Ad26.COV2.S启动为基于mRNA的新型冠状病毒强化疫苗接种提供了坚实的免疫学基础

参与者

为了分析体液和细胞免疫反应，考虑到是否有足够的材料，随机选择了60名捐赠者。随机选择进行免疫分析的参与者接受Ad26.COV2.S的预接种，然后在±95天后进行Ad26.COV1.S、mRNA-1273或BNT162b2的强化接种（每组15人）。这与完整的原始研究组不同，在该研究组中，参与者在接种Ad26.COV2.S后的±84天内接受了第二次疫苗接种。在第0天（升压前）和第28天（升压后）采集血样，也采集非升压对照组的血样(图S1A） ●●●●。

PBMC和血清分离

在vactainer®SST管（BD）中收集血液，获取血清并储存在−20°C下，以供进一步实验。根据制造商的说明，从血液中分离PBMC，并在含有肝素锂作为抗凝剂的真空吸尘管中收集PBMC，方法是使用Lymphorep™（Stemcell Technologies）在50 mL SepMate™收集管（Stemcell Technologies公司）中进行密度梯度离心。简单地说，将血液在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释，加载到Lymphorp™上，并通过2000 g离心15分钟分离PBMC。PBMC在PBS中清洗3次，计数并在90%胎牛血清（FBS）中用10%二甲基亚砜（霍尼韦尔）在液氮中冷冻。

S1特异性结合抗体的检测

使用经验证的联络SARS-CoV-2 TrimericS IgG试验（意大利迪亚索林）检测血清样本中的抗S1免疫球蛋白（Ig）G抗体。^8,30检测下限（LLoD）设定为4.81结合任意单位（BAU）/mL，应答器截止值设定为33.8 BAU/mL。根据制造商的说明进行分析。

病毒中和试验（PRNT50）

在斑块减少中和试验（PRNT）中，检测血清样本是否存在针对祖先SARS-CoV-2以及Delta和Omicron（BA.1）变体的中和抗体。从临床材料中培养病毒，序列经下一代测序确认：D614G（祖先，GISAID:hCov-19/荷兰/ZH-EMC-2498）、B.1.617.2（Delta，GISAID:hCov-19/荷兰/NB-MVD-CWGS201159/2022）和B.1.1.529（Omicron BA.1，GISAID:hCov-19/荷兰/LI-SQD-01032/2022）。人气道Calu-3细胞系（ATCC HTB-55）用于培养病毒库和PRNT。Calu-3电池在添加谷氨酰胺、青霉素（100 IU/mL）、链霉素（100 UU/mL）和10%胎牛血清（FBS）的OptiMEM（Gibco）中培养。简言之，热灭活血清在OptiMEM中稀释两倍，无FBS，开始稀释比例为1:10，或者在S1特异性抗体水平>2500 BAU/mL的情况下，开始稀释浓度为1:80，加入60μL。将60μL OptiMEM培养基中每种SARS-CoV-2变体的400 PFU添加到稀释的血清中，并在37°C下培养1小时。将抗体-病毒混合物转移到Calu-3细胞上，并在37°C下培养8小时。细胞固定在PFA中，并用多克隆兔抗SARS-CoV-2核衣壳抗体（Sino-Biological）和二级过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体（Dako）染色。使用沉淀形成的3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物（TrueBlue；Kirkegaard&Perry Laboratories）开发信号，并使用免疫斑点图像分析仪（CTL Europe GmbH）计算每个孔的斑块数量。通过计算两种稀释液之间的比例距离来估算50%还原滴度（PRNT50），根据该比例距离计算终点滴度。每个平板上都有感染对照组（无血清）和阳性血清对照组（Nanogram®100 mg/mL，Sanquin）。PRNT50值低于最低稀释度的一个稀释步骤（PRNT50=10）归因于没有检测到中和抗体的样品。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

