香烟烟雾中的主要成分和最强致癌物NNK对RRM2-C2或48在BEAS-2B细胞中。此外，还进行了菌落形成分析，以确定RRM2-C2第48页过度表达加速了NNK诱导的致癌作用。
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）增殖试验评估NNK对BEAS-2B细胞活性的影响。NNK处理24小时后，BEAS-2B细胞的活性显著降低。用50、100、200和400 mg/L NNK处理24 h后，细胞活力分别降低了15.87、19.23、26.68和52.40%，表明NNK和细胞活力之间存在剂量-反应关系(A） ●●●●。接下来，我们检查了RRM2-C2第48页0、50、100和200 mg/L NNK处理后，通过qRT-PCR在BEAS-2B细胞中检测。未使用400 mg/L剂量，因为它显著抑制细胞增殖。我们发现了RRM2-C2第48页NNK治疗后，表达水平增加，200mg/L剂量显著诱导RRM2-C2第48页表达式(B） ●●●●。然后，我们使用软琼脂糖集落形成分析来检查RRM2-C2第48页NNK过度表达诱导BEAS-2B细胞恶性转化。首先，我们建造了一个马厩RRM2-C2第48页-转染慢病毒载体的BEAS-2B细胞过度表达模型RRM2-C2或48序列（BEAS-2B-RC细胞）和阴性对照细胞模型，使用转染空慢病毒载体的BEAS-2B细胞（BEAS-2-V细胞，C） ●●●●。Western blotting和qRT-PCR分析证实了BEAS-2B-RC细胞的成功构建，并且BEAS-2B-RC细胞的过度表达RRM2-C2第48页不影响其亲本基因的表达，建议零售价2和C2或f48(D–3G）。基于CCK-8分析结果，我们选择100 mg/L作为多次NNK暴露实验的剂量，因为其轻微抑制BEAS-2B细胞的活性。我们将多重NNK暴露试验的观察终点设定在NNK治疗组中观察到菌落形成率显著增加的时间。正如预期的那样，与相应的对照细胞相比，我们观察到NNK处理的BEAS-2B、BEAS-2B-V和BEAS-2B-RC细胞的集落形成率显著增加(H和3I）。从注射后第7天开始，每3天测量一次裸鼠肿瘤大小；我们发现BEAS-2B-RC-NK组的肿瘤体积显著大于BEAS-2B-NNK组（p<0.05，J） ●●●●。在观察终点，BEAS-2B-RC、BEAS-2B-V和BEAS-2B细胞的最终NNK暴露剂量分别为1.0、1.2和1.2 mg(K） ●●●●。这些结果表明RRM2-C2第48页过度表达可能加速BEAS-2B细胞的恶性转化。
NNK与RRM2-C2第48页
（A） 采用CCK-8增殖试验检测NNK处理24小时后BEAS-2B细胞的活性。
（B） 嵌合RNARRM2-C2第48页用NNK处理BEAS-2B细胞后用qRT-PCR检测。
（C） 慢病毒载体模型。
（D–G）蛋白质印迹分析。（E）表达水平的量化RRM2-C2第48页，（F）建议零售价2、和（G）C2或48.
