Changes in Immune Parameters Seen in Gulf War Veterans but Not in Civilians with Chronic Fatigue Syndrome

Quanwu Zhang; Xia-Di Zhou; Thomas Denny; John E. Ottenweller; Gudrun Lange; John J. LaManca; Marc H. Lavietes; Claudia Pollet; William C. Gause; Benjamin H. Natelson

doi:10.1128/cdli.6.1.6-13.1999

临床诊断实验室免疫学。1999年1月；6(1): 6–13.

数字对象标识：10.1128/cdli.6.16-13.1999

预防性维修识别码：PMC95652型

PMID：9874656

海湾战争退伍军人免疫参数的变化，但患有慢性疲劳综合征的平民免疫参数没有变化

张全武,^1,² 夏迪周,^三托马斯·丹尼,^1,⁴ 约翰·奥滕维勒,^1,² 古德伦·兰格,^1,⁵ 约翰·拉曼卡,^1,² 马克·拉维特斯,⁶ 克劳迪娅·波利特,^1,⁶ 威廉·C·高斯,^1,^三和本杰明·纳特尔森^1,^2,^*

张全武

环境危害研究中心，DVA医疗中心，E.Orange，¹和神经科学系，²儿科，⁴精神病学，⁵和医学，⁶新泽西州纽瓦克市新泽西医学院医学和牙科大学以及马里兰州贝塞斯达市卫生科学制服服务大学微生物系^三

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夏迪周

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托马斯·丹尼

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约翰·奥滕维勒

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古德伦·兰格

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约翰·拉曼卡

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马克·拉维特斯

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克劳迪娅·波利特

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威廉·C·高斯

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本杰明·纳塔尔森

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摘要

本研究的目的是通过评估淋巴细胞亚群（总T细胞、主要组织相容性复合体[MHC]I-和II限制性T细胞、B细胞、NK细胞、MHC-II限制性T-细胞衍生的原始和记忆细胞，以及几个MHC-I限制性T淋巴细胞激活标记）来评估免疫功能以及外周血淋巴细胞细胞因子基因表达（白细胞介素2[IL-2]、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、γ-干扰素[IFN-γ]和肿瘤坏死因子α[TNF-α]）的测量。受试者包括两组符合已公布的慢性疲劳综合征（CFS）病例定义的患者，一组是参加海湾战争回国后发病的退伍军人，另一组是偶尔发病的非永久性患者。病例对照对照组分别由健康的海湾战争退伍军人和非退伍军人组成。我们发现在非永久性人群中，任何免疫变量都没有显著差异。相比之下，患有CFS的退伍军人的总T细胞和MHC II显著增多⁺与相应的对照组相比，T细胞和这些淋巴细胞亚群的百分比显著升高，NK细胞的百分比显著降低。此外，患有CFS的退伍军人的IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平显著高于对照组。这些数据不支持CFS散发病例中CFS发生的免疫功能障碍假设，但确实表明，在波斯湾服役与因严重疲劳疾病回国的退伍军人的免疫状态改变有关。

慢性疲劳综合征（CFS）中出现的疲倦、不适和类氟症状的一种解释是，存在免疫失调，细胞因子水平增加。大量NK细胞活性降低的报告支持了这一假设(2,13)免疫激活标记物上调(19,36)以及血清中细胞因子水平的增加(4,21,28). 然而，这些结果并不一致。相反，一些研究人员没有发现免疫功能障碍的证据(29)而其他人仅在一部分CFS患者中发现对免疫功能障碍假说的支持(25)或仅在执行功能测试时(40).

我们有机会在两组CFS患者中进一步评估免疫功能障碍假说，一组是偶尔患病的平民，另一组是在海湾战争中服役后患病的退伍军人。在探索所获得的免疫学数据时，我们评估了三个假设：首先，与对照组相比，CFS患者会有免疫失调的证据，并且由于这组患者突然发病的频率增加，这在平民中更加明显(32); 其次，病情较重的患者、突然发病的患者和/或没有并发精神疾病的患者将表现出最显著的免疫失调；第三，根据Rook和Zumla的假设，一般CFS患者，特别是海湾战争退伍军人，会显示出2型细胞因子(33).