通过内部开发的ELISA测定抗祖先SARS-CoV-2和Delta和Omicron（BA.1）变异体的结合抗体。⁶¹简单地说，ELISA高结合EIA/RIA板（Costar）在4°C下隔夜涂上由祖先SARS-CoV-2（D614G）、Delta和Omicron BA.1变异体（Sino-Biological）产生的杆状病毒三体预融合His-tagged S蛋白（20 ng/well）。接下来，在37°C的TBS中添加0.01%吐温-20，用阻断剂印迹缓冲液封闭平板1小时。因此，清洗平板，并用4倍稀释系列的血清孵育，从37°C的1:40稀释开始，孵育2小时。血清孵育后，清洗平板并添加辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗人IgG（1:6000，Dako）。平板在37°C下培养1小时，用3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（KPL）清洗和显影。使用ELISA微量滴定板阅读器（无限F200，帝肯）在450 nm（OD450）的光密度下测量信号。通过减去OD620通道中的背景信号来校正OD450信号，根据最低和最高OD450值生成最小最大S曲线，并计算50%的终点滴度。

抗体依赖性细胞毒性（ADCC）

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）介导抗体的存在是在一个测定NK92.05-CD16细胞脱颗粒的既定试验中确定的。⁶²简而言之，在4°C的温度下，将高结合96-wells平板（Immunolon）涂上由祖先SARS-CoV-2（D614G）、Delta和Omicron BA.1变异体（SinoBiologicals）产生的杆状病毒生成的三体预融合His-tagged S蛋白（200 ng/well）。将平板封闭，清洗，并在37°C下用血清（稀释比例为1:160和1:640）孵育2小时。血清培养后，清洗平板，添加100.000 NK92.05-CD16细胞，并与CD107a结合^V450系列（1:100，克隆H4A3、BD）、Golgistop（0.67μL/mL，BD）和GolgiPlug（1μL/mL）。平板在37°C下孵育5小时，清洗并染色以获得CD56活性NK细胞^体育课（1:25，克隆B159，BD）和LIVE/DEAD固定水死细胞（AmCyan，Invitrogen，1:100）。细胞在4℃下染色30分钟，并在4℃的Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）中固定30分钟。在FACSLyric（BD）中获得活化的NK92.05-CD16细胞，并鉴定为CD56⁺CD107a型⁺细胞。选通策略如所示图S12A.通过减去PBS涂层板上测量的背景值来校正百分比。进行了两个独立的实验，一个是血清稀释度为1:160(图S12B） 另一个在1:640(图S12C） 因为一些样品在1:160的稀释度下显示出前酮效应(图S8D和S8E），这导致ADCC信号的代表性不足。主要数据采用平均值(图2B和2C）。

抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）

抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）介导抗体的存在是在测量S包被荧光珠吞噬作用的试验中确定的。²⁶使用单核细胞THP-1细胞系（ATCC，TIB-202™）测量ADCP。简言之，通过在37°C下将100μL珠子与100μg蛋白质孵育2小时，将荧光中性粒（FluoSpheres，Life Technologies）与来自祖先（D614G）SARS-CoV-2（Sino Biologicals）的生物素标记单体S蛋白连接。将血清以1:40至1:2560稀释度或1:2560至1:163000稀释度（如果S1特异性抗体水平>1000 BAU/mL）的4倍稀释系列添加到S涂层FluoSphere珠中，并在37°C下培养2小时。每个孔中添加50000个THP-1细胞，并在37°C下培养过夜，然后通过流式细胞术在FACSLyric（BD）中测量FluoSphere珠吞噬作用为PE-阳性THP-1。代表性稀释系列如所示图S4A.针对PBS对照校正ADCP百分比，并在20%的任意截止点测定终点滴度。

