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感染免疫。2000年5月；68(5): 2566–2572.
数字对象标识：10.1128/iai.68.5.2566-2572.2000
预防性维修识别码：PMC97460型
PMID：10768945

外膜蛋白A、肽聚糖相关脂蛋白和小鼠脂蛋白的释放大肠杆菌细菌进入血清

朱迪思·赫尔曼,1,* 保罗·M·洛伊塞尔,2 梅根·M·特汉,1 詹妮弗·E·阿莱雷,2 莱诺拉·A·博伊尔,三 詹姆斯·库尼克,三 大卫·M·安德鲁斯,三 Kwang Sik Kim先生,4和H.肖·沃伦1,5
编辑：R.N.Moore
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

含有脂多糖（LPS）和三种外膜蛋白（OMP）的复合物由在人血清中培养的革兰氏阴性菌释放，并在败血症实验模型中进入循环。相同的OMP与交叉保护抗血清中的免疫球蛋白G（IgG）结合大肠杆菌J5（抗J5 IgG）。本研究旨在确定三种OMP。利用OmpA缺陷菌和重组OmpA蛋白进行免疫印迹研究，确定35-kDa OMP为外膜蛋白A（OmpA）。基于纯化蛋白的肽序列和PAL缺陷菌的免疫印迹研究，18-kDa OMP被鉴定为肽聚糖相关脂蛋白（PAL）。基于MLP缺陷菌的免疫学印迹研究将5-9kDa OM P鉴定为鼠脂蛋白（MLP）。这些研究确定了在败血症实验模型中释放到人类血清和循环中的OMP为OmpA、PAL和MLP。

细菌细胞壁成分释放到血液中被认为在革兰氏阴性败血症的发病机制中很重要。虽然先前的研究人员已经报道细菌会将脂多糖（LPS）释放到血清中(62,63)并进入流通领域(4,18,56,66)，尚未确定释放的细菌产品的完整成分。对于脓毒症中非LPS革兰氏阴性外膜成分（如外膜蛋白（OMP））的释放知之甚少。含有LPS、OmpA和另一种弱染色蛋白质（17kDa）的片段，是从与肠道沙门菌使用O链特异性抗LPS免疫球蛋白G（IgG）的马流产血清型细菌(20). 类似地，我们从与大肠杆菌细菌，使用O链特异性抗LPS IgG(29,30).

先前的研究表明，被动和主动免疫直接针对粗糙突变细菌，如肠球菌血清型明尼苏达Re595和大肠杆菌J5在实验和临床革兰氏阴性败血症中的保护作用(1,5,11,42,43,68). 保护作用归因于针对LPS保守核心成分（脂质A和核心低聚糖）的抗体。然而，很难证明粗菌株抗血清中含有交叉反应性抗脂A或抗核寡糖IgG(15,57)保护的确切机制仍不清楚，也存在争议。

我们已经证明，抗血清中的IgG升高到热灭活状态大肠杆菌J5（J5抗血清）与上述OMP-LPS复合物中释放到血清中的相同三种革兰氏阴性细菌OMP结合(30). OMP-LPS复合物也被释放到烧伤大鼠的血液中大肠杆菌O18K型+脓毒症(29). 此外，至少有一种估计分子量为18kDa的OMP是从OMP-LPS复合物中分离出来的，其形式是通过J5抗血清中的IgG从人类血清和脓毒症大鼠血浆中选择性亲和纯化的(29).