（H） NNK处理后BEAS-2B、BEAS-2B-V和BEAS-2B-RC的软琼脂糖集落形成检测的代表性图像。
（一） 软琼脂糖菌落形成结果的量化。
（J） 软琼脂集落形成测定中使用的NNK剂量。
（K） 两组28天以上肿瘤生长量；肿瘤体积以mm表示三数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。学生的t吨测试用于数据分析。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
RRM2-C2或48过度表达促进BEAS-2B细胞的生长
CCK-8、平板集落形成和流式细胞术检测稳定过度表达RRM2-C2第48页研究细胞功能RRM2-C2第48页CCK-8检测结果显示，与BEAS-2B和BEAS-2B-V细胞相比，BEAS-2B-RC细胞具有更高的光密度值，表明RRM2-C2第48页过度表达促进细胞增殖（p<0.05，A） ●●●●。如中所示B和4C，BEAS-2B-RC细胞的集落形成效率（50.50%）高于BEAS-2B和BEAS-2B-V细胞（分别为33.66%和34.33%）。此外，RRM2-C2第48页过度表达增加了菌落形成率（p<0.05，B和4C）。凋亡的BEAS-2B和BEAS-2B-V细胞的百分比高于凋亡的BEASC-2B-RC细胞的百分比（p<0.05，D和4E）。调查其机制RRM2-C2第48页我们分析了G0/G1期和S+G2/M期细胞周期同步化后的细胞周期进展。我们的结果表明RRM2-C2第48页过度表达促进G0/G1期进入S+G2/M期，并抑制S+G2/M期退出G0/G1-期（均p<0.05，F和4G），这表明RRM2-C2第48页过度表达也促进了细胞周期的进展。
过度表达的影响RRM2-C2第48页在BEAS-2B细胞中
（A） CCK-8分析。
（B） 平板菌落形成分析的代表性图像。
（C） 平板菌落形成分析结果的量化。
（D） 通过流式细胞术进行凋亡分析的代表性图像。
（E） 细胞凋亡的量化。
（F） 通过流式细胞术进行细胞周期分析的代表性图像。
（G） 细胞周期分析的量化。数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。数据分析采用单因素方差分析和Dunnett t检验。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.05。
RRM2-C2第48页击倒抑制了RRM2-C2第48页-BEAS-2B细胞过度表达
为了进一步确定NNK对细胞增殖的影响是否通过RRM2-C2第48页如前所述，我们设计了一种靶向融合连接位点（siRC）的小干扰RNA（siRNA）。32siRC有效地沉默了嵌合RNARRM2-C2第48页但不影响其亲本基因建议零售价2和C2或48(B–5D和A–6C）。与CCK-8分析结果相比RRM2-C2第48页过表达实验，一种siRNA靶向RRM2-C2第48页抑制对照BEAS-2B-RC细胞和NNK处理的BEAS-2B细胞的增殖（均p<0.05，E和D） ●●●●。平板集落形成分析显示，siRNA靶向性RRM2-C2第48页与相应的对照细胞相比，菌落形成率降低（均p<0.05，F、 5G中，E、 和6F）。此外，RRM2-C2第48页敲除显著增加细胞凋亡（p<0.05，H、 5I中，G、 和6H）。与此同时，RRM2-C2第48页缺陷诱导对照BEAS-2B-RC细胞和NNK处理的BEAS-2B细胞的细胞周期阻滞（p<0.05，J、 5公里，I、 和6J）。总的来说，这些结果表明RRM2-C2第48页调节细胞生长，可能参与肺癌的发展。
沉默的影响RRM2-C2第48页在BEAS-2B细胞中过度表达RRM2-C2第48页
（A–D）蛋白质印迹分析。（B）表达水平的量化RRM2-C2第48页，（C）建议零售价2、和（D）C2或48.
（E） CCK-8分析结果。
（F） 平板菌落形成分析的代表性图像。
（G） 平板菌落形成试验的定量。
（H） 通过流式细胞术进行凋亡分析的代表性图像。
（一） 细胞凋亡的量化。
（J） 通过流式细胞术进行细胞周期分析的代表性图像。
（K） 细胞周期分析的量化。数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。数据分析采用单因素方差分析和Dunnett t检验。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
沉默的影响RRM2-C2第48页在2B-NNK细胞中
（A–C）（A）表达水平的量化RRM2-C2第48页，（B）建议零售价2、和（C）C2或48.
（D） CCK-8分析。
（E） 平板菌落形成分析的代表性图像。
（F） 平板菌落形成试验的定量。
（G） 通过流式细胞术进行细胞凋亡分析的代表性图像。
（H） 细胞凋亡的量化。
（一） 通过流式细胞术进行细胞周期分析的代表性图像。
（J） 细胞周期分析的量化。数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。数据分析采用单因素方差分析和Dunnett t检验。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
RRM2-C2第48页通过调节细胞生长miR-219a-2-3p
探索RRM2-C2第48页，对BEAS-2B-V和BEAS-2B-RC细胞进行转录组测序分析。根据p值<0.05和倍数变化>1.5的截止标准，检测到49个上调的microRNAs（miRNAs）和77个下调的microRNA(A） ●●●●。
的监管效果RRM2-C2第48页关于microRNA
（A） BEAS-2B-RC细胞与BEAS-2B-V细胞的火山图比较。
（B） 过度表达细胞中miRNA表达水平的量化RRM2-C2第48页.
（C） 量化miR-219a-2-3p沉默后的表达式级别RRM2-C2第48页.
