AlphaFold和NMR测定溶液中蛋白质结构的准确性

目标T1027

对于目标T1027，目标核磁共振系综比所有预测结构更准确。然而，AF2模型是预测结构的最佳评分，其中一个模型接近核磁共振系综的精度。到目前为止，这是一个相当平凡的结果。然而，通过更详细的分析，特别是对定义不明确的区域的分析，可以吸取有趣的教训。

T1027的CASP14评估仅限于核磁共振系综中所有19个模型中具有明确原子位置的残基。总共有四个地区被认为是不明确的，因此被排除在外(图2). 这也是许多核磁共振蛋白质结构验证程序的标准实践，这些程序通常只考虑由程序CYRANGE识别的定义明确的区域(Kirchner和Güntert，2011年). ANSURR验证的不同之处在于，它需要考虑整个蛋白质结构，因为排除残留物会导致附近区域变得过于灵活。

在单独的窗口中打开

图2

T1027的ANSURR分析

（A和B）蓝线表示RCI基于主干化学位移测量的刚度（BMRB:36288）；橙色线条显示了得分最高的核磁共振结构（系综中的模型11）的刚度（A）和得分最高的AF2模型（模型3）的硬度（B）。每个图顶部的红色条表示使用DSSP从结构评估的α-螺旋结构，蓝色条表示β-片。由CYRANGE定义为ill的区域以灰色表示。

另请参见图S1.

第二个ill-defined区域(图2，残基20–33）特别有趣。使用的核磁共振结构的作者¹⁵N弛豫色散和¹H（H）-¹⁵N个异核核过热效应（NOE）数据表明，该区域是动态的，并表明它是内在无序的。然而，ANSURR表明，它的灵活性远远低于其他三个定义不明确的区域，因此，尽管它是动态的，但它并不是内在无序的。该地区中部的灵活性也明显下降。这两个特征都反映在NMR结构的计算灵活性中，但不反映在AF2结构中。核磁共振结构在这个区域有一个短的α-螺旋，这会降低周围区域的灵活性，而这个区域在AF2结构中是完全无序的(图S1A和S1B）。我们的ANSURR分析表明，该区域是灵活的，与动态核磁共振测量结果一致，但并非本质上无序。因此，ANSURR表明，螺旋结构在大多数时间都存在于溶液中。

化学位移表明第三个不确定区域（残基82-94）高度无序。残基86-89之间的柔韧性略有降低。该区域在核磁共振系综中完全无序。模型11在该区域计算的柔度略有下降（如图所示图2A） 源于两个弱氢键，但在系综的任何其他模型中均未观察到。相反，AF2模型由一个松散的β-薄片状结构组成，由一个适度刚性的转弯连接(图S1C和S1D）。转弯的位置对应于根据化学位移，残基86-89之间柔韧性的降低，但更为刚性。所有五种AF2模型中都存在相同的β-片状结构，但相对于其余蛋白质的方向可变，可能表明存在动力学。事实很可能介于略微过于灵活的核磁共振结构和略微过于刚性的AF2结构之间。也就是说，溶液中的这个区域是动态的，可能是无序（核磁共振结构）和松散的β-片状构象（AF2模型）之间的过渡。

在第四个定义不清的区域（残基144–168）中，AF2模型包含一个不存在于NMR结构中的α-螺旋。ANSURR表明该区域具有高度的灵活性，因此不支持螺旋的存在。然而，¹⁵N弛豫弥散和¹H（H）-¹⁵N异核NOE数据表明该区域可能暂时采用二级结构(Wu等人。，2020). 考虑到化学位移代表了一个总体加权平均值，如前所述，位于该位置的α-螺旋似乎不会构成溶液中的主要构象(Huang等人。，2021).

总的来说，我们的分析表明，对于T1027，实验核磁共振结构比AF2结构更准确。然而，从局部细节来看，情况就不那么清楚了。其中一个原因可能是，这种蛋白质是特别动态的，不能用单一的结构很好地描述。我们的ANSURR分析还强调了验证核磁共振结构中未定义区域的重要性。这些区域可以采用广泛的部分有序结构。

目标T1029

T1029的最高岩心CASP14预测的GDT_TS只有45，这表明它和所有其他预测的构造都非常不准确。然而，我们的ANSURR分析表明，目标NMR结构实际上远不如许多预测的结构准确。事实上，51%的预测结构比得分最高的核磁共振模型具有更好的ANSURR分数。在本文的准备过程中，证实了核磁共振结构不准确(Huang等人。，2021). 发现用于生成原始NMR结构的NOESY峰列表缺少NOESY光谱中的许多峰。仔细重新选取NOESY峰并用于重新计算结构。然后，作者将AF2预测用于指导细化，将其称为“逆结构确定”。由此产生的核磁共振结构与AF2结构非常相似，并且ANSURR分数大大提高（绿色点位于图1). 即使如此，重新计算的核磁共振结构仍然比AF2结构稍差。更多详细信息请参见补充信息(图S2–S4).