本研究旨在鉴定体外释放到人类血清中的35-、18-和5-9-kDa OMP(30)并在实验性革兰氏阴性败血症中进入循环(29)并与J5抗血清中的IgG结合。

材料和方法

菌种、培养基和生长条件。

大肠杆菌J5是J.C.Sadoff（沃尔特里德陆军研究所，华盛顿特区）赠送的礼物；大肠杆菌O18:K1:H7（指定大肠杆菌18公里+),大肠杆菌O18:K1−：G2A（O18:K1:H7的非封装衍生物，指定大肠杆菌O18K型−),大肠杆菌O8:K45:H1，大肠杆菌O16:K1:H6，以及大肠杆菌O25:K5:H1是A.Cross（马里兰州大学巴尔的摩癌症中心）赠送的礼物。OMP缺陷大肠杆菌K-12和大肠杆菌O18突变体和密切相关的OMP细菌用于免疫印迹研究。大肠杆菌O18 E91（OmpA-缺陷衍生物大肠杆菌O18:K1:H7）和E69（OmpA-还原衍生物大肠杆菌O18:K1:H7）如前所述生成(52).大肠杆菌K-12 1292年(39)J.-C.Lazzaroni（法国里昂克劳德·伯纳德大学）善意地提供了JC7752（1292肽聚糖相关脂蛋白[PAL]缺陷衍生物）和7752（p417）（JC7752的PAL还原突变）。大肠杆菌K-12（p400），CH202[PAL缺失突变大肠杆菌K-12（p400）]和CH202（pRC2）（CH202的PAL还原衍生物）由U.Henning（德国杜宾根Max-Planck-Institut für Biologie）善意提供(12). 这个大肠杆菌K-12突变，由于缺失下午1点基因，JE5505（F− 1po他的proA argE thi gal lac xyl mtl tsx)，其他方面相同1个月-含有MLP的阳性伴侣，JE5506（F− pps他的proA argE thi gal lac xyl mtl tsx)，由H.Nikaido（加州大学伯克利分校）善意提供(32).

细菌从储存在胰蛋白酶大豆琼脂（Difco）上的菌落培养到胰蛋白酶大豆肉汤（Difco.，Detroit，Mich.）中。培养基中添加卡那霉素（50 mg/ml）大肠杆菌K-12 CH202（pRC2）和氨苄西林（100 mg/ml）大肠杆菌K-12 JC7752（p417）维持质粒。细菌在37°C下培养，并剧烈搅拌至所需的生长阶段，然后收获，并在无菌生理盐水（5000至8000×克，8至10分钟，4°C）。

单克隆抗体。

制备了针对J5抗血清中IgG结合的三种OMP和针对大肠杆菌O18 LPS。为了生产抗OMP单克隆抗体，对BALB/c小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯河实验室）进行热杀、冻干免疫大肠杆菌按其他说明制备的J5疫苗(57). 将疫苗重新悬浮在无菌生理盐水（1 mg/ml）中。增加剂量（0.1、0.2和0.3 mg），每周腹腔注射三次，持续3周。加强针每月注射1至3个月，最后一次加强针在脾脏收获前3天注射。按照标准实验室方案采集脾细胞并与骨髓瘤细胞融合(27,36). 杂交瘤细胞系在添加葡萄糖（4.5 g/升）、，我-谷氨酰胺、20%热灭活胎牛血清（Mediatech）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）。

三种OMP在人血清中培养后暴露在细菌表面(30). 因此，最初通过细菌酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选单克隆抗体，使用血清暴露光滑大肠杆菌隔离(大肠杆菌O8:K45:H1、O16:K1:H6和O25:K5:H1）作为包被抗原，杂交瘤培养上清液作为一级抗体。然后用免疫印迹法检测与血清暴露细菌结合的抗体大肠杆菌O25:K5:H1细菌裂解物作为抗原，杂交瘤培养上清液作为一级抗体。使用MilliBlot-MP膜处理器（Millipore Corporation，Bedford，Mass.）应用初级抗体。按如下所述制备印迹。初步筛选后，通过限制稀释至每四个孔中一个细胞的方法对感兴趣的杂交瘤进行亚克隆，以获得具有强生长特性和具有以下结合特性的抗体高产的亚克隆。多克隆小鼠抗J5 IgG抗体作为阳性对照，免疫前血清作为阴性对照。针对OMP的抗体是根据与细菌裂解物中与抗J5 IgG结合的三个OMP分子量相同的条带的结合来选择的(30). 为了确认单克隆抗体与OMP结合，在电泳前用带有或不带有蛋白酶K的外膜进行免疫印迹，如前所述(30).

