细胞。2022年11月；11(22): 3650.
高循环三甲胺氮氧化物可能通过下调海马SIRT1加重血管性痴呆大鼠的认知功能障碍
,数据管理,形式化分析,调查,方法,资源,软件,写作——原稿,1,† ,2,† ,数据管理,形式化分析,调查,方法,资源,验证,2,† ,形式化分析,资源,2 ,1 ,概念化,资金获取,项目管理,监督,可视化,写作-审查和编辑,1,2,* ,概念化,监督,验证,写作-审查和编辑,三，*和2,*
杨登
1中国药科大学南京第一医院神经内科，南京210006
邹俊清
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
叶红
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
强鹏
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
欣欣付
1中国药科大学南京第一医院神经内科，南京210006
芮端
1中国药科大学南京第一医院神经内科，南京210006
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
陈杰（音译）
三南京第一医院人事科，南京210006
陈向良
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
亚历山德拉·帕西尼，学术编辑
1中国药科大学南京第一医院神经内科，南京210006
2南京医科大学南京第一医院神经内科，南京210006
三南京第一医院人事科，南京210006
†这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
收到日期：2022年10月11日；2022年11月14日验收。
- 数据可用性声明
在本研究期间生成或分析的所有数据均可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
氧化应激和炎症损伤在血管性痴呆（VaD）中起着关键作用。据报道，三甲胺氮氧化物（TMAO）是一种肠道微生物群代谢产物，可促进炎症和氧化应激，与多种疾病的病因有关。然而，这些影响尚未在VaD中进行研究。在这里，我们测试了预先存在的、循环的、高水平的TMAO是否会影响VaD诱导的认知衰退。给大鼠服用TMAO（120 mg/kg），共8周，这些大鼠在治疗4周后接受假手术或双侧颈总动脉（2VO）手术。术后四周，2VO大鼠出现海马依赖性认知功能下降和突触可塑性功能障碍，同时伴有氧化应激、神经炎症和细胞凋亡增加。术后4周，TMAO的给药增加了血浆和海马TMAO，进一步加剧了这些影响，导致认知和突触可塑性损伤加重，但Sham组没有出现这种情况。此外，TMAO治疗激活了NLRP3炎性体并降低了海马内SIRT1蛋白的表达。然而，由于SIRT1的过度表达，TMAO的这些作用显著减弱。我们的研究结果表明，TMAO通过抑制SIRT1通路增加氧化应激诱导的神经炎症和细胞凋亡，从而加剧VaD大鼠的认知功能障碍和神经病理学变化。
关键词：三甲胺氮氧化物、SIRT1、炎症、氧化应激、突触可塑性、血管性痴呆
1.简介
血管性痴呆（VaD）反映了由多种脑血管因素引起的认知问题的医学综合征[1,2]. 这些表现包括经历事件、情绪困扰和误解时的记忆力丧失[三]. 流行病学调查结果表明，大约有35600000人患有VaD，预计2050年前这一数字将达到100000000[4]. 然而，目前尚无有效的临床批准药物用于治疗VaD。因此，探讨VaD内的病理变化以及认知功能障碍的可能分子机制是非常必要的。
先前的研究表明，氧化应激和神经炎症是VaD发病的两个主要变量[5,6]. 氧化应激期间会产生过多的活性氧，活性氧的积累会破坏氧化和抗氧化系统之间的平衡，而氧化还原信号分子可以激活或调节NLRP3炎症小体触发[7]. 一旦激活，NLRP3招募ASC，促进前caspase-1转化为裂解caspase-1，随后将前IL-1β裂解为成熟形式[8]. 作为一种III类组蛋白去乙酰化酶，沉默信息调节器1（SIRT1）参与多种生物过程，如细胞周期调节、氧化应激和炎症反应[9,10]. SIRT1也参与调节NLRP3炎症小体的触发[11,12,13]. 此外，SIRT1调节BDNF的表达，被认为是突触可塑性和认知功能的强大调节器[14,15]. 然而，SIRT1是否调节NLRP3炎性小体激活并提高VaD大鼠的认知能力仍需澄清。