所有可用人类AF2和NMR结构的比较

我们对CASP14的三个例子的分析表明，AF2预测的结构可以与NMR结构的精度相媲美，甚至超过NMR结构。为了更广泛地研究这一点，我们扩展了我们的研究，从最近出版的Alpha-Fold蛋白质结构数据库中比较了904种人类蛋白质结构(Varadi等人。，2022)与来自PDB的核磁共振结构对应物。ANSURR用于验证相应核磁共振谱系中的每个AF2结构和每个模型。为了简化对大量结构的分析，将ANSURR生成的相关性和RMSD得分相加，得到一个单一的准确度得分，如前所述，称为ANSURR得分(福勒等人。，2021). 个人相关性和RMSD得分见补充信息（数据S3–S5）。

图3A显示了AF2模型和来自相应NMR系综的模型之间的ANSURR分数的差异。AF2结构往往比NMR结构更准确，ANSURR评分的平均差异为28。ANSURR分数是从0到200的排名百分位数；因此，与NMR相比，AF2的这种差异表现出了更好的性能。我们之前展示过(福勒等人。，2021)核磁共振系综中不同结构的精确度差异很大。在图3B、 因此，我们将AF2预测与核磁共振系综的最佳评分模型进行了比较。ANSURR得分的差异现在仅为2，表明这两种方法的总体精确度非常相似，尽管差异很大。

在单独的窗口中打开

图3

AF2预测和NMR结构之间ANSURR分数差异的频率分布

数值以[AF2分数]-[NMR分数]表示，因此正差异表示AF2预测得分较高。选择标准概述于STAR方法.

（A） 比较AF2与核磁共振系综的平均ANSURR分数。平均差值为28。

（B） AF2与系综中单个最佳NMR结构（具有最佳ANSURR分数的NMR结构）的比较。平均差为2。

（C） 根据DSSP使用分类为α螺旋、β片或混合α/β的蛋白质确定的蛋白质二级结构分类，对（A）中的数据进行分解。

图3C根据常规二级结构含量描述了AF2和NMR结构之间ANSURR分数的差异。我们发现，β-表蛋白的准确性差异特别明显（平均差为45），而α-螺旋蛋白的准确性更接近（平均差17）。具有混合二级结构含量的蛋白质的差异介于两者之间（平均差异为29）。这些结果是有意义的，因为α-螺旋在局部几何形状上的变化有限，所以氢键（对赋予刚度很重要）在细化过程中相对容易获得。相反，β-板可以采用更广泛的局部几何形状，这使得正确解析氢键更具挑战性。我们之前已经注意到这种影响(福勒等人。，2021)并发现NMR结构在β-片中通常缺乏氢键。

对于一个新的蛋白质靶点，非专业人员可以在几分钟内生成AF2结构，而核磁共振结构通常需要数月的专业技能和设备。因此，一个简单的结论是，AF2更快、更便宜，至少也同样准确，因此应该是生成结构模型的首选方法。然而，实际情况更为微妙，我们通过更详细地查看一种方法比另一种方法有显著改进的实例来处理它。

Alpha-Fold结构比NMR结构更准确的示例

为了理解为什么AF2结构往往比NMR结构更准确，我们更仔细地观察了ANSURR分数比NMR至少高50分的AF2结构。有273座这样的建筑（占904座建筑的30%）。准确度的提高很大程度上源于AF2模型具有比NMR结构更广泛的氢键网络，这导致它们整体上更为严格，因此ANSURRMSD得分更高。我们之前已经注意到(福勒等人。，2021)核磁共振结构往往过于松散，通过添加氢键增加核磁共振结构的刚性通常会提高其ANSURR分数。氢键的位置当然必须是正确的，AF2提供了氢键位置的准确预测(Jumper等人。，2021).图4提供了两个示例。

在单独的窗口中打开

图4

AF2模型比NMR结构更准确的两种蛋白质的代表性ANSURR输出

每个面板以蓝色显示化学位移的刚性，以橙色显示结构刚性。每个图顶部的彩色条表示规则二级结构的区域：α-螺旋（红色）和β-片（蓝色）。这些结构以卡通形式显示在每个情节的旁边，主链氢键用灰色线条表示。

（A和B）来自人类Filamin-B的第二十个Filamin结构域。（A）是NMR结构（PDB:2DLG公司（B）是AF2型号（UniProt:{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“O75369”，“term_id”：“296434507”，“term_text”：“O35369”}}O75369号).