流式细胞术检测RBD特异性B细胞

使用荧光标记的SARS-CoV-2 RBD四聚体（SARS-CoV-2 RBD B细胞分析试剂盒，Miltenyi Biotec）测量RBD特异性B细胞。简言之，8–10×10⁶PBMC与重组SARS-CoV-2 RBD-四聚体孵育^体育课和RBD四聚体^PE-Vio770型染色RBD特异性B细胞。随后，用检测CD19的荧光标记抗体对细胞进行染色^{APC−维奥770}（克隆LT19），CD27^紫-亮FITC（克隆M-T271），IgG^紫罗兰色（克隆IS11-3B2.2.3），IgA^紫绿色（克隆IS11-8E10）和IgM^{空气污染指数}（克隆PJ2-22H3）。使用7-AAD进行活体染色。使用FACS Canto II（BD）对整个样品进行流式细胞术分析。使用FlowJo 10.8.1（TreeStar，Ashland，OR，USA）测定RBD-特异性B细胞、RBD-特异性记忆B细胞和RBD-特定IgG记忆B细胞的总比例。选通策略显示在图S3答：。

IFN-γ释放试验检测S特异性T细胞

SARS-CoV-2特异性T细胞的存在最初是通过商业上可获得的干扰素-5释放试验（IGRA、QuantiFERON、Qiagen）在全血中测量的。^63,64简单地说，用三种不同的SARS-CoV-2抗原孵育肝素化全血20–24小时，使用刺激CD4和CD8 T细胞的重叠肽组合，这些T细胞分别代表S蛋白（Ag1）的一部分、整个S蛋白（Ag2）、，或从完整的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型基因组（Ag3）遗传的特异性肽的组合。我们将重点放在这份手稿中的Ag2数据上，因为该刺激的肽组成与AIM和ELISpot中使用的重叠肽库相比最好。以丝裂原涂层管为阳性对照，载体涂层管为阴性对照。孵育后，通过离心获得血浆，并通过ELISA测定对抗原的反应产生的干扰素-5。减去从标准校准曲线中插入的NIL对照值后，结果以国际单位（IU）IFN-Ⅷ/mL表示。按照制造商的说明，本试验中的检测下限设置为0.01 IU/mL，响应器截止值设置为0.15 IU/mL，如之前的研究所用。¹⁰

IFNγELISPOT检测S特异性T细胞

使用IFNγELISpot检测SARS-CoV-2特异性T细胞。简而言之，用35%乙醇活化的-多屏幕®HTS IP滤板（Millipore）涂上抗人IFN-γ抗体（1-D1K，Mabtech；5μg/mL），并在4°C下培养过夜。接下来，用X-VIVO（Lonza）培养基+2%人AB血清（HS；Sigma）封闭平板。PBMC解冻，在IMDM（Gibco）+10%FCS中重新悬浮，并清洗两次。在X-VIVO+2%HS中，PBMC的浓度达到4×10⁶细胞/mL，并在37°C下静置1小时。SARS-CoV-2 S1和S2肽库（JPT肽技术）由15肽组成，与覆盖S蛋白的11个氨基酸重叠，以0.5 ug/mL的浓度进行刺激。所有刺激均一式三份。使用0.4%二甲基亚砜（Sigma）作为阴性对照，使用PHA（Remel Europe Ltd；4μg/mL）作为阳性对照。2 × 10⁵每孔加入PBMC，并在37°C下培养20–24小时。第二天，用PBS+0.05%吐温-20清洗ELISot板。RT时在0.05%Poly-HRP缓冲液（ThermoFisher）中添加抗人生物素化IFN-γ抗体（7-B6-1，Mabtech；1:1000）1.5小时，然后在RT时（黑暗中）在0.05%的Poly-HRP缓冲液中添加链霉亲和素-聚HRP（Sanquin；1:6000）1小时。使用TMB基板（Mabtech）开发斑点。使用AID ELISpot/Fluorospot阅读器对斑点形成细胞（SFC）进行量化，并计算至SFC/10⁶PBMC。每次刺激减去DMSO阴性对照的平均值。为了确定总S特异性SFC，使用了单独S1和S2肽库的SFC总和。≥50 SFC/10的抗原特异性反应⁶PBMC被视为阳性。当PHA阳性对照为阴性时，排除样本。