越来越多的证据表明，肠道微生物群的变化仍然与人类健康和疾病密切相关[14,15]. 三甲胺氮氧化物（TMAO）是一种源自肠道微生物群的特定膳食营养代谢产物，已被证明在心血管和中枢神经系统疾病中发挥关键作用[15,16,17]. 在肠道内，肠道微生物群将摄入的前体物质如左旋肉碱转化为三甲胺（TMA），随后通过肝脏黄素单加氧酶3（FMO3）转化为TMAO[18]. 一项特别调查发现，阿尔茨海默病（AD）和轻度认知障碍患者的循环和脑脊液（CSF）中TMAO浓度显著升高[19]. TMAO升高引发氧化应激和NLRP3炎性小体激活，导致炎性细胞因子的产生增加[20,21]. 此外，TMAO升高已被揭示为与认知损伤有关的机制，它加重了突触损伤[22]. 此外，Ke等人观察到，衰老期间循环TMAO升高可能通过抑制SIRT1表达和增加氧化应激而恶化内皮和血管功能[23]. 然而，高水平的循环TMAO水平是否通过调节SIRT1而加重了VaD认知障碍尚不确定。
本研究采用双侧颈总动脉闭塞大鼠模型，探讨TMAO对血管性痴呆的影响，并确定这种影响是否通过调节SIRT1的表达而介导。
2.材料和方法
2.1. 动物
雄性Sprague-Dawley大鼠（体重280-300 g；8周龄）购自南京大学（中国南京）模型动物研究中心。所有大鼠均置于动物室内，固定加热（21±2°C）、相对湿度（50±5%）、12小时黑暗/光照循环和随意喂食。所有检测均按照国家卫生研究院的指令进行，并通过南京第一医院动物研究与伦理委员会（方案编号：DWSY-2104386）接受。
2.2. TMAO治疗和实验模型
动物随机分为六组：Sham手术组（Sham）；TMAO组（TMAO）；2血管闭塞组（2VO）；2VO+TMAO组（2VO+TPAO）；2VO+TMAO+LV-NC组（2VO+TMAO+LV-NC）；2VO+TMAO+LV-SIRT1组（2VO+TPAO+LV-SIRT1）。在2VO建模之前，给大鼠连续4周给予TMAO水溶物（120 mg/kg）[24]而Sham组的小鼠则用无菌水喂养。手术前48小时用4%异氟醚麻醉大鼠，并放置在立体定向装置上（RWD Life Science，San Diego，CA，USA）。将5μL慢病毒（阴性慢病毒和LV-SIRT1；中国上海基因制药公司）直接注射到大鼠的右心室[25]. 随后，根据先前的研究，进行2VO建模以生成全局脑低灌注模型[26,27]. 简而言之，一个2厘米的中间切口暴露了双侧颈总动脉，颈总动脉与颈交感神经和迷走神经轻轻分离，然后通过4-0丝线永久结扎。Sham手术组进行相同的手术，但不包括结扎步骤。从手术后第二天开始连续给予TMAO 4周，随后进行行为测试。随后对动物实施安乐死，以便采集血液和大脑海马体样本用于生化和分子目的。
2.3. 高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定血浆和海马样品中的TMAO
通过HPLC–MS/MS检测TMAO血浆和海马的浓度。简单地说，将60μL样品与10μL由d9-TMAO在甲醇中组成的1 ug/mL内标物混合在1.5 mL Axygen试管中。离心提取样品蛋白质，将上清液（5μL）注入Waters BEH C18柱（2.1×50 mm，1.7μm，目录号03433919615148；美国马萨诸塞州米尔福德）进行分析，以0.4 mL/min的流速运行，LC-20AD岛津泵系统和SIL-20AXR自动取样器连接至Triple Quad 4500MD质谱仪（美国马萨诸塞州弗雷明翰AB SCIEX）。通过以不同比例混合溶剂A（水中0.1%甲酸）和溶剂B（甲醇中0.1%甲酸。采用多重反应监测（MRM）跃迁（m/z 76.1→59）和d9-TMAO（m/z 85.1→68.1）对TMAO进行量化
2.4. 野外测试（OFT）
通过OFT评估大鼠的一般运动活动，如前所述[28]. 将大鼠放置在黑盒子（100×100×40cm）的中心，然后自由移动。使用连接至Any-maze的摄像头记录进入中心区域的时间和总行程®tracker（中国上海新软信息技术有限公司）。每次试验后，用75%的乙醇清洁试验室并干燥以避免嗅觉提示。