（D） 的靶基因miR-219a-2-3p用于KEGG途径和GO富集分析。
（E和F）KEGG途径富集分析和（F）GO预测靶基因富集分析miR-219a-2-3p数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。学生的t吨数据分析采用单因素方差分析和Dunnett t检验。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
首先，通过qRT-PCR验证表达水平变化最大的10个miRNAs。qRT-PCR结果表明miR-219a-2-3p当RRM2-C2第48页通过慢病毒载体过度表达，沉默后其表达水平降低RRM2-C2第48页通过siRNA（p<0.05，B和7C）。然而，miR-9-3p和miR-323a-3p未受影响（p>0.05，B） ，其余低表达的miRNAs无法检测到。接下来，使用两个数据库（miRDB和TargetScan）miR-219a-2-3p目标基因预测，并将预测的目标基因用于基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径富集分析。miR-219a-2-3p通过miRDB数据库发现有362个预测的靶基因，通过TargetScan数据库发现有198个预测的目标基因。因此，484个预测的靶基因被用于KEGG通路和GO富集分析(D） ●●●●。KEGG和GO富集分析表明miR-219a-2-3p可能，至少在一定程度上，由癌症相关通路、p53信号通路和蛋白多糖的调节介导(E） ，以及生物过程，细胞生长(F） ●●●●。这些结果进一步表明RRM2-C2第48页可能通过调节细胞生长miR-219a-2-3p.
讨论
在本研究中，我们通过对BEAS-2B和2B-NNK细胞的RNA测序分析，鉴定了潜在的嵌合RNA。为了降低嵌合RNA鉴定的假阳性率，采用SOAPfuse和INTEGRATE两种方法鉴定嵌合RNA。SOAPfuse的优点是检测效率更高，消耗的计算资源更少，35而INTEGRATE在融合RNA鉴定中具有更高的准确性。36
NNK被视为烟草烟雾中的主要致癌物，因为它通过多种机制诱发肺癌，如产生DNA加合物和诱导DNA突变、DNA甲基化和免疫抑制。37最近，嵌合RNA被确定为新的肺癌生物标记物，但其在介导吸烟效应中的作用尚未被研究。我们探讨了吸烟是否调节嵌合RNA以及嵌合RNA是否在吸烟诱导的肺癌过程中发挥作用的问题。
嵌合RNA是多年前发现的，但该领域的大多数研究都集中在由融合基因产生的RNA嵌合，而较少关注由顺式-SAGe公司。38此外，没有专门用于识别的定制软件顺式-SAGe嵌合RNA或反式-拼接嵌合RNA。因此，我们使用了一种基于以下特征的特定筛选方法顺式-SAGe嵌合RNA并专注于来源于顺式-SAGe研究其在吸烟诱发肺癌中的作用。我们鉴定了三种嵌合RNA，RRM2-C2第48页,CTBS-GNG5、和SLC35A3-HIAT1型并通过RT-PCR和Sanger测序进行了确认。RRM2-C2第48页和CTBS-GNG5被发现是由顺式-SAGe公司。尽管SLC35A3-HIAT1型无法通过实验验证，它具有与顺式-SAGe嵌合RNA，表明筛选方法在鉴定顺式-SAGe嵌合RNA。
高表达水平RRM2-C2第48页已在鼻咽癌和结直肠癌细胞中检测到。31,32一贯地，RRM2-C2第48页发现在2B-NNK细胞和其他肺癌细胞系中高表达，表明RRM2-C2第48页广泛表达于鼻咽癌、结直肠癌和肺癌细胞中。此外，我们的分析表明RRM2-C2第48页在肺癌组织中富集，而在非癌肺组织中低水平表达。与此同时RRM2-C2或48根据一大群肺癌患者，发现表达水平与临床分期、N分期、M分期和吸烟状态相关。因此，我们确认了RRM2-C2第48页在肺癌细胞和组织中。此外，根据上述结果，我们建议RRM2-C2第48页可能是参与吸烟诱发肺癌的关键功能分子。然而，烟草特异性致癌物NNK与RRM2-C2或48需要进一步调查。