材料和方法

样品和数据。

这些患者是美国退伍军人事务部（DVA）海湾战争登记处的43名海湾战争退伍军人和68名非永久性退伍军人，他们最初都填写了健康问卷，以显示慢性疲劳综合征的症状。这些患者分别来到新泽西州的东奥兰治或纽瓦克，在那里他们提供了3小时的病史，并接受了体检、血液测试和精神病诊断面谈(24)由医疗和心理人员排除医疗和精神病(10)慢性疲劳的原因。这里研究的每个CFS患者都符合1994年的病例定义(10)CFS（有关摄入方案的详细信息，请参阅参考32). 根据活动减少的自我报告百分比以及CFS轻微症状的数量和严重程度，他们被评定为六类CFS严重程度。受影响最严重的患者，即患有严重CFS的患者，符合1988年的病例定义(14)经过以下修改：需要7个症状来满足标准，但只有在摄入前一个月，症状严重程度在症状强度量表上从0到5评定为3或更高时，才计算症状。此外，根据发病模式对患者进行分类，“突然”定义为疾病在1至2天内发展，“渐进”定义为发病更晚。

海湾战争登记处的34名海湾战争退伍军人和53名平民接受了健康的非药物控制。我们进行了一项健康调查，以确定健康的海湾战争退伍军人，然后招募他们进行研究。健康的非长生不老者是根据他们对报纸广告的反应和在邻近社区张贴的传单进行自我选择的。每周锻炼一次以上或患有Axis I精神障碍的健康非永生者被排除在外。这些标准不适用于健康的海湾战争退伍军人。

招募退伍军人仅限于新泽西州DVA医疗保健系统计算机数据库中的患者，以及海湾战争登记处登记的、居住在密西西比河以东10个州的主要疲劳患者。招募平民是指居住在我们中心100英里半径范围内的人。由于距离我们中心很远，退伍军人被VA医疗中心录取学习；非永恒的人来到中心的时间有限。

在获得书面知情同意后，受试者接受静脉穿刺，并在EDTA抗凝管中采集血液，这些抗凝管被编码为掩盖受试者的身份。收集后6小时内，用市面上可买到的针对以下细胞表面标记物的单克隆抗体组合标记外周血淋巴细胞（PBL）：CD45-CD14、CD3-CD8、CD3-CD4、CD3-CD19、CD3-CD（16+56）（Simulset试剂，Becton Dickinson[BDIS]，加州圣何塞）、CD8-CD38、CD8-HLA-DR、CD8-CD11b、CD8-CDM28、CD4-CD45RO、，和CD4-CD45RA（来自加利福尼亚州卡宾里亚DAKO的CD11b抗体；来自BDIS的所有其他抗体）。将样品固定在0.5 ml 1%福尔马林（无甲醇）中并冷藏过夜后，使用配备15 mW风冷488-nm氩离子激光的FACscan细胞仪（BDIS）和标准技术，在同一实验室中进行所有流式细胞术分析(9). 因此，对每组受试者的以下细胞群进行了量化：白细胞总数（WBC）；淋巴细胞的数量（和白细胞总数的百分比）；CD3的数量（和淋巴细胞总数的百分比）⁺（总T细胞），CD3⁺CD4细胞⁺（主要组织相容性复合体[MHC]II限制性T细胞），CD3⁺CD8（CD8）⁺（MHC I限制性T细胞），CD3⁻CD19编号⁺（B细胞）和CD3⁻CD（16+56）⁺（NK细胞）；CD45RO的II类限制性T细胞的百分比⁺和CD45RA⁺; 以及CD28的I类限制性T细胞百分比⁺、HLA-DR⁺，CD38⁺和CD11b⁻.

在RNA-zol（Cine/Biotech，Friendswood，Tex）中以50 mg/0.2 ml/10的浓度对从额外等分血液中提取的PBL进行均质化⁶细胞。如前所述，使用定量逆转录酶PCR（RT-PCR）细胞因子分析(11,38,39). 使用上标RT（马里兰州罗克维尔贝塞斯达研究实验室）对RNA样本进行逆转录，并使用细胞因子特异性引物扩增以下细胞因子(38)：γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12。通过Southern blot分析检测扩增的PCR产物(38,39)，并使用磷成像仪（Molecular Dynamics，Sunnyvale，Calif.）将所得信号量化为样品之间的相对差异(38,39). 在最终分析中，受试者没有丢失任何细胞表面标记物或细胞因子的数据。

分析。

我们的目标是确定慢性疲劳综合征患者相对于健康对照组（包括海湾战争退伍军人和平民）是否存在免疫改变或失调，并尽可能比较退伍军人与平民的数据。以往关于CFS免疫异常的报告中的一个问题在于，他们使用了多个、单独的、单变量的推断检验，即使在使用了多元方差分析（MANOVA）技术的情况下也是如此。另一个问题是，经典统计方法相对无法捕获理论上认为存在的综合免疫模式，例如1型与2型细胞因子谱。这些方法不允许在一个增加而另一个减少的同时对这种模式进行同步评估。此外，MANOVA或多元回归仅能防止所有免疫指标总体组间差异的I型错误。然而，在进行多次对比时，这些经典测试中没有标准的统计方法来确定防止第1类错误的适当程序(5).