2.5. 莫里斯水迷宫试验（MWM）
采用MWM测试评估大鼠的空间学习和记忆能力[29]. 简而言之，MWM设备由一个圆形、黑色、不透明的水池组成，平均分为四个象限。一个透明的圆形舞台位于水面以下2.00厘米处。采用EthoVision 3.0自动动物视频跟踪器（荷兰瓦赫宁根Noldus Information Technology B.V.™）。对每只大鼠连续5天进行四次训练试验。每天，将大鼠从四个点随机放入水中，直到它们找到舞台，并在60秒内停留15秒。当它们在不到60秒的时间内找不到平台时，它们被带到水下平台。在最后试验的第二天，移除阶段后，记录大鼠到达合并阶段的路径长度，并确定四个试验的平均值。
2.6. 尼塞尔染色
按照中所述进行尼塞尔染色[30]. 简单地说，将涂有石蜡的片段脱蜡并重新水化，然后在56°C下进行焦油紫处理1小时。然后，在完成染料去除后，用乙醇梯度浓度、二甲苯注入和中性胶密封对片段进行干燥。使用奥林巴斯显微镜（Olympus™，日本东京）在每个冠状断面上随机选择六个海马区进行定量分析。带有圆形胞体、细胞质Nissl物质和可见核仁的细胞核被鉴定为正常神经元，而排列紊乱、Nissl材料消失、周围有空洞和无法识别核仁的核被鉴定为受损神经元。Nissl阳性神经元%=阳性神经元/总神经元×100%。
2.7. 免疫荧光
麻醉后，大鼠暴露于冷PBS和4%多聚甲醛灌注。将大鼠大脑取出、固定、干燥，并切成10μm的片段。这些片段被渗透、封闭，然后用一级抗体抗NLRP3（1:100，#DF7438；Affinity Biosciences，辛辛那提，俄亥俄州，美国）、抗SIRT1（1:100、#8469；CST，美国马萨诸塞州波士顿）、抗8-OHdG（1:100；sc-66036；Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州，美国，和抗NeuN（1:100，ab177487；Abcam，Cambridge，MA，USA），在4°C下过夜。在三次TBST清洗步骤后，将片段与相应的荧光二级抗体孵育。随后，用DAPI（C1006；中国上海Beyotime）密封节段，用激光扫描共焦显微镜（德国Oberko蔡司8.0）成像，并用Image J软件定量。
2.8. 免疫组织化学（IHC）
将大鼠脑切片脱蜡、脱水、孵育，然后用抗原修复。冷却后，将切片渗透、封闭并与一级抗体NLRP3（1:100，#DF7438；亲和力）、抗3-NT（1:100、ab61392；Abcam）和抗SIRT1（1:100；#8469；CST）孵育，在4°C下过夜。接下来，将切片与相应的生物素化二级抗体孵育。用3,3-二氨基联苯胺（DAB）染色对切片进行可视化（Absin，中国上海），并在暗室中保存8分钟。所有图像均由奥林巴斯显微镜（Olympus™，日本东京）获得，并通过Image J软件进行定量分析。
2.9. 高尔基染色
高尔基体染色显示样本的神经元树突棘有细微的形态学变化。高尔基染色步骤按照制造商的说明进行（#PK401A；D Neurotechnologies™，美国哥伦比亚）[31]. 简单地说，将大鼠脑组织置于含有溶液a和B混合物的试管中，在无光环境中放置2周，然后与溶液C孵育3天。冠状切片（100μm）用低温恒温器切割（德国莱卡Wetzlar）。然后对切片进行染色、脱水并用二甲苯清除，然后用中性树脂清除。使用奥林巴斯显微镜（Olympus™，日本东京）获得神经图像。使用图像J量化顶端树突棘的数量。结果显示为每10μm顶端树突刺的数量。
2.10. 氧化应激参数测量
大鼠海马组织用冷盐水充分匀浆，然后进行4°C离心。因此，根据试剂盒协议，收集上清液并使用适当的试剂盒测量丙二醛（MDA；目录编号A003-1-2）、蛋白质羰基化合物（PCC；目录编号AO87-1-2），超氧化物歧化酶（SOD；目录编号为A001-3-2）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX；目录编号：A005-1-1）含量，从南京建成生物工程研究所（中国南京）采购。
2.11. 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍端标记（TUNEL）分析