众所周知，吸烟是最重要的致癌因素之一，持续吸烟者一生中患吸烟相关癌症，尤其是肺癌的风险高达25%。39我们调查了烟草特异性致癌物NNK是否调节RRM2-C2第48页以及RRM2-C2第48页NNK诱发的肺癌。我们观察到急性和慢性NNK暴露都增加了RRM2-C2或48，同时过度表达RRM2-C2第48页可能加速了NNK诱导的非癌永生化支气管上皮细胞系BEAS-2B恶性转化的过程，这可能解释了非癌永化支气管上皮细胞异常高表达的原因RRM2-C2第48页2B-NNK细胞与BEAS-2B细胞比较。据我们所知，我们的研究首次报道了吸烟诱导的肺癌与嵌合RNA之间的联系，并揭示了嵌合RNA在肺癌病因中的新功能。
恶性肿瘤最重要的特征是细胞增殖失控和肿瘤无限生长。40先前的研究表明，NNK调节许多癌基因以增强细胞增殖、迁移和侵袭，从而诱发肺癌。41结合我们的数据，有理由推测NNK调节嵌合RNARRM2-C2第48页诱发肺癌。顺式-癌症中高表达的SAGe嵌合RNA通常在细胞生长中发挥作用。例如，静音D2HGDH-ga3st2型导致细胞生长显著下降，30
TSNAX-DISC1型促进细胞周期进展，42和DUS4L-BCAP29型调节胃癌细胞增殖。43
RRM2-C2或48已经证明可以促进结直肠癌细胞的生长和发育，但尚未对其在肺癌中的作用进行研究。我们显示过度表达RRM2-C2第48页增强BEAS-2B细胞增殖，而沉默RRM2-C2第48页导致BEAS-2B-RC和2B-NNK细胞增殖受到抑制。这些结果进一步表明RRM2-C2第48页增强细胞增殖，从而可能进一步加速肺癌的发展。
迄今为止，嵌合RNA的调控机制尚不清楚，但通常与亲本基因的调控机制相关，因为它们是同源序列。33然而，我们发现RRM2-C2第48页与建议零售价2或C2或48什么时候RRM2-C2第48页过度表达或沉默。这些发现表明RRM2-C2第48页具有不同于其亲本基因的独特调节途径建议零售价2和C2或48先前的研究表明，嵌合RNA的产物可能受非编码RNA的调控，如circRNAs和miRNAs，并且一些嵌合RNA具有与lncRNAs相似的功能。29,44,45因此，非编码RNA和嵌合RNA之间可能存在密切关系，但需要进一步的研究来证实这一点。在本研究中，我们对正常支气管上皮BEAS-2B细胞进行了RNA序列分析RRM2-C2第48页过度表达。我们发现了miR-219a-2-3p在以下情况下被上调RRM2-C2第48页在以下情况下过度表达和下调RRM2-C2或48沉默了。此外，miR-219a-2-3p已经发现可以调节垂体腺瘤细胞和甲状腺癌细胞的生长。46,47生物信息学分析用于预测miR-219a-2-3p，并且发现它们主要富集在“细胞生长”途径中。总之，这些结果表明RRM2-C2第48页/miR-219a-2-3p通路在细胞生长调控中可能起着重要作用。
先前的研究发现，嵌合RNA和非编码RNA之间存在一定的联系。例如，circRNA可以调节嵌合RNA翻译形成的嵌合蛋白的产生，从而发挥癌基因的功能（Panni等人，2020年）。秦福君等。发现嵌合RNASLC45A3-ELK4型通过其转录物而不是其翻译的蛋白质调节肿瘤细胞中的细胞生长，29这表明嵌合RNA不仅具有蛋白质编码基因的一般特性，而且具有与lncRNA相似的功能特性；因此我们推测融合基因可能影响miRNA。根据推测，我们初步探讨了嵌合RNA和miRNA之间的关系，发现miR-219a-2-3p与细胞生长途径相关，可能与RRM2-C2第48页这可能导致细胞一起恶性转化。
总之，我们的结果表明NNK可能通过嵌合RNA诱导肺癌，RRM2-C2第48页调节细胞生长。此外，miR-219a-2-3p可能是的目标RRM2-C2第48页在这个过程中。这些结果表明嵌合RNARRM2-C2第48页可能是肺癌的治疗靶点。
研究的局限性
因为研究人员发现嵌合RNA对正常细胞生长也很重要，我们的结果只表明RRM2-C2第48页在NNK诱导的肺癌过程中起致癌作用，这意味着它可能不是其他致癌过程中的致癌基因。在这项研究中，我们发现miR-219a-2-3p可能是的目标RRM2-C2第48页然而，我们没有进一步证明他们之间的关系，无论是直接的还是间接的。需要进一步研究证明RRM2-C2第48页到miR-219a-2-3p.