使用两种方法从如上所述分离的杂交瘤细胞系中制备大量单克隆IgG。针对三种OMP中的每一种和大肠杆菌用小鼠杂交瘤细胞系在BALB/c小鼠腹水中产生O18-LPS（单克隆抗O18-IgG）。产生抗O IgG的杂交瘤细胞系是A.Cross的恩赐(34). 腹腔内滴注0.5 ml纯烷（密苏里州圣路易斯市西格玛）（5×10）10天后6至10×106收集杂交瘤细胞，在Hanks平衡盐溶液（Mediatech）中洗涤两次，并腹膜内注射。每2至3天抽吸三次腹水(27). 针对18-kDa OMP的单克隆抗体也在人工毛细管细胞培养系统中产生（Cellmax；Cellco，Laguna Hills，Calif.）。药筒（Cellmax 011模块）接种2.5×107活细胞。培养基为Dulbecco改良的Eagle培养基（Mediatech），补充葡萄糖（4.5 g/升），我-谷氨酰胺、2.5-10%热灭活胎牛血清（Mediatech）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）。ELISA测定人工毛细血管细胞培养物中产生的IgG浓度为0.3至1.0 mg/ml。免疫印迹法显示，抗OMP抗体与LPS或人血清蛋白无交叉反应。单克隆抗O18 IgG抗体不会与其他生物体的LPS、OMP或免疫印迹法测定的人类血清蛋白发生交叉反应。

血清、抗血清、IgG和免疫球蛋白。

从2-3kg新西兰白兔（马萨诸塞州东布里奇沃特ARI育种实验室）和BALB/c小鼠的血液中制备血清和抗血清。热灭活疫苗的抗血清大肠杆菌如前所述，J5（J5抗血清）是从10只兔子的混合血中制备的(30,57). 小鼠抗血清大肠杆菌J5疫苗是从如上所述免疫的小鼠中收集的。一种大肠杆菌O18 O多糖，由纯化的O多糖结合到铜绿假单胞菌是a.Cross送的礼物(17). 兔O多糖抗血清大肠杆菌如前所述，每次接种10 mg疫苗制备O18 LPS（多克隆抗O18 IgG）(30). 所有血清在静脉穿刺后立即制备、校准并冷冻（−80°C）直至使用。热杀兔多克隆抗血清中的IgG大肠杆菌通过免疫印迹法，J5与正常人血清成分没有交叉反应。通过ELISA和/或免疫印迹法，多克隆抗O18 IgG抗体不会与来自异源细菌、OMP或正常人血清成分的LPS发生交叉反应。

从兔子和健康人类志愿者的血液中提取血清，将其放入含有无菌玻璃珠的无菌聚丙烯管中，以开始凝血。在室温下2小时后，通过离心（1000×克，10分钟，4°C）。立即使用血清或冷冻（-80°C）并在使用前立即解冻。

IgG从高免疫血清、人工毛细血管细胞培养上清液和硫酸铵沉淀腹水中通过蛋白质G-Sepharose 4快速流动柱（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）纯化(27,64). 用0.1 M甘氨酸（pH 2.7）从柱上洗脱结合的IgG，并立即用1 M Tris缓冲液（pH 9.0）中和。纯化的IgG用磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.2）透析并储存在−80°C下。通过ELISA测定蛋白质浓度(69)以及通过紫外线吸收(A类280).

根据制造商的说明和前面的描述，将IgG共价偶联到磁珠（BioMag胺终止8-4100，PerSeptive Diagnostics，Cambridge，Mass.）(30). 根据制造商的说明，将针对18-kDa OMP的单克隆IgG共价偶联到氰溴化物活化的Sepharose 4B珠（Pharmacia）。