石蜡包埋的脑段的TUNEL染色使用试剂盒（Roche Inc.，Indianapolis，IN，USA）按照试剂盒方案进行。通过Image J软件对海马体选定显微区域内TUNEL阳性细胞的百分比进行量化。
2.12. Western Blot分析
大鼠海马组织直接在冰上分离，用冰镇RIPA裂解液缓冲液均质，4℃离心。收集上清液，使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒量化蛋白质浓度®（Thermo Fisher Scientific，Inc.™，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。通过不同的SDS-PAGE方法分离蛋白质并转移到PVDF膜上。用抗PSD-95（1:2000，目录号20665-1-AP；Proteintech，中国武汉）、抗MAP-2（1:1000，#4542；CST，马萨诸塞州波士顿，美国）、抗突触素（1:1500，#SAB4502906；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、抗NLRP3；美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）、抗Bcl-2（1:1000，ab196495；美国马萨诸诸塞州坎布里奇市Abcan）、抗Bax（1:1000；#2772；CST，马萨诸塞州立大学波士顿市，美国）、抗CL-caspase-3（1:1000、#9661；CST、马萨诸塞洲波士顿市，美国）、抗SIRT1（1:1000和#8469；CST（马萨诸塞州波士顿，美国）或β-actin（1:1000）、#4970；CST。将膜与辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:3000；CST，马萨诸塞州波士顿，美国）孵育。最后，使用ECL试剂盒（德国达姆施塔特默克公司Millipore™）对条带进行可视化，并使用图像J对蛋白质条带密度进行量化。所有数据均以β-actin为标准。
2.13. 统计分析
所有实验的数据均反映为平均值±标准偏差（SD），并通过Prism 8软件（GraphPad™，加州圣地亚哥，美国）进行分析。MWM测试中的逃避潜伏期通过组间差异的双向重复测量方差分析（ANOVA）进行分析。其他数据通过单向方差分析和随后的Tukey-Kramer事后分析进行多重比较。第页<0.05具有统计学意义。所有实验均至少进行了三次运行。
3.结果
3.1. 经TMAO治疗的大鼠2VO手术后TMAO水平升高
通过HPLC-MS/MS测量TMAO治疗后大鼠血浆和海马中TMAO水平的变化。结果发现，连续8周饮用水中120mg/kg的TMAO剂量，使TMAO和2VO+TMAO组TMAO血浆水平显著升高(A） ●●●●。海马组织的TMAO含量分析显示，接受TMAO治疗的两组患者中，TMAO的含量也增加(B） ●●●●。这些数据集结果表明，服用TMAO溶液显著上调了血管性痴呆大鼠的TMAO血浆和海马水平。
2VO手术后TMAO治疗大鼠的TMAO水平增加。TMAO水平(一)等离子体和(B类)2VO手术前和术后4周用TMAO处理海马组织（n=6）。数据集反映了平均值±SD。*第页与Sham组相比，<0.05；#
第页与2VO组相比，<0.05。
3.2. TMAO加重2VO大鼠认知功能缺陷
为了确定TMAO治疗对2VO大鼠学习和记忆能力的影响，进行了OFT和MWM分析。与OFT期间的Sham大鼠相比，2VO大鼠的总行程和在中心的时间百分比大大减少(A、 B）。在TMAO治疗的2VO大鼠中，这些参数的下降进一步加剧，表明TMAO处理减弱了运动能力。随后，MWM数据集结果表明，与Sham组不同，2VO大鼠的平均逃避潜伏期延长，而TMAO组延长了这种延长的逃避潜伏期(C） ●●●●。所有组的游泳速度没有变化(D） ●●●●。这些结果表明，TMAO可加重2VO引起的认知功能障碍。此外，Nissl染色评估了氧化三甲胺对2VO手术大鼠海马神经元损伤的影响。与Sham组不同，2VO大鼠海马CA1区的Nissl阳性细胞减少。TMAO治疗显著增加了2VO诱导的CA1区神经元丢失(E、 F）。