STAR★方法
实验模型和主题细节
肺癌细胞系95D、A549、H1299和人支气管上皮细胞系BEAS-2B来自美国型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。
用浓度为100 mg/L的NNK（Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA）处理BEAS-2B细胞。暴露24小时后，丢弃培养基，用PBS（PBS）洗涤细胞两次，并在新鲜的完整培养基中生长。当细胞80%融合时，将细胞传代。当细胞70%融合时，重复上述NNK暴露步骤，并将细胞传代至第六代。用软琼脂克隆形成率检测NNK诱导的BEAS-2B细胞恶性转化。这些细胞被指定为2B-NNK细胞。
BEAS-2B和2B-NNK细胞在支气管上皮基础培养基（BEBM；克隆学，瑞士巴塞尔）中生长，并辅以SingleQuots（克隆学）。95D和H1299细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）的RPMI-1640培养基（HyClone，Logan，UT，US）中生长。A549细胞在补充有10%FBS的F-12K培养基（HyClone）中生长。所有细胞在37°C下在含有5%CO2的湿润培养箱中孵育。
方法详细信息
NNK处理条件
将NNK（Sigma-Aldrich）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为1 g/mL。对于NNK暴露实验，将BEAS-2B细胞培养在6孔板中，最终浓度为0（0.1%DMSO，50，100，200或400 mg/L NNK，持续24小时。在多次NNK暴露实验中，细胞在6孔板中以100 mg/L NNK每4天培养24小时。必要时更换培养基或进行细胞亚培养。
患者和组织样本
在开始本研究之前，获得了所有患者的知情同意，并获得了南方战区司令部总医院和广州医科大学审查委员会的机构批准。从2013年8月至2019年6月在南部战区司令部总医院接受手术切除的81名患者中获取肺癌组织和成对相邻非肿瘤组织。如果患者在没有辅助化疗的情况下进行了肺癌的首次根治性切除，则纳入研究范围。所有组织样本均经病理检查证实。由于未检测到嵌合RNA的表达RRM2-C2第48页在一些样本中，最终获得了74例肺癌患者的数据。本文总结了74例患者的临床病理特征，包括性别、年龄、吸烟史、每日吸烟量、组织学、肿瘤淋巴结转移（TNM）分期、肿瘤大小、淋巴结分期和远处转移情况如果患者有以下任何状态，则被归类为“吸烟者”（每天吸烟至少6个月）：当前吸烟者；曾吸烟但在3年前戒烟或二手烟者（每周被动吸烟的患者）至少6个月。否则，患者被归类为“非吸烟者”。
RNA提取和PCR分析
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从细胞中提取总RNA。使用Multiskan Spectrum微孔板阅读器测定RNA浓度（BioTek，Winooski，VT，USA）。用PCR方法验证嵌合RNA的存在SLC35A3-HIAT1型,RRM2-C2第48页和CTBS-GNG5型使用SuperScript™IV一步法RT-PCR系统（美国纽约州格兰德岛生命科技公司Invitrogen）。PCR扩增在总体积50μL中进行，包括25μL 2×Platinum™SuperFi™RT-PCR Master Mix、2.5μL每个引物（10μM）、0.5μL SuperScript™IV RT Mix、基于RNA浓度的模板RNA和无核酸水。PCR循环参数如下：95℃变性2 min，95℃变性40个循环15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min。PCR引物序列如下：
SLC35A3-HIAT1型感官5-TGATGGAGACTGGTATCAAAGAA-3。
反义5ʹ-GCTGTCAATAGTCCCAAGC-3 \697]。
RRM2-C2第48页感应5ʹ-AGCTCATTGGATATTGC-3 \697]。
反义5ʹ-TTGGTCTCATCTCCCTCAC-3 \697]。
CTBS-GNG5感官5ʹ-TGGGATAAAGATCAGGGC-3 \697]。
反义5ʹ-GACTTCTGGTGTGAAGGG-3 \697]。
GAPDH公司感知5-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3。
反义5ʹ-GACTCCCGACCTTCACCTTCCC-3 \697]。
凝胶电泳
PCR产物用凝胶电泳分离。在100 V下，通过2%琼脂糖凝胶在1×三硼酸盐-EDTA缓冲液中电泳20微升每种PCR产物1小时。每个样本的两侧各有10微升50bp DNA标记梯。电泳后，使用GelView 6000Pro仪器对琼脂糖凝胶进行可视化和拍照（中国广州市广州生物光生物科技有限公司）。