免疫印迹法。

免疫印迹法用于检测抗血清和单克隆抗体与细菌（106/好吧），在18kDa OMP纯化过程中收集的样品，以及从与细菌孵育的人血清的滤液中亲和纯化的细菌抗原。所有样品都在样品缓冲液（2.5%十二烷基硫酸钠[SDS]、22%甘油、0.5%β-巯基乙醇和痕量溴酚蓝的Tris碱）中制备，在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并通过在4°C下施加200 mA恒定电流1小时，将其转移到硝化纤维素（加利福尼亚州赫尔克里斯的Bio-Rad实验室）中（加利福尼亚州旧金山的Hoefer Scientific Instruments）。用1%脱脂奶粉在TTBS（150 mM NaCl，50 mM Tris，0.1%吐温20[pH7.5]）中封闭硝化纤维素，用TTBS洗涤，用TTBS中的一级抗体培养，然后洗涤。主要抗体包括兔或小鼠J5抗血清（分别稀释500倍和4000倍）、针对三种OMP中每种OMP的小鼠单克隆抗体（浓度为1 mg/ml）或多克隆抗O18 IgG抗体（稀释500倍）。然后用生物素结合的抗兔或抗鼠IgG抗体（Vectastain；Vector Laboratories，Burlingame，Calif.）在TTBS中以1:240稀释培养30分钟，清洗，然后按照制造商的规定在亲和素和生物素化辣根过氧化物酶复合物的混合物中培养30分钟（Vectatain）。用PBS最终清洗后，过氧化物酶底物（2 ml 4-氯-1-萘酚，[3 mg/ml]，8 ml PBS，10μl 30%H2O（运行）2)已添加。反应在20到30分钟后停止。

18-kDa OMP的纯化。

18-kDa OMP的最终纯化程序包括：（i）制备细菌总膜，（ii）Triton X-100提取细菌膜，（iii）使用与6D7（抗18-kDa OMP单克隆抗体）结合的Sepharose珠进行亲和层析，以及（iv）反相高压液相色谱（HPLC）分离。净化步骤的详细信息如下所述。

细菌总膜是从中晚期培养物中制备的大肠杆菌O18K型−基本上如前所述(30,49). 除非另有说明，否则所有步骤均在4至6°C下进行。通过离心收集2升细菌培养物，并将所得颗粒重新悬浮在总共60 ml预冷的10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中，其中含有25%的蔗糖（wt/vol）和0.2 mM二硫苏糖醇（新泽西州费尔劳恩市费希尔生化公司）。将RNase和DNase（Sigma）分别添加到4μg/ml的最终浓度。通过在冰上超声处理悬浮液来破坏细胞（微切片，间隔60至90秒的30至60秒爆发，总超声处理时间为4分钟）。通过离心（10000×克40 min），收集上清液（体积60 ml）；将含有EDTA（25 mM）和二硫苏糖醇（0.2 mM）的15 ml HEPES缓冲液（pH 7.4）添加到60 ml中，以将蔗糖浓度调整为20%（wt/vol），EDTA浓度调整为5 mM。将样品分层到60%（wt/vol）蔗糖缓冲液上（每4.5 ml缓冲液中含有7.5 ml样品），并进行超速离心（100000×克，3小时，6°C）。通过用20号针头刺穿试管侧面并用1毫升注射器（约0.5毫升/试管，最终体积为5毫升）抽吸，收集界面上模糊的白色/黄色带中的细菌膜。用6升Tris-HCl（20 mM，pH 8）透析总膜。透析材料的最终体积约为每2升起始细菌培养物15毫升。

使用氮气加压系统和Diaflo超滤膜YM30过滤器（Millipore Company，Danvers，Mass.）将代表8升起始细菌培养物的60毫升透析总膜浓缩至36毫升，并用Triton X-100萃取。向膜中添加12毫升含有蛋白酶抑制剂4-（2-氨基乙基）苯磺酰基氟化物（Sigma）和EDTA的10%Triton X-100存于Tris-HCl（20 mM，pH 8.4）中[最终浓度：2.5%Triton X-100,0.5 mM 4-（2-氨乙基）苯硫酰基氟化物，5 mM EDTA]。样品在室温下培养30分钟，然后超速离心（TH641摆动式转子，100000×克，2小时，6°C）。将所得上清液（48 ml）以9至10 ml/h的速度通过5.5-ml小鼠单克隆IgG柱隔夜循环，以对抗与溴化氰活化Sepharose 4B珠共价偶联的18-kDa OMP（4°C）。清洗色谱柱（36 ml，2.5%Triton X-100在200 mM磷酸钠中，0.5 M NaCl[pH6.8]），然后在0.5和1%SDS中洗脱结合抗原（200 mM磷酸盐中，0.5 M NaCl[pH6.8]）。通过在Centricon Plus-20离心过滤装置（10-kDa截止值；Biomax-8系列；Millipore）中离心，将洗脱物浓缩至4ml。