TMAO加重了2VO大鼠的认知功能缺陷。(一)总行驶距离和(B类)使用野外测试测量各组在中心的持续时间（n=18）。(C类)逃逸延迟和(D类)在2VO手术后4周，在大鼠的隐藏阶段任务中记录各组的游泳速度（n=18）。(E类)通过尼塞尔染色检测各组大鼠海马CA1区神经元损伤的图像。比例尺，20μm（n=6）。(F类)日产汽车的量化+单元格显示为条形图（n=6）。数据集反映了平均值±SD**第页与Sham组相比<0.01；#
第页<0.05和##
第页与2VO组相比，<0.01。
3.3. TMAO减弱2VO大鼠海马突触可塑性
由于VaD大鼠大脑中存在树突状棘丢失[32]有必要对海马CA1区内的神经元标记物MAP-2和树突状棘顶密度进行研究。免疫荧光染色数据集结果表明，暴露于TMAO的2VO大鼠海马CA1区MAP-2显著下调(A） ●●●●。2VO大鼠的树突顶棘密度明显受损，TMAO治疗加重了树突顶刺的损伤(B、 C）。突触可塑性相关蛋白包括PSD95、MAP-2和突触素是大脑学习机制的关键部分[33].D-G显示，2VO处理后，PSD95、MAP-2和突触素的蛋白表达明显降低。TMAO治疗进一步下调了这些蛋白的表达。总之，这些数据表明，TMAO下调了2VO大鼠的突触可塑性相关蛋白，同时损害了突触功能。
氧化三甲胺减弱了2VO大鼠海马突触的可塑性。(一)代表性免疫染色显示海马CA1区内MAP-2（绿色）染色的神经元结构。细胞核进行DAPI染色。比例尺，20μm（n=6）。(B类)海马内高尔基染色神经元结构的代表性成像。比例尺，20μm。显微照片显示为200×（n=6）。(C类)顶端树突棘密度的量化如条形图所示（n=6）。(D类)各组大鼠海马内PSD95、MAP-2和突触素蛋白表达的代表性条带。β-actin作为负荷控制（n=6）。定量评估(E类)PSD95(F类)MAP-2和(G公司)突触素蛋白表达如条形图所示（n=6）。数据集反映了平均值±标准差*第页<0.05和**第页与Sham组相比<0.01；#
第页<0.05和##
第页与2VO组相比，<0.01。
3.4. TMAO诱导2VO大鼠神经细胞凋亡
然后我们评估了TMAO对2VO后神经元凋亡的影响。TUNEL/NeuN染色的数据集结果表明，TMAO治疗可加重2VO手术后大鼠海马CA1区的神经元凋亡(A、 B）。本研究还探讨了2VO大鼠海马组织中的凋亡蛋白表达。数据显示，2VO组Bax和caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调。TMAO暴露进一步推动Bax和裂解caspase-3上调，同时Bcl-2下调加剧(C、 F）。这些数据集结果表明，TMAO破坏了凋亡基因的动态平衡，从而促进了2VO诱导的凋亡。
TMAO诱导2VO大鼠神经元凋亡。(一)海马CA1区的TUNEL染色图像。比例尺，20μm（n=6）。(B类)TUNEL阳性细胞的定量显示为条形图（n=6）。(C类)各组大鼠海马内Bcl-2、Bax和裂解caspase-3蛋白表达的代表性条带。β-actin作为负荷控制（n=6）。量化(D类)Bcl-2(E类)Bax和(F类)裂解caspase-3蛋白表达如条形图所示（n=6）。数据集反映了平均值±SD*第页<0.05和**第页与Sham组相比<0.01；#
第页<0.05和##
第页与2VO组相比，<0.01。
3.5. TMAO促进2VO大鼠海马氧化应激
氧化应激损伤发生在VaD模型之后，因此我们测试了TMAO在2VO诱导的神经元氧化应激中是否起作用。A–D显示，大鼠CA1区8-OHdG荧光表达和3-NT阳性细胞在2VO后显著增加，而TMAO治疗可显著促进增加。接下来，我们检测了TMAO治疗后海马组织中PCC和MDA水平以及SOD和GPX活性。2VO组PCC和典型氧化介质MDA水平明显升高(E、 F）。相反，2VO组中两种典型的抗氧化酶SOD和GPX的活性显著受到抑制(G、 H）。TMAO处理进一步抑制了SOD和GPX活性，并显著提高了PCC和MDA水平。这些结果表明，TMAO可加重2VO大鼠脑内神经元的氧化应激损伤。