传统的重复测量分析不适合本报告中的假设检验，因为数据显示了方差和协方差的显著异质性(7,22). 为了克服这些问题，我们使用了混合效应、重复测量模型，可以同时评估激活和分化标记物水平以及细胞因子水平的组间差异(6,18,42). 这种方法不仅使我们能够明确估计每个模型中多种免疫学测量值的方差和协方差的异质性程度，还可以将多种免疫学度量值中的组间差异作为交互项进行测试(5,41). 通过这种分析格式，我们提高了统计比较的效率和精度，并控制了I类错误频率膨胀的风险。

在CFS患者和海湾战争退伍军人和平民各自的对照组中，以及在这两个样本之间同时测试细胞表面标记物的百分比和实际数量的差异。基于细胞因子的比较仅在退伍军人和平民样本组中进行，因为分析是分别针对退伍军人与平民进行的。我们系统地控制了受试者的人口统计学特征的潜在混淆，包括年龄、种族、性别和每个模型中的Axis I诊断状态。随后，我们还根据疾病严重程度和发病模式（即突发与渐进）对CFS组进行了评估；由于这些分析独立于上述主要统计模型，因此个别比较并不能纠正1类错误频率膨胀的可能性。

我们采取了几个步骤来测试我们关于免疫状态指标群体差异的假设。首先，构建一个通用模型来测试CFS状态（Yes=1和No=0）、资深成员（Yes=1和No=0）和细胞表面标记百分比之间的三向交互作用，同时纳入这些协变量和细胞表面标志百分比之间的主要影响和交互作用。由于患者组中的某些免疫变量可能会显示出增加，而其他免疫变量相对于对照组显示出减少，或者与对照组的差异可能主要发生在一个CFS组中，因此特别关注交互作用的测试。同样，协变量的作用可能因各种免疫措施而异。例如，男性细胞表面标记物的水平可能低于女性，但高于女性。为了确定CFS患者和对照组之间是否存在真正的差异，必须考虑这些特定差异。模型试验组细胞表面标记百分比的差异规定如下：

百分比_ij公司=b条₀+b条₁（性别）_我+b条₂（种族）_我+b条_三（年龄）_我+b条₄（轴I）_我+b条₅（CFS）_我+b条₆（退伍军人）_我+b条₇（细胞表面标记）_ij公司+b条₈（CFS×老兵）_我+b条₉（性别×细胞表面标记）_ij公司+b条₁₀（种族×细胞表面标记）_ij公司+b条₁₁（年龄×细胞表面标记）_ij公司+b条₁₂（CFS×细胞表面标记）_ij公司+b条₁₃（老兵×细胞表面标记）_ij公司+b条₁₄（CFS×退伍军人×细胞表面标记物）_ij公司+第页_ij公司(我= 1,2, … ,n个，受试者人数；j个= 1, 2, … ,k个，细胞表面标记的数量）

模型试验组在细胞表面标记物数量上的差异使用了相同的规范，但响应函数是对数转换的。模型试验组细胞因子水平的差异规定如下：

对数（细胞因子）_ij公司=b条₀+b条₁（化验）_我+b条₂（性别）_我+b条_三（种族）_我+b条₄（年龄）_我+b条₅（轴I）_我+b条₆（CFS）_我+b条₇（细胞因子）_ij公司+b条₈（性别×细胞因子）_ij公司+b条₉（race×细胞因子）_ij公司+b条₁₀（年龄×细胞因子）_ij公司+b条₁₁（CFS×细胞因子）_ij公司+第页_ij公司(我= 1,2, … ,n个，受试者人数；j个= 1, 2, … ,k个，细胞因子数量）

这种方法不同于传统的重复测量分析，因为剩余项第页_ij公司在方程式中，并没有假定受试者是同质的我相反，通过使用SAS混合程序（22）和无约束错误结构，在每个模型中充分估计受试者之间的误差方差和协方差，以反映细胞表面标记物和细胞因子之间的相互关系。