将三毫升浓缩亲和纯化样品用于分析C4反相高效液相色谱柱（Vydac，Hesperia，Calif.），并使用5至95%乙腈–0.1%三氟乙酸–H的线性梯度洗脱2O，流速为1ml/min。以1分钟的间隔将级分收集到20μl双浓缩SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品缓冲液（在Tris碱中的5%SDS和44%甘油）中并冻干。用β-巯基乙醇（0.5%）和微量溴酚蓝将冻干样品重新悬浮在40μl水中，并加热（100°C，5至10分钟）。用抗J5 IgG或6D7（单克隆抗18-kDa OMP IgG）作为主要抗体，通过免疫印迹法对部分组分进行电泳和分析18-kDa-OMP。

纯化18-kDa OMP的测序。

C的峰值分数4HPLC分离在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝染色。然后从凝胶中切下轻微染色的18-kDa带，洗涤两次（50%乙腈，0.5 ml，3 min），并冷冻。在哈佛微化学设施中，利用Finnigan LCQ四极离子阱质谱仪上的串联质谱对凝胶中蛋白质的胰蛋白酶消化的两个肽进行序列分析。

重组OmpA。

325氨基酸成熟OmpA蛋白的编码区，不包括21氨基酸信号序列（GenBank登录号：。V00307版本)，通过PCR扩增来自大肠杆菌O18:K1:H7。OmpA-特异性PCR引物（OmpABac1[5′GACGACGACAGGCTCGAGAGAGAAACACCTG3′]和OmpABac2[5′GaGGAGAGCCCGGTTAGCTCTGTAC3′]）包含5′延伸，用于克隆到转移质粒pBACgus-2cp（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）。含有OmpA编码序列的转移质粒OmpA/pBACgus-2cp随后按照制造商的指示转染到Sf9细胞中的BacVector-2000 Triple-Cut杆状病毒DNA中（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）。扩增阳性重组体，并产生高滴度病毒，以在Sf9细胞中获得最大蛋白表达的10到20范围内的多重感染。最终的杆状病毒构建物包含OmpA编码序列，具有框架内氨基末端延伸（融合序列由pBACus-2cp转移质粒编码），其中包含肠激酶识别序列、S蛋白结合位点和多组氨酸尾。36.5-kDa（计算分子量）OmpA融合蛋白是通过多组氨酸亲和层析从杆状病毒感染的Sf9细胞裂解液中，经制造商指定的Talon钴金属亲和树脂纯化而成（加利福尼亚州帕洛阿尔托市Clontech）。

从血清暴露细菌的无菌滤液中亲和纯化OMP。

大肠杆菌O18K型+生长到中龄期，收获并清洗。将得到的细菌颗粒重悬于等体积的正常人血清（108细菌/ml）和氨苄西林（200μg/ml），并在37°C下在旋转转鼓上培养2小时。血清通过0.45μm孔径过滤器过滤以去除完整细菌。然后将血清滤液与抗体结合磁珠孵育。用于这些亲和力纯化研究的抗体包括多克隆抗O18 IgG抗体、来自J5抗血清的IgG和来自正常兔血清的Ig G。将200微升每个样品与之前在800微升PBS中清洗并重新悬浮的IgG结合珠培养。IgG的最终浓度为100微克/毫升。过滤血清的最终浓度是20%。反应混合物在4°C下培养16至20小时，并进行端到端混合。然后将试管置于强磁场中，从20%过滤的血清中分离出带有附加抗原的抗体结合珠，并用PBS清洗珠三次。通过在100μl SDS-PAGE样品缓冲液（2.5%SDS和22%甘油，Tris碱）中加热珠（5分钟，100°C），洗脱抗原。小心地从珠子中分离上清液，并添加β-巯基乙醇（0.5%）和微量溴酚蓝。然后在16%的凝胶上电泳20微升每个样品，并转移到硝化纤维素中。用小鼠抗J5 IgG、单克隆抗O18 IgG和针对每个OMP的小鼠单克隆抗体对斑点进行染色。如上所述，使用生物素化马抗鼠IgG作为二级抗体制备印迹。