TMAO促进2VO大鼠海马氧化应激。(一)海马CA1区8-OHdG（红色）的代表性免疫染色。细胞核进行DAPI染色。比例尺，20μm（n=6）。(B类)8-OHdG平均荧光强度的量化如条形图所示（n=6）。(C类)免疫组织化学染色成像显示3-NT在海马CA1区表达。比例尺，20μm（n=6）。(D类)3-NT阳性细胞的定量显示为条形图（n=6）。(E类)PCC和(F类)MDA水平，以及(G公司)SOD和GPX(H（H）)根据试剂盒制造商的说明测量大鼠海马内的活动（n=6）。数据集反映了平均值±SD**第页与Sham组相比<0.01；#
第页<0.05和##
第页与2VO组相比，<0.01。
3.6. 2VO大鼠TMAO驱动海马NLRP3炎症激活
先前的研究表明，TMAO可能触发NLRP3炎症小体[20,34]. 关于探讨TMAO对2VO大鼠海马内NLRP3表达的影响，采用免疫荧光分析、免疫组织化学和Western blot来评估NLRP3的表达。双重免疫荧光染色显示，与2VO组相比，TMAO治疗可增加神经元中NLRP3的表达(A、 B）。同样，免疫组织化学证实了免疫荧光结果，表明TMAO给药明显增强了2VO大鼠海马NLRP3的免疫反应性(C、 D）。此外，我们还通过Western blot检测了NLRP3和IL-1β的蛋白丰度。NLRP3和IL-1β的蛋白表达在2VO大鼠海马内显著上调，这表明NLRP3在2VO-手术后被激活(E–G）。如前所述，TMAO治疗后这些蛋白的表达进一步上调。这些数据集结果为2VO后NLRP3炎性小体信号激活提供了进一步证据，TMAO促进NLRP3炎症小体激活。
TMAO驱动2VO大鼠海马NLRP3炎性体激活。(一)免疫染色显示NeuN（绿色）和NLRP3（红色）在海马CA1区内共定位。细胞核进行DAPI染色。比例尺，20μm（n=6）。(B类)NLRP3平均荧光强度的量化显示为条形图（n=6）。(C类)免疫组织化学染色成像显示NLRP3在海马CA1区的表达。比例尺，20μm（n=6）。(D类)NLRP3阳性细胞的定量显示为条形图（n＝6）。(E类)各组大鼠海马内NLRP3和IL-1β蛋白表达的代表性条带。β-actin作为负荷控制（n=6）。量化(F类)NLRP3和(G公司)IL-1β蛋白表达如条形图所示（n=6）。数据集反映了平均值±SD**第页与Sham组相比<0.01；##
第页与2VO组相比，<0.01。
3.7. TMAO降低2VO大鼠海马SIRT1的表达
关于探讨SIRT1参与2VO大鼠TMAO损伤，本研究随后研究了SIRT1蛋白表达的变化。双重免疫荧光染色显示，与2VO组相比，TMAO处理可以进一步下调海马神经元内SIRT1的表达(A、 B）。同时，大鼠脑组织切片的免疫组织化学染色显示出类似的趋势，表明TMAO给药显著降低了2VO组SIRT1阳性细胞(C、 D）。此外，Western blot结果显示，2VO大鼠海马内SIRT1的蛋白质丰度显著降低，TMAO治疗进一步降低了该表达水平(E、 F）。这些结果表明，TMAO可以下调2VO大鼠海马内SIRT1的表达。
TMAO降低了2VO大鼠海马SIRT1的表达。(一)免疫染色显示NeuN（绿色）和SIRT1（红色）在海马CA1区内共定位。细胞核进行DAPI染色。比例尺，20μm（n=6）。(B类)SIRT1平均荧光强度的量化显示为条形图（n=6）。(C类)免疫组织化学染色成像显示海马CA1区SIRT1表达。比例尺，20μm（n=6）。(D类)SIRT1阳性细胞的定量显示为条形图（n=6）。(E类)各组大鼠海马内SIRT1蛋白表达的代表性条带。β-actin作为负荷控制（n=6）。(F类)SIRT1蛋白表达的量化如条形图所示（n=6）。数据集反映了平均值±SD**第页与Sham组相比<0.01；##
第页与2VO组相比<0.01。
3.8. TMAO通过抑制2VO大鼠SIRT1降低突触可塑性并促进神经元凋亡
为了证明TMAO对2VO大鼠的上述影响是否由SIRT1介导，通过侧脑室向大鼠大脑注射SIRT1过度表达慢病毒（LV-SIRT1）。如所示A、 B，LV-SIRT1显著上调了TMAO引起的SIRT1蛋白水平的降低。随后，Western blot结果显示，TMAO治疗显著降低了PSD95、MAP-2和突触素的蛋白表达，SIRT1的过度表达阻止了这些降低(C–F）。此外，LV-SIRT1逆转了TMAO介导的神经元凋亡加重(G–J）。这些数据表明，TMAO通过抑制SIRT1降低了VaD大鼠的突触可塑性并促进了神经元凋亡。