（C和D）锌指BED结构域包含蛋白质1的锌指BED-结构域。（C） 是核磁共振结构（PDB：2CT5型（D）是AF2型号（UniProt:｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“O96006”，“term_id”：“41018380”，“term_text”：“O96006”｝O96006号).

图4A和4B描述了人类Filamin B（一种相当刚性的蛋白质）第20个Filamin结构域的ANSURR输出，而图4C和4D描述了ANSURR输出，用于更灵活的锌指域。对于这两种蛋白质，AF2结构具有更大的刚性，并且与实验化学位移确定的刚性更好地匹配。对于Filamin域(图4A和4B），额外的氢键主要是更好地定义和延伸β片区域（并且更正确）。锌手指(图4C和4D）在残基16-30之间有一个大的柔性环，在核磁共振结构中完全缺乏任何主链氢键。然而，AF2结构在该区域包含六个主链氢键，因此环采用松散的β-片状构象。这些氢键的作用是降低整体柔韧性，更具体地说，是以一种能够更好地与从化学位移中获得的柔韧性相一致的方式，表明它们在溶液中持续存在。总之，我们认为AF2模型往往比NMR结构更好，因为它们不仅包含更多的氢键，而且还包含倾向于在溶液中存在的正确氢键。

NMR结构比Alpha-Fold结构更准确的示例

只有22例（904例中的2%）核磁共振结构的ANSURR分数比AF2结构至少大50。从ANSURR输出和结构检查中，我们发现有三个主要原因。

首先，在某些情况下，由于末端区域的差异，获得了更好的ANSURR分数，这可能是由于对仅代表整个蛋白质的一部分（例如，单个结构域）的结构体进行核磁共振测量而导致的。Alpha-Fold蛋白质结构数据库中的模型涵盖与特定UniProt登录号相关的整个序列，而许多NMR结构仅代表部分。因此，核磁共振结构中的末端区域可能比作为更大结构的一部分更无序/更灵活，这可以解释核磁共振和AF2结构在C末端的差异图5A和5B所示。中包含了一个更详细地概述这一点的示例图S5应该注意的是，因为我们使用了与核磁共振结构相关的化学位移，所以我们偏向于支持核磁共振结构。这使得AF2结构获得的高ANSURR分数更令人印象深刻。

在单独的窗口中打开

图5

核磁共振结构优于AF2模型的两种蛋白质的代表性ANSURR输出

配色方案图4结构以卡通形式显示在每个情节的旁边，主链氢键用灰色线条表示。

人类多囊蛋白2的（A和B）EF-hand结构域。（A） 是核磁共振结构（PDB：第2年第4季度（B）是AF2结构（UniProt:{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q13563”，“term_id”：“116242717”，“term_text”：“Q13563”}}问题13563).

（C和D）十二烷基磷胆碱（DPC）胶束中表皮生长因子受体的跨膜和近膜结构域。（C） 是核磁共振结构（PDB：2N5S型（D）是AF2结构（UniProt:{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P00533”，“term_id”：“2811086”，“term_text”：“PO0533”}}P00533号).

另请参见图S5和S6系列.

其次，一些AF2车型缺少正确的常规二级结构。示例如所示图5A和5B，其中NMR结构具有AF2结构中缺失的短β片区域。因此，AF2结构在残基732-738和763-771之间过于灵活。我们注意到AF2产生了自己的置信度，称为过残留局部差异距离测试（pLDDT）。AF2正确地表示该特定预测的置信度为“低”，平均pLDDT为66（最大值为100；图S6).

第三，一些AF2模型的二级结构不正确。图5C显示了膜相关α-螺旋的核磁共振结构，其断裂反映在由化学位移确定的柔韧性和计算的柔韧性中。相反，AF2结构没有断裂，这显然违反了核磁共振数据。如前所述，AF2正确地指示了预测中的“低置信度”，平均pLDDT为58，尤其是应包含突变的区域中的低置信度(图S6B） ●●●●。我们推测，AF2很难预测螺旋破裂，因为它们在晶体结构中不太常见（因为它们很难结晶，或者因为结晶稳定了未破裂的螺旋），因此在AF2训练数据中未得到充分的再现。

资源可用性

方法详细信息

我们感谢生物技术和生物科学研究理事会对N.J.F.（BB/P020038/1）的资助，以及推荐人提出的有益建议。