PCR产物的纯化和Sanger测序
电泳后，在紫外光下采集含有PCR产物的琼脂糖凝胶片段，并使用E.Z.N.A.®凝胶提取试剂盒（美国佐治亚州诺克罗斯市欧米茄）进行纯化。使用活化吸附柱纯化和提取后，将PCR产物溶解在无菌水中，并在50°C下培养。使用Multiskan Spectrum微孔板阅读器（BioTek）测定纯化PCR产物的浓度。将合格样品发送给Sanger测序（Sangon Biotech，中国广州）。
反转录和定量PCR分析
cDNA是使用GoScript™逆转录系统试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）通过逆转录（RT）从总RNA中制备的。RT采用以下步骤进行：初始变性步骤在70°C下进行5分钟，4°C下变性5分钟，在25°C下退火5分钟，70°C延伸1小时，并在4°C保持。使用Applied Biosystems™7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument（Thermo Fisher Scientific）和GoTaq qPCR Master Mix（Promega）进行定量（q）PCR，以测量基因表达水平。采用以下循环参数进行qPCR：95℃变性2 min，95℃变性40个循环15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min。我们使用GAPDH公司作为内生控制。使用2-ΔΔCt方法。
按照制造商的说明，使用Bulge-Loop miRNA qRT-PCR起始试剂盒（中国广州市Ribobio）进行miRNA qRT PCR。我们使用6号机组作为miRNA-qRT-PCR的内源性对照。使用2-ΔΔCt方法。
细胞活力测定
按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；日本熊本Dojindo实验室）测量细胞增殖。简单地说，将细胞接种到96个培养皿中，每个培养皿中约有2000个细胞，然后培养0、24、48或72小时。孵育后，用PBS（PBS）洗涤细胞，向每个孔中加入10μL CCK-8试剂，并在37°C下再孵育1小时。然后使用Multiskan光谱微孔板阅读器（BioTek）在不同时间点测量450 nm处的吸光度。
慢病毒载体及其转染
人类RRM2-C2第48页利用BamHI（或BgII）和XhoI限制性位点（GenePharma，中国广州）将嵌合RNA克隆到pMSCV载体中。213个基点RRM2-C2第48页顺序如下：
5ʹ-ATGGAGTTCCCTCACTGGCCTGCTGGAGCTCATTGGATATTGCAC。
tctaatgaagatacattgagattgtggcagacagacttatgctggaactgggtgtgtgtgttagcaaggtgctggagaaccgtgagtgaaggtgagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaga。
用含有人类嵌合RNA的慢病毒载体感染BEAS-2B细胞系RRM2-C2第48页形成稳定转染细胞系。空载体用作阴性对照。选择细胞并保存在嘌呤霉素（4μg/mL）中。
蛋白质印迹
使用放免沉淀缓冲液（中国江苏贝尤蒂姆）在冰上放置30分钟，从细胞中提取总蛋白。然后在4°C下以14000 rpm离心细胞20分钟。蛋白质浓度使用双钦酸蛋白质检测试剂盒（Beyotime）进行测量。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Burlington，MA，USA），用补充有5%非脂肪乳和0.1%吐温20的缓冲液封闭，然后在4°C下与主要抗旗帜抗体（Abcam，Cambridge，UK）孵育过夜。使用抗β-肌动蛋白抗体（Abcam）作为蛋白质负荷控制。然后在黑暗中室温下将膜与二级抗体IRDye®800CW山羊抗兔IgG和IRDyde®800CW-山羊抗鼠IgG（LI-COR，Lincoln，NE，USA）孵育1小时。在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中清洗膜后，使用LI-COR Odyssey红外成像系统对标记的蛋白质带进行可视化。
RNA干扰
使用小干扰RNA（siRNA）敲除RRM2-C2第48页用Ribobio合成了双链定制siRNA分子。细胞接种在6孔板中，当细胞达到50-60%的融合时进行siRNA转染。根据制造商的协议，使用Lipofectamine®2000试剂（Thermo Fisher Scientific）进行siRNA转染。转染48小时后提取总RNA，通过qRT-PCR和western blotting测定基于siRNA的干扰效率。siRNA靶序列如下：