接下来，我们从上述模型中逐步消除协变量和免疫状态指标之间的非显著交互项。一个不显著的相互作用项表明，感兴趣的群体差异不是由给定的协变量来解释的。因此，例如，Axis I与表面标记物和细胞因子的相互作用项没有显示出统计意义，因此它们没有包含在待评估的特定模型中。

最后，我们系统地评估了高阶交互测试组的兴趣差异。如果无法达到统计显著性，则从模型中消除高阶交互作用(P（P）<0.05），然后对仅具有较低阶项的模型进行评估。保留的最终模型将在下一节中报告。在分析之前，对细胞表面标记物和细胞因子测量值进行对数转换，以达到正常值，并减少外围测量值的不当影响。

结果

表表11给出了有关样本的描述性统计数据。退伍军人样本主要由50岁以下高中或大学学历的白人男性组成，而平民样本主要是白人女性，其中接受研究生教育的比例高于退伍军人。对于健康的退伍军人来说，接受高中以上教育的机会是CFS退伍军人的三倍。CFS退伍军人被诊断为Axis I的可能性是平民CFS患者的2.5倍以上（优势比=2.78，P（P）<0.05）和健康退伍军人的12倍（比值比=12，P（P）< 0.05). 16%的退伍军人患者被诊断为最严重的CFS类别，而87%的平民患者属于该类别（比值比=0.11，P（P）< 0.05). 16%的退伍军人患者报告突然出现症状，而患有慢性疲劳综合征的平民患者为63%（比值比=0.03，P（P）< 0.05).

表1

人口统计学和疾病状态变量的频率分布

特性	受试者人数（%）
	老兵		平民		总计
	CFS公司	控制	CFS公司	控制	总计
总计	43	34	68	53	198
性别
男性	32	30	14	7	83
女性	11	4	54	46	115
比赛
白色	33	29	68	52	182
其他	10	5	0	1	16
年龄
20-29岁	11	9	10	9	39
30-39岁	18	13	25	20	76
40–49岁	11	11	26	19	67
50或以上	三	1	7	5	16
教育程度
高中或以下	19	7	21	9	56
大学或同等学历	21	19	33	31	104
毕业生或同等学历	三	8	14	13	38
婚姻状况
离婚或分居	16	2	11	8	37
已婚或同居	15	17	34	28	94
单身或丧偶	10	14	22	17	63
I轴诊断
是的	31	6	33	0	70
不	12	28	35	53	128
疾病的发病
逐渐的	36	0	25	0	61
突然	7	0	43	0	50
严重CFS人数（%）^一	7 (16)		59 (87)

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^一“严重CFS”是指活动减少50%或更多，以及七个或更多严重症状(14).

本研究检测了11种细胞表面标志物、淋巴细胞的百分比和数量、WBC计数以及7种细胞因子的水平。我们发现，患者组和相应对照组在以下任何标志物表型方面没有系统性的组间差异：CD4⁺CD45RO⁺，CD4⁺CD45RA⁺，CD8⁺CD28编号⁺，CD8⁺人类白细胞抗原-DR⁺，CD8⁺CD38型⁺，或CD8⁺CD11b型⁻因此，我们的报告重点关注五种亲本细胞表面标记物和七种细胞因子的群体差异。

表表22显示了四个对照组细胞表面标记的百分比和数量以及细胞因子水平的平均值和标准误差。在民用CFS组和对照组之间，这些变量的混合效应模型没有发现显著差异。随后的分析并未揭示基于CFS病情严重程度的影响，但在按发病模式分层后，发现与对照组相比，一些细胞标记物存在差异。逐渐发病的患者(n个=25）显示淋巴细胞总数百分比下降（平均值=26.6，标准误差[SE]=1.8，P（P）=0.022），白细胞总数增加（平均值=7200，SE=472.7，P（P）= 0.026). 然而，这些差异并不是相互独立的，因为淋巴细胞百分比的下降是WBC数量增加的结果。事实上，我们发现渐进组（平均值=1846）和对照组（平均数=1874）的淋巴细胞数量非常相似。激活的T抑制细胞（CD8）百分比增加⁺CD38型⁺)（平均值=58.9，SE=2.3，P（P）=0.023），与对照组相比（平均值=51.1，SE=1.8[表2])在逐渐发作组也发现。CFS突发患者(n个=18）显示CD8的百分比下降⁺CD11b型⁻单元格(P（P）= 0.056). 在这些分层后，细胞因子没有发现差异。没有足够的退伍军人突发慢性疲劳综合征(n个=7）允许进行类似的分层测试。