活化诱导标记物（AIM）检测S特异性T细胞

PBMC在添加有10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素（R10F）的RPMI1640培养基中解冻，并在37°C下用苯甲酸酶®（50 IU/mL；默克）培养30分钟。苯甲酸酶是在解冻过程中添加的一种核酸内切酶，用于提高PBMC的活力。随后，1×10⁶PBMC与内部开发的SARS-CoV-2肽池（15分钟，10次重叠，每肽1μg/mL）在37°C下孵育20小时，涵盖祖先、Delta或Omicron BA.1 S蛋白；以等摩尔量的二甲基亚砜作为阴性对照或PMA（50μg/mL）和离子霉素（500μg/mL）联合作为阳性对照刺激PBMC。刺激后，用各自稀释液中的以下抗体在4°C下对PBMC进行15分钟的表面标记染色：抗CD3^按CP（克隆SK7，BD，1:25），抗CD4^V450系列（克隆L200，BD，1:50），抗CD8^FITC公司（克隆DK25，Dako，1:25），抗CD45RA^PE−Cy7（克隆L48，BD，1:50），抗CCR7^BV711型，抗CD69^APC−H7（克隆FN50，BD，1:50），抗CD137^体育课（克隆物4B4-1，Miltenyi，1:50）和抗OX40^BV605型（克隆L106，BD，1:25）。包括LIVE/DEAD™Fixed Aqua DEAD Cell染色（AmCyan，Invitrogen，1:100）。T细胞被选为LIVE CD3⁺细胞并细分为CD4⁺或CD8⁺子集。记忆亚群被鉴定为CD45RA⁺CCR7号机组⁺（天真，T_N个)，CD45RA⁻CCR7号机组⁺（中央存储器，T_厘米)，CD45RA⁻CCR7号机组^-（效应器记忆，T_{相对长度单位})，或CD45RA⁺CCR7号机组^-（末端分化效应器，T_EMRA公司). SARS-CoV-2反应性T细胞在排除T细胞后被鉴定为活化T细胞_N个细胞（CD137⁺牛津40⁺用于CD4⁺，或CD137⁺CD69型⁺用于CD8⁺). 亚群和激活细胞的门控是基于DMSO刺激的样本，以供者为基础设置的。平均而言，在FACSLyric（BD）上获得300000个细胞。CD3门中计数<50000的样本被排除在分析之外。门控策略如所示图S6A.将LLoD设置为0.01%，以允许CD4内AIM+细胞的重复检测⁺或CD8⁺闸门。

作者贡献

概念化：P.H.M.v.d.K.、C.G.v.K.、R.d.d.v.形式分析：d.G.、R.d.d.v.、R.S.G.S.资金收购：R.d.d.v.、C.G.v.K.、P.H.M.v.d.K.、R.S.G.S、W.J.R.R.、v.A.S.H.d.、d.v.B.、N.A.K.、A.G.、d.F.P.、L.G.v.、A.L.W.H.、M.P.G.K.、A.S.调查：d.G.、R.S.G.S、d.v.B.、N.A.K.、W.J.R.R.、K.S.S.、S.B.、L.G.、N.J.N.、L.A.v.d.、M.L。V.A.S.H.D.、A.G.、D.F.P.、L.G.V.、A.L.W.H.、A.S.、A.G、R.L.D.S.、M.P.G.K.、P.H.M.V.D.K.、C.G.V.K.和R.D.D.V.监督：P.H.M.V.D.K.、C.G.V.K、R.D.D.V可视化：D.G.、R.D.V.写作-原稿：D.G、R.S.、R.D.V.写作：审查和编辑：所有作者审查和编辑最终版本。