RRM2-C2第48页5ʹ-TTAGAGAGGTGCTGGAGA-3 \697]。
阴性对照siRNA 5ʹ-CGTACGCGGAATACTTCGA-3 \697]。
平板菌落形成试验
收获细胞，以每孔100个细胞的速度接种在6孔板中，并保持在含有5%FBS的BEBM培养基中（每3天更换一次）。14天后，用多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫染色。最后，统计染色菌落的数量。菌落形成效率由以下公式确定：菌落形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。
软琼脂糖集落形成试验
在六孔板的每个孔中预先涂上1.5 mL 0.6%琼脂，置于含有5%FBS的完整培养基中。收集细胞，将其悬浮在含有5%FBS的完整培养液中的0.35%琼脂中，然后在预处理的六孔板上一式三份（1.5 mL培养基，每孔5000个细胞）。然后将细胞在37°C下在含有5%CO的湿润培养箱中孵育2持续4周。对所得菌落进行拍照，并对大于0.05 mm的菌落进行计数。
肿瘤异种移植试验
以100 mg/L的浓度多次暴露NNK处理的BEAS-2B和BEAS-2B-RC细胞，用于裸鼠肿瘤发生实验。然后，将250万个细胞悬浮在150μL的Matrigel®基底膜基质高浓度（美国纽约州康宁市）和完整培养基的1:1混合物中，形成悬浮液。从广东省医学实验动物中心（中国广州）获得12只健康BALB/c裸鼠（雄性6只，雌性6只），随机分为两组（每组6只；雄性3只，雌性3只）。将悬浮液注射到每只裸鼠的右下腹股沟。从注射混合物后第7天到注射后第28天，连续观察和测量左腹股沟肿瘤体积。通过以下公式测量肿瘤体积来评估肿瘤体积的增加：体积（mm三)=（D2×d）×0.52其中D和D分别为裸鼠肿瘤直径的最长和最短。
流式细胞术分析
根据制造商的说明，使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（KeyGen Biotech，中国南京）评估细胞凋亡。简单地说，用胰蛋白酶（不含EDTA）采集的细胞用冷PBS洗涤两次，然后再悬浮在结合缓冲液中。然后将50微升细胞悬浮液（100000个细胞）转移到流式细胞仪管中，并添加5微升7-氨基放线菌素。在黑暗中培养5-15分钟后，向每个试管中添加450μL结合缓冲液和1μL膜联蛋白V-藻红蛋白。在黑暗中培养5-15分钟后，使用CytolFLEX细胞仪（Beckman-Coulter，Brea，CA，USA）进行流式细胞术分析。
使用细胞周期检测试剂盒（KeyGen Biotech）通过流式细胞术分析细胞周期的每个阶段。简单地说，收集细胞并用75%乙醇在4°C下过夜固定。然后在PBS中清洗细胞，并在室温下黑暗中用碘化丙啶/RNase染色缓冲液染色30-60分钟。使用CytolFLEX细胞仪（Beckman-Coulter）进行流式细胞术分析。
路径富集分析
基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）使用R软件（4.1.1版）进行富集分析。包“org.Hs.eg.db”用于标识反式利用GO和KEGG数据库，使用基因和包“clusterexplofiler”进行富集分析。统计显著性为p<0.05。
量化和统计分析
使用Prism软件（GraphPad Prism版本8.0.2）进行统计分析。各组之间的差异由Student’s分析t吨测试或单因素方差分析，然后进行邓内特t检验。直方图、折线图和个别数据点中的定量数据结果显示为平均值±SEM统计显著性为p<0.05。星号的含义是*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，****p<0.0001。
道德审批
本研究前获得了所有患者的知情同意，实验方案得到了南部战区总医院和广州医科大学人体实验伦理委员会的批准（许可方案：2017-532-18）。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（81773385 to Y.Q.）和广东省自然科学基金会（2019A1515011298 to Y.Q）的资助。
作者贡献
周家珍和杨巧媛进行了研究方案和实验设计。周家珍和关新超进行了实验操作、数据收集和统计分析。杨巧媛、周嘉珍、关新超、周嘉欣和熊睿完成了论文的完整撰写、修订和审查。徐恩武提供了技术和物资支持。所有作者阅读并批准了最终论文。
工具书类
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