结果

35-kDa OMP是OmpA。

我们根据表观分子量和带的电泳迁移率因煮沸而改变的事实假设35-kDa蛋白为OmpA（数据未显示）(31). 进行免疫印迹研究以鉴定该蛋白。的隔离大肠杆菌O18细菌，其中OmpA基因被删除，然后重新插入菌株(52)和重组OmpA在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到硝化纤维素中，并用作抗原。染色抗体包括抗J5 IgG和我们针对35kDa OMP（2D3）的单克隆IgG。抗J5 IgG和2D3与OmpA基因被删除的细菌裂解液中的35-kDa带没有反应，但与野生型菌株和基因被重新插入的菌株中的35kDa条带有反应（图。​（图1）。1). 重组OmpA经抗J5 IgG和2D3染色（图。​（图2）。2). 重组OmpA的分子量稍高，可能是因为重组蛋白上存在多组氨酸标签。这些结果表明，35-kDa OMP是OmpA，2D3是单克隆抗OmpA-IgG。

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OmpA缺陷细菌的免疫印迹。细菌生长到中对数期，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。细菌裂解物随后在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至硝化纤维素。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对35-kDa OMP的单克隆抗体（2D3；右）。细菌菌株：野生型OmpA+ 大肠杆菌O18:K1:H7（1车道）；E91，一个OmpA缺失的突变株大肠杆菌O18:K1:H7（2车道）；E69，一种OmpA-恢复的突变体大肠杆菌O18:K1:H7（3号车道）。分子量标记的位置（单位：千道尔顿）如左图所示。

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重组OmpA的免疫印迹。重组OmpA（每个面板的通道1）和大肠杆菌O18:K1:H7细菌（每个面板的泳道2）在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到硝化纤维素上。主要抗体包括多克隆小鼠抗J5 IgG抗体（左）和针对35-kDa OMP的单克隆抗体（2D3；右）。

18kDa OMP为PAL。

通过对纯化蛋白进行测序鉴定18-kDa OMP。使用含有EDTA的Triton X-100洗涤剂提取细菌总膜，并使用结合18-kDa OMP（6D7）的单克隆IgG从提取材料中亲和纯化18-kDAOMP。通过逆相C传代，蛋白质进一步纯化至同质性4HPLC柱。组分的免疫印迹显示，18-kDa OMP在95%乙腈下从色谱柱中洗脱。对含有18-kDa OMP峰的部分进行SDS-PAGE，用考马斯蓝对凝胶进行染色，从凝胶中切下单个轻度染色条带，并按照材料和方法（哈佛微化学，剑桥，马萨诸塞州）中所示的串联质谱法进行序列测定。获得了两个与PAL具有100%同源性的肽序列（10和14个氨基酸）（图。​（图3）。三).

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纯化18-kDa蛋白的肽序列。按照材料和方法中的说明纯化蛋白质。将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的轻度染色带切除，并用质谱法进行测序。胰蛋白酶消化后，获得两个肽序列。括号表示氨基酸已被合理确定；星号表示该氨基酸是等压的，不能通过质谱测序明确区分。所有其他氨基酸都具有最高的置信度。

免疫印迹研究证实了PAL的特性。的裂解液大肠杆菌K-12，其中PAL基因(交易所交易委员会)用抗J5 IgG或6D7作为第一抗体进行免疫印迹。抗J5 IgG和6D7与PAL缺乏细菌裂解液中的18-kDa带没有反应，但与野生型菌株和重新插入基因的菌株中的18-kDa条带发生反应（图。​（图4）。4). 这些结果表明，18-kDa OMP是PAL，6D7是一种单克隆抗PAL抗体。

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PAL缺陷细菌的免疫印迹。细菌的隔夜培养物在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。细菌裂解物随后在SDS–16%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至硝化纤维素。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对18-kDa OMP的单克隆抗体（6D7，右）。细菌菌株：大肠杆菌K-12 p400包含PAL（车道1）；CH202，一种PAL缺乏的突变体大肠杆菌K-12（p400）（2车道）；CH202（pRC2），CH202的PAL再存储突变体（车道3）；大肠杆菌K-12 1292包含PAL（车道4）；JC7752，1292（第5车道）PAL缺失突变株；和JC7752（第417页），JC7752的PAL重存储突变体（第6车道）。分子量标记的位置（千道尔顿）在左边。