表2

细胞因子和CD细胞表面标记物的平均值和标准误差

细胞类型、表型或细胞因子	海湾战争退伍军人						平民
	n个^（f）	CFS公司		n个	控制		n个	CFS公司		n个	控制
	n个^（f）	平均值	东南方	n个	平均值	东南方	n个	平均值	东南方	n个	平均值	东南方
第个，共个^一:
白细胞计数	42	6,564.29	262.54	33	6,233.33	253.67	43	6,516.28	284.89	39	6,064.1	213.08
淋巴细胞	42	2,119.76	103.81	33	1,918.33	96.03	43	1,826.63	75.93	39	1,874.36	68.69
CD（16+56）⁺^一	42	261.10	28.72	33	290.70	26.13	43	180.74	13.69	39	196.08	15.11
CD19编号⁺	42	248.07	19.63	33	262.18	28.33	43	256.86	18.37	39	252.46	16.23
CD3（CD3）⁺	42	1,613.62	78.65	33	1,373.58	72.47	43	1,385.86	63.84	39	1,425.95	57.89
CD3（CD3）⁺CD4细胞⁺	42	1,014.69	51.62	33	809.15	45.34	43	889.93	41.29	39	927.26	40.77
CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁺	42	567.62	34.95	33	515.33	42.20	43	458.37	28.99	39	476.85	32.11
%淋巴细胞^b条	42	32.67	1.22	33	31.73	1.55	43	29.51	1.48	39	31.31	0.97
CD（16+56）⁺^c（c）	42	12.24	0.94	33	15.52	1.12	43	10.19	0.73	39	10.62	0.76
CD19编号⁺^c（c）	42	11.55	0.67	33	13.03	1.02	43	14.23	0.80	39	13.38	0.66
CD3（CD3）⁺^c（c）	42	76.36	0.93	33	71.85	1.23	43	75.53	1.21	39	75.87	0.97
CD3（CD3）⁺CD4细胞⁺^c（c）	42	48.31	1.01	33	42.45	1.39	43	48.60	1.03	39	49.59	1.18
CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁺^c（c）	42	26.62	1.11	33	26.73	1.39	43	24.81	0.97	39	25.72	1.20
CD4细胞⁺CD45RO⁺^d日	40	71.40	1.85	33	72.18	2.12	43	67.83	2.26	39	70.51	2.44
CD4细胞⁺CD45RA⁺^d日	40	42.80	1.73	33	40.76	2.18	40	46.23	1.70	39	43.18	1.79
CD8（CD8）⁺CD28编号⁺^d日	41	58.17	1.96	33	59.45	2.25	40	67.79	1.98	39	65.05	2.23
CD8（CD8）⁺CD38型⁺^d日	41	51.56	2.35	33	53.12	2.74	40	58.08	1.92	38	51.10	1.77
CD8（CD8）⁺人类白细胞抗原-DR⁺^d日	41	20.90	1.69	33	20.73	2.23	40	19.85	2.14	39	22.82	2.18
CD8（CD8）⁺CD11b型⁺^d日	40	56.20	2.49	32	53.44	2.95	40	69.58	2.24	39	61.66	3.64
细胞因子^c（c）
白介素-2	43	430.95	140.23	34	251.97	61.17	68	77.93	13.02	53	95.48	17.24
白介素-4	43	256.33	58.06	34	134.11	18.79	68	16.90	2.58	53	18.74	2.61
白介素-6	43	2,882.11	505.21	34	1,710.95	337.08	68	98.21	32.49	53	281.42	112.87
白介素-10	43	603.84	136.88	34	495.95	265.11	68	333.42	48.06	53	532.42	170.98
白介素-12	43	299.55	84.64	34	136.37	38.89	68	463.22	66.90	53	656.63	159.95
肿瘤坏死因子-α	43	288.62	48.37	34	166.35	27.28	68	140.84	16.80	53	182.93	19.90
干扰素-γ	43	1,002.06	163.52	34	632.74	146.11	68	736.37	113.41	53	986.20	246.56