TMAO通过抑制2VO大鼠的SIRT1降低突触可塑性并促进神经元凋亡。(一)各组大鼠海马内SIRT1蛋白表达的代表性条带（n=6）。(B类)SIRT1蛋白表达的量化如条形图所示（n=6）。(C类)各组大鼠海马内PSD95、MAP-2和突触素蛋白表达的代表性条带（n=6）。量化(D类)PSD95(E类)MAP-2和(F类)突触素蛋白表达如条形图所示。β-actin作为负荷控制（n=6）。(G公司)各组大鼠海马内Bcl-2、Bax和裂解caspase-3蛋白表达的代表性条带。β-actin作为负荷控制（n=6）。量化(H（H）)Bcl-2(我)Bax和(J型)裂解caspase-3蛋白表达如条形图所示（n=6）。数据集反映了平均值±SD。##
第页与2VO组相比<0.01；&
第页<0.05和&&
第页与2VO+TMAO+LV-NC组相比，<0.01。
3.9. TMAO通过基于SIRT1的通路促进2VO大鼠神经氧化应激和NLRP3炎症信号转导
接下来，我们还发现SIRT1的过度表达减弱了TMAO的促氧化作用，这可以通过增加SOD和GPX活性以及降低PCC和MDA水平来证明(A–D）。我们还通过Western blot检测了NLRP3炎性体的蛋白表达。经TMAO治疗后，NLRP3和IL-1β的蛋白表达显著上调，而LV-SIRT1明显逆转了这种上调(E–G）。这表明TMAO可能通过基于SIRT1的途径促进神经元氧化应激损伤和NLRP3炎性体信号传导。
TMAO通过基于SIRT1的途径在2VO大鼠体内促进神经元氧化应激和NLRP3炎性体信号传导。(一)PCC和(B类)MDA水平，以及(C类)SOD和(D类)根据试剂盒制造商的说明书测量大鼠海马内的GPX活性（n=6）。(E类)各组大鼠海马内NLRP3和IL-1β蛋白表达的代表性条带（n=6）。量化(F类)NLRP3和(G公司)IL-1β蛋白表达如条形图所示。β-actin作为负荷控制（n=6）。数据集反映了平均值±SD。##
第页与2VO组相比<0.01；&
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第页与2VO+TMAO+LV-NC组相比，P<0.01。
4.讨论
本研究证实，循环中TMAO升高可加重VaD大鼠的认知功能障碍。术后2VO大鼠出现认知功能障碍和神经死亡。当给予TMAO长达8周时，我们发现循环TMAO升高会损害VaD大鼠的学习记忆功能和突触可塑性，同时会增强2VO驱动的氧化应激、炎症和凋亡。此外，TMAO抑制SIRT1并上调NLRP3调节的炎症相关蛋白的表达，这可能是TMAO神经损伤的关键机制。
VaD是由长期脑灌注不足引起的第二种最常见的痴呆[35]. 2VO模型可诱导海马和皮层等脑组织的缺血和缺氧损伤，已广泛应用于VaD研究[36]. 作为肠道微生物的代谢产物，TMAO在中枢神经系统疾病中的作用越来越受到重视[37]. 一项研究表明，AD患者的TMAO上调与AD病理学和神经退行性生物标记物呈正相关[19]. 此外，TMAO抑制剂DMB可以降低循环TMAO水平，从而减轻APP/PS1小鼠的记忆认知功能下降[38]. 然而，先前存在的、较高的循环TMAO在VaD中的作用尚不清楚。本文中，我们观察到TMAO治疗显著增加了术后4周的血浆TMAO，这在2VO大鼠海马中也得到了证实。同时，OFT和MWM结果表明，TMAO治疗进一步加重了VaD大鼠的认知功能障碍。突触可塑性降低和蛋白质合成中突触可塑性相关的降低是大脑认知功能障碍的主要原因。值得注意的是，Li等人揭示，TMAO水平升高通过加重突触损伤与认知功能障碍表现出机械相关性[22]. 通过高尔基体染色，我们观察到循环TMAO升高导致2VO大鼠海马CA1区树突状棘顶端缺失。此外，我们还测定了突触塑性相关蛋白的蛋白表达。同样，我们的Western blot数据表明，循环TMAO升高可下调突触可塑性相关蛋白，包括突触素、MAP-2和PSD-95，从而导致大鼠认知功能障碍。