5-9kDa的OMP是MLP。

基于其低分子量和尺寸异质性，我们假设5-9-kDa OMP是MLP(26). 因此大肠杆菌缺乏MLP的K-12（JE5505）及其MLP阳性，其他相同的伙伴（JE5506）被用作免疫印迹上的抗原（图。​（图5）。5). 一个印迹是用抗J5 IgG开发的，另一个印记是用我们的单克隆抗体1C7开发的。抗J5 IgG和1C7 IgG与MLP缺陷菌株细菌裂解液中的5-至9-kDa带没有反应。这些结果表明，低交叉反应OMP是MLP，1C7是抗MLP IgG。

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MLP缺陷细菌的免疫印迹。细菌生长至中对数期，并在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，所得细菌裂解物用作抗原。染色抗体包括多克隆兔抗J5 IgG抗体（左）和针对5-9-kDa OMP的单克隆抗体（1C7；右）。细菌菌株：大肠杆菌K-12 JE5505，一种MLP缺失突变株大肠杆菌K-12（2车道）；大肠杆菌K-12 JE5506，MLP-阳性，与JE5505（车道1）完全相同。分子量标记的位置（千道尔顿）在左边。

鉴定人类血清中培养的细菌释放的OMP。

我们之前的研究(30)和其他人一起工作(20)已经证明了大肠杆菌和沙门氏菌在OMP和LPS的人血清释放复合物中培养的细菌可以使用O链特异性抗LPS IgG亲和纯化。为了验证细菌释放到人血清中的OMP-LPS复合物中存在OmpA、PAL和MLP的假设，使用多克隆抗O18 IgG亲和纯化人血清无菌滤液中的LPS大肠杆菌O18K型+，一种对人类血清的杀菌活性具有耐药性的菌株(16)，如材料和方法中所述。为了进一步研究抗J5 IgG抗体与释放的OmpA、PAL和MLP的相互作用，滤液也与先前与兔抗J5免疫球蛋白偶联的磁珠进行培养。用鼠抗OmpA（2D3）、MLP（1C7）和PAL（6D7）单克隆IgG、鼠单克隆抗LPS（O链特异性）IgG和鼠多克隆抗J5 IgG对捕获的抗原进行免疫印迹。OmpA、PAL和MLP均在使用O链特异性抗LPS IgG亲和纯化的样品中检测到，表明细菌释放含有这些OMP和LPS的复合物（图。​（图6）。6). 在使用抗J5 IgG亲和纯化的样品中也检测到PAL，但未检测到OmpA或MLP（图。​（图6）。6). 使用正常兔血清中的IgG亲和纯化的对照样品的免疫印迹中未检测到OMP。在没有正常人血清的情况下，用氨苄西林在盐水中培养的无菌细菌滤液制备的对照样品中，仅出现OMP的轻微染色，表明血清因子在OMP的释放中很重要(29).

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将含有OMP的样品释放到人血清中的免疫印迹。大肠杆菌O18:K1:H7培养至中对数期，在37°C的温度下，在含有氨苄西林（200 mg/ml）的100%人血清中培养2 h，然后通过0.45μm孔径的过滤器去除完整的细菌。滤液与多克隆兔抗J5 IgG、多克隆兔O-链特异性抗LPS IgG和正常兔IgG（对照）孵育之前与珠子共价结合的。从小球中洗脱捕获的抗原，并用针对OmpA（2D3）、PAL（6D7）、MLP（1C7）、多克隆小鼠抗J5 IgG或针对O多糖链的小鼠单克隆IgG染色大肠杆菌O18 LPS，如上所示。用兔抗J5 IgG（泳道1）、兔O-链特异性抗LPS IgG（泳道2）和正常兔IgG（泳道3）亲和纯化样品。分子量标记的位置（千道尔顿）显示在每个面板的左侧。