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^一每立方毫米的细胞数。

^b条白细胞百分比。

^c（c）淋巴细胞百分比。

^d日父单元格的百分比。

^{e（电子）}所使用的单位是指示通过用PhosphorImager对来自PCR产物的Southern印迹的信号进行量化而获得的样品之间的差异的相对单位。

^（f）n、受试者人数。

关于海湾战争退伍军人，我们利用混合效应模型系统地测试了导言中所述的三个假设。患有慢性疲劳综合征的退伍军人的NK细胞比例明显较低(P（P）=0.011），CD3的百分比明显较高⁺单元格(P（P）=0.007）和CD3⁺CD4细胞⁺单元格(P（P）<0.0003）比健康的退伍军人对照组（表（表3）。三). 这些差异被同时测试，并通过显著的三方相互作用得到证实(P（P）=0.0019）⁻CD（16+56）⁺，CD3⁻CD19编号⁺，CD3⁺，CD3⁺CD4细胞⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺)同时控制性别、种族、年龄和Axis I诊断。当对退伍军人和平民的结果进行平均时，40岁或40岁以上的受试者的CD3明显更多⁺CD4细胞⁺单元格(P（P）=0.006），CD3显著减少⁺CD8（CD8）⁺单元格(P（P）=0.0006）。如果我们在分析中没有控制这个变量，这些显著的年龄差异可能会混淆我们的结果。

表3

海湾战争退伍军人和平民群体CD细胞表面标记物的线性对比，基于混合效应模型，退伍军人身份（是或否）、CFS身份（是/否）和细胞表面标记因素之间的三向交互作用^一

变量	参数估计值^b条	t吨	P（P）>t吨
CFS退伍军人与退伍军人控制
CD（16+56）	−3.32^*	−2.57	0.011
CD19编号	−1.56	−1.36	0.176
CD3（CD3）	4.35^*	2.74	0.007
CD3 CD4	5.93^*	3.66	0
CD3和CD8	−0.42	−0.26	0.797
CFS退伍军人与CFS平民
CD（16+56）	2.22	1.84	0.068
CD19编号	−2.62^*	−2.42	0.016
CD3（CD3）	0.65	0.44	0.662
CD3 CD4	0.23	0.15	0.882
CD3细胞CD8	1.21	0.79	0.428

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^一比较表面标记百分比以确定所示的统计值。

^b条参数估计值是子目所示各组之间每个细胞表面标记的预测差异。

^c（c）∗,P（P）< 0.05.

患有慢性疲劳综合征的退伍军人CD3显著增加⁺单元格(P（P）=0.021）和CD3⁺CD4细胞⁺单元格(P（P）=0.002），但两组之间的NK细胞数量没有发现显著差异（表（表4）。4). 患有CFS的退伍军人的NK细胞、总T细胞、CD3明显增多⁺CD4细胞⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺细胞，但不超过B细胞，比两个平民团体。对老年患者细胞表面标记物数量的普遍增加进行了再次测试，并通过显著的三向相互作用进行了证实(P（P）=0.048）。

表4

海湾战争退伍军人群体和平民群体之间CD细胞表面标记物的线性对比，基于混合效应模型，退伍军人身份（是或否）、CFS身份（是/否）和细胞表面标记因素之间的三向交互作用^一

变量	参数估计^b条	t吨	P（P）>t吨
CFS退伍军人与退伍军人控制
CD（16+56）	−0.12	−0.97	0.334
CD19编号	0.06	0.44	0.661
CD13号机组	0.19^*	2.33	0.021
CD3 CD4	0.27^*	3.21	0.002
CD3和CD8	0.13	1.14	0.256
CFS退伍军人与CFS平民
CD（16+56）	0.38^*	3.21	0.002
CD19编号	0	0.02	0.981
CD3（CD3）	0.20^*	2.54	0.012
CD3 CD4	0.20^*	2.41	0.17
CD3和CD8	0.24^*	2.12	0.035
CFS退伍军人与平民控制
CD（16+56）	0.35^*	2.78	0.006
CD19编号	0.04	0.32	0.747
CD3（CD3）	0.21^*	2.38	0.018
CD3 CD4细胞	0.19^*	2.12	0.036
CD3和CD8	0.30^*	2.45	0.015

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^一比较表面标记物计数以确定所示的统计值。

^b条参数估计值是子目所示各组之间每个细胞表面标记的预测差异。就激活标记物而言，慢性疲劳综合征退伍军人的几种激活标记物水平（以百分比计）低于慢性疲劳综合征平民：CD28（−9.79[P（P）=0.0009]），CD38（−6.52[P（P）=0.0325）和CD11bmn（-0.25[P（P）= 0.0168]). 此外，CFS退伍军人的CD28水平低于文职对照组（−7.01[P（P）= 0.0169]). ∗,P（P）< 0.05.