越来越多的证据表明，氧化应激是VaD的一个重要病理因素，通常会导致神经元严重受损[39,40]. 大量活性氧（ROS）的聚集导致NO的异常循环，加重VaD的损伤[41]. 先前的研究报告称，循环TMAO可能会穿越血脑屏障，导致氧化应激和随后的脑损伤[22,42]. 例如，TMAO可以通过下调海马内的蛋氨酸亚砜还原酶A（MsrA）来加剧氧化应激[43,44]. 与以往的研究一致，本研究发现VaD大鼠8-OHdG、3-NT、PCC和MDA表达上调，而SOD和GPX活性降低。TMAO治疗进一步加剧了这些情况。此外，氧化介质作为信使，驱动炎症小体激活，并在NLRP3炎症小体活化中发挥关键作用[45]. 触发的NLRP3炎性体将前caspase-1转化为功能性caspase-1，从而促进IL-1β成熟，并触发炎症和免疫反应[46,47,48]. 同时，大量快速生成的氧化物质可以激活NLRP3通路，进一步诱导细胞凋亡[49]. 有趣的是，TMAO可以驱动氧化应激触发NLRP3炎性小体信号，导致促炎性细胞因子释放[21]. 此外，以前的研究发现，TMAO可以降低MPC-83细胞内的细胞活力并促进细胞凋亡[50]，据报道，TMAO通过增加氧化应激诱导的细胞凋亡，加重高草酸尿诱导的肾损伤[51]. 然而，循环TMAO升高对血管性痴呆的影响是否与炎症小体激活和凋亡有关尚待阐明。为了探讨循环TMAO升高对VaD大鼠NLRP3炎性体和凋亡的影响，本研究探讨了相关蛋白质组生物标志物和TUNEL阳性细胞的表达。我们的研究结果表明，2VO模型触发了NLRP3炎症小体的激活和凋亡，这与之前的研究结果一致[52]. 相反，TMAO给药似乎进一步增强了炎症小体的激活和凋亡。
SIRT1是NAD+-依赖性III类组蛋白去乙酰化酶在中枢神经系统和脑功能发育中具有关键调节作用。目前，越来越多的数据表明SIRT1参与神经发生和突触可塑性[53,54]. 此外，作为一种多功能蛋白质，它通过组蛋白和非组蛋白的去乙酰化参与重要的生理功能，如代谢、衰老、氧化应激、凋亡和炎症[55]. 事实上，SIRT1对神经血管的保护作用已经与双侧颈总动脉狭窄引起的脑灌注不足有关[56]. 此外，Ke及其同事观察到，循环TMAO水平升高可能通过抑制SIRT1表达和增加氧化应激，加剧内皮细胞衰老和血管老化[23]. 然而，SIRT1是否与TMAO对2VO大鼠的破坏作用有关尚待确定。这项研究的结果清楚地表明，2VO模型显著下调海马内的SIRT1，而TMAO治疗后这种抑制作用增强。此外，当SIRT1通路通过脑室内注射LV-SIRT1慢病毒过表达时，TMAO对2VO诱导的突触损伤、氧化应激、NLRP3炎症小体激活和细胞凋亡的促进作用被消除。这些数据集结果表明，循环TMAO升高对VaD大鼠的损伤影响是SIRT1依赖性的。
值得注意的是，这项研究有一些局限性，包括氧化应激可以在初始阶段刺激神经发生，但我们在研究中更关注细胞凋亡。因此，神经发生将在未来的研究中进行研究。
总之，我们的研究发现，TMAO通过破坏突触可塑性、增加氧化应激和细胞凋亡，以及促进NLRP3炎性体的激活，恶化了2VO诱导的认知功能障碍。重要的是，我们的研究结果表明，TMAO对2VO大鼠的有害影响是由SIRT1介导的。总之，在血管性痴呆大鼠中，循环TMAO水平升高通过下调SIRT1而损害认知功能。
资金筹措表
本研究得到了国家自然科学基金（81701064）、南京市医学科技计划（JQX20007）、江苏省自然科学基金会（BK20220196）、中国博士后科学基金（2022M711666）和南京市第一医院星火人才计划的支持。
作者贡献
概念化，R.D.、J.C.和X.C。；数据管理，Y.D.、J.Z.和Y.H。；形式分析，Y.D.、J.Z.、Y.H.、Q.P.和X.F。；资金收购、R.D.和X.C。；调查，Y.D.、J.Z.和Y.H。；方法学，Y.D.、J.Z.和Y.H。；项目管理、R.D.和X.C。；资源、Y.D.、J.Z.、Y.H.、Q.P.和X.F。；软件，Y.D。；监管、R.D.、J.C.和X.C。；验证、Y.H.、J.C.和X.C。；可视化，J.Z.和R.D。；书面原稿，Y.D。；所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
机构审查委员会声明
动物研究方案由南京第一医院动物研究与伦理委员会批准（方案编号：DWSY-2104386）。
数据可用性声明
在本研究期间生成或分析的所有数据均可根据合理要求从相应作者处获得。
脚注
出版商备注：MDPI在公布的地图和机构隶属关系中对管辖权主张保持中立。
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