讨论

这项研究确定了三种由大肠杆菌细菌体外进入人血清(30)在革兰氏阴性脓毒症动物模型中(29)作为OmpA、PAL和MLP。OmpA、PAL和MLP是结构外膜蛋白(三,10,39,45,54,58,61)在不同的肠道革兰氏阴性菌中高度保守(2,8,33,47). 非肠道革兰氏阴性菌中存在类似于每种蛋白的蛋白质(46,48,59). MLP和PAL是带有共价附着脂质的脂蛋白。OMP与LPS紧密相关(37,53). OmpA、PAL和MLP在革兰氏阴性脓毒症的背景下尚未被广泛研究，尽管几十年来人们已经知道许多与LPS相关的蛋白质具有生物活性(14,19,21,22,24,25,28,38,40,41,44,51,67).

OmpA，最初由Henning及其同事描述(23,31)，有325个氨基酸残基(13)并在SDS-PAGE上表现出热变性电泳迁移率(13,50). OmpA的N末端结构域由177个氨基酸组成，被认为可以八次穿过外膜(35). C末端结构域被认为突入周质空间。OmpA参与维持细菌的形状(58)，作为噬菌体受体和F介导结合的受体，可能具有成孔特性(60). OmpA增强巨噬细胞对LPS的摄取(38)据报道参与了大肠杆菌侵犯中枢神经系统(52). 强毒株的一个OmpA缺陷突变体大肠杆菌O18K1的毒性低于其OmpA+新生大鼠的亲本菌株和鸡胚败血症模型(65).

PAL最初由瑞穗进行描述和表征(47). 它有173个氨基酸残基，与肽聚糖层紧密结合，但不是共价结合(39,46,47). PAL在N末端区域有一个由22个氨基酸组成的疏水区域，该区域与外膜相互作用(39). C末端结构域参与与肽聚糖层的相互作用(39).

MLP，首先由Braun及其同事描述和描述(7,10,26)，是最丰富的外膜蛋白(10). MLP有58个氨基酸残基，以两种形式存在，一种是自由形式，另一种是通过C末端结构域与肽聚糖共价连接的形式(6,7). 最近Zhang报道，MLP在一种对LPS基因低反应的小鼠（C3H/HeJ）中诱导致死性休克(67). 此外，他们发现MLP与LPS在致死毒性方面具有协同作用。

我们之前已经证明，所有三种OMP的表位都暴露在已在人类血清中培养的细菌表面，抗血清被培养成大肠杆菌J5产生高滴度的抗体，这些抗体与细菌表面的相同三种OMP结合(30). 这两种蛋白中有两种是PAL和MLP，这令人惊讶，因为这两种蛋白质都位于深周质空间，并且只有短的N末端片段被认为与外膜相互作用(9,39). 因此，通过输注抗血清来提高外源光滑细菌菌株的清除率大肠杆菌J5(55)可通过抗血清中的免疫球蛋白与细菌表面的OmpA、PAL和MLP表位结合来介导。

先前的研究人员将LPS作为革兰阴性败血症中释放的主要细菌毒素。除LPS外的细菌膜成分的释放，无论是单独释放还是与LPS联合释放，都没有得到广泛研究。我们的研究表明，在人血清中培养的细菌除LPS外，还释放至少三种OMP。虽然目前的研究集中于我们证明的三种主要蛋白质与抗J5 IgG结合，但似乎其他细菌成分，包括额外的OMP，也可能存在于释放到血清中的含有OMP的片段中。

最近的研究表明，含有这三种OMP和LPS的复合物由大肠杆菌细菌进入人体血清(30)并进入脓毒症大鼠血液(29). 据我们所知，在脓毒症中，OmpA、PAL或MLP释放到血液中的情况以前没有描述过。研究表明，MLP对C3H/HeJ小鼠造成致命休克，表明至少一种OMP具有致病作用(67). 需要更多的研究来验证这三种OMP可能参与革兰氏阴性感染发病机制的假设。

致谢

这项工作得到了Shriners残疾儿童医院8510号拨款、美国海军拨款N0014-94-C-0021、美国国家卫生研究院拨款AI39617-02以及马萨诸塞州波士顿Charles H.Hood基金会的支持。

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文章来自感染与免疫由以下人员提供美国微生物学会