数字图11和和22显示了在患有慢性疲劳综合征的退伍军人和健康平民样本的普通人群中观察到和预测的细胞表面标记物数量、预测细胞数量的置信区间以及五种细胞表面标记物的标准范围。健康平民组和CFS退伍军人组的细胞数值均在规范范围内；此处研究的所有四个受试者组的置信区间（图中仅描述了两个）均在标准范围内。然而，图。图11和和22表明健康平民组的置信区间比CFS退伍军人组的置信范围更宽，表明前者的异质性更大。没有描述CFS平民的广义置信区间和老兵控制的狭义置信区间，这表明所有平民在这方面比海湾战争退伍军人更加异质。

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图1

海湾战争退伍军人CFS患者五种细胞表面标记物的估计和观察平均数。画线连接测量点只是为了帮助读者看到免疫变量的模式。预测的细胞表面标记的平均数来自CFS状态（是或否）、退伍军人状态（是/否）和细胞表面标记之间的三向交互模型。该模型通过单变量、混合效应重复测量分析进行分析，与常规的多变量分析相比，该分析能够更有效、同时、跨组地对患病和健康退伍军人以及患病和健康平民进行比较。所有预测值均在实验室的标准范围内。请注意，相对于民用控制，所有五个标记的95%置信区间都较窄。

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图2

健康退伍军人五种细胞表面标记物的估计和观察平均数。

在老兵样本中检测了七种细胞因子的水平（表（表5）。5). 与细胞表面标记物数据一致，本研究中，与所有细胞因子的对照组相比，患有CFS的退伍军人普遍表现出上调的趋势，表明CFS状态与细胞因子之间无显著双向交互作用(P（P）=0.642）和CFS的显著主要影响(P（P）= 0.006). 线性对比表明，IL-2的组间差异具有统计学意义(P（P）=0.021），IL-10(P（P）=0.01），干扰素-γ(P（P）=0.014）和TNF-α(P（P）= 0.002). 由于患有CFS的退伍军人的所有细胞因子水平均较高（表（表2）2)与对照组相比，CFS状态与细胞因子的双向交互作用预计不显著。

表5

基于混合效应模型的海湾战争退伍军人CFS与健康对照组细胞因子水平的线性对比^一

变量	参数估计^b条	t吨	P（P）>t吨
白介素-2	0.504^*	2.34	0.021
白介素-4	0.428	1.61	0.111
白介素-6	0.598	1.73	0.086
白介素-10	0.754^*	2.61	0.010
白介素-12	0.362	0.92	0.359
干扰素-γ	0.539^*	2.51	0.014
TFN-α	0.659^*	3.07	0.002

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^一比较细胞因子水平（单位），以确定所示的统计值。

^b条参数估计值是各组间每种细胞因子的预测差异。*，P（P）< 0.05.

接下来，我们评估了海湾战争退伍军人的细胞因子反应从I型转变为II型的假设，特别是那些患有慢性疲劳综合征的退伍军人(33). 没有观察到这种变化。相反，数据表明CFS退伍军人出现I型反应，IL-2和IFN-γ显著上调，而IL-4和IL-6无明显上调。事实上，我们没有发现IFN-γ与IL-4或IL-6之间的负相关，而是发现了显著的正相关。在退伍军人和平民样本中，发现另一种1型细胞因子IL-2与IL-4和IL-6之间存在类似的正相关（表（表6）。6). IL-10也显著增加；IL-10升高是1型或2型反应的特征，至少部分原因是IL-12诱导IL-10和IFN-γ的产生(26,31).

表6

细胞因子与T细胞和T辅助细胞表面标志物的相关性^一

表面标记物或细胞因子	相关性：
表面标记物或细胞因子	%CD3（CD3）	%CD3 CD4	CD3编号	CD3 CD4的数量	白介素-2	白介素-4	白介素-6	白介素-10	白介素-12	干扰素-γ
老兵
%CD3（CD3）
%CD3 CD4	0.33^*
CD3编号	0.20	−0.02
CD3 CD4的数量	0.10	0.36^*	0.89^*
白介素-2	0.01	0.18	−0.19	−0.10
白介素-4	−0.01	0.34^*	−0.05	0.11	0.51^*
白介素-6	0.05	0.06	0.08	0.09	0.37^*	0.49^*
白介素-10	−0.01	0.23^*	−0.09	0.03	0.55^*	0.33^*	0.48^*
白介素-12	−0.07	0.06	−0.08	0.04	0.14	−0.10	0.06	0.35^*
干扰素-γ	0.17	0.11	0.30^*	0.30^*	0.33^*	0.41	0.53^*	0.51^*	0.15
肿瘤坏死因子-α	0.05	0.27^*	−0.15	−0.03	0.75^*	0.70^*	0.62^*	0.61^*	0.11	0.41^*
平民
%CD3（CD3）
%CD3 CD4	0.47^*
CD3编号	0.44^*	0.21^*
CD3 CD4的数量	0.27^*	0.45^*	0.78^*
白介素-2	0.04	−0.02	−0.00	−0.08
白介素-4	0.06	0.09	−0.07	−0.04	0.32^*
白介素-6	0	0.05	0	0.01	0.43^*	0.16
白介素-10	0.08	−0.04	0.01	−0.09	0.60^*	0.29^*	0.45^*
白介素-12	−0.00	−0.05	0.01	−0.04	0.46^*	0.43^*	0.25^*	0.38^*
干扰素-γ	0.26	−0.02	0.24^*	0.12	0.33^*	−0.01	0.22^*	0.19^*	0.09
肿瘤坏死因子-α	0.08	−0.01^*	0.04	0.02	0.13	0.18^*	0.01	0.25^*	0.01	0.42^*

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^一∗,P（P）< 0.05.

讨论

本文报告了重要的负面和正面调查结果。重要的负面发现是，在这项对偶发性CFS的非永生者进行的仔细对照研究中，我们无法证实免疫失调。当我们开始收集这些免疫学样本时，我们有几个先验的假设。一是我们会发现整个CFS患者组都存在免疫失调。第二个与我们在缺乏DSM-III-R精神病理学的CFS患者组中发现的认知功能下降和脑磁共振成像异常有关(8,20). 这些发现使我们假设，我们会在这个亚组中发现免疫异常，特别是在这些症状最严重的患者中。同样，这些假设也没有得到支持。即使对存在或不存在Axis I精神障碍的数据进行分层，患者和对照组在研究中的任何免疫学变量方面都没有显著差异。

因为疾病控制和预防中心（CDC）的一个小组也发现了整个CFS患者群的阴性结果，但在根据疾病严重程度和发病模式进行分层后确实发现了一些差异(25)，我们做了类似的分析。疾病控制与预防中心小组报告了基于严重程度的差异，但我们没有证实这一点。关于基于发病模式的差异，我们获得了与Mawle等人不同的结果。一个相似之处是表型CD8的结果⁺CD11b型⁻然而，我们发现这种细胞群在逐渐发病组中发生了改变，而Mawle等人报告说在突然发病组中发现了这种改变。这些研究之间的差异表明了使用统计方法时存在的问题，这些方法不能防止第1类错误。与我们使用材料和方法中详述的混合效应模型相反，该分析（针对我们的数据和CDC数据）没有调整多重比较的显著性水平。由于我们的结果与CDC小组注意到的结果不同，我们的推断是这些结果可能是统计伪影。

问题是，为什么我们无法确认所研究的CFS患者的免疫失调。然而，文献表明，实验室之间的结果不一致是规律，而不是例外。因此，一些但并非所有实验室都发现NK细胞数量减少(13,29)，T细胞群(23,34)、和激活标记(19,29,40). 关于细胞因子，Strober 1994年的结论似乎适用(37)：“对CFS中各种淋巴因子和细胞因子循环水平的研究没有发现CFS中淋巴因子/细胞因子分泌的明显和可重复的异常。”

Cannon等人指出，检测方法和组织类型对评估细胞因子至关重要(三). 这是对CFS中细胞因子基因表达的首次研究。此外，我们在不进行体外再刺激的情况下测量PBL中的细胞因子RNA，以避免因淋巴细胞有丝分裂原激活而产生伪影。使用RT-PCR，我们无法证实先前关于IL-6水平升高与CFS相关的报道(1,12); 然而，据报道，在一组临床表现类似严重慢性传染性单核细胞增多症的患者中，我们的CFS退伍军人的IL-10水平升高(16).

除了分析方法上的差异外，我们的研究与其他研究之间还有另一个主要差异。在我们的工作中，我们排除了定期锻炼的健康对照组。众所周知，一些免疫参数对适应状态很敏感。例如，NK细胞数量随着健康程度的提高而增加(30). 因此，NK细胞数量的减少可能反映了CFS固有的不活动性，而不是潜在的疾病本身。另一个相当不同的解释是，我们小组只是研究了错误的免疫标记物。与这一解释相一致的是与Chun Chao合作进行的一项关于血清中转化生长因子B的研究的未发表结果，在该研究中，我们发现非永久性CFS组的20名受试者与19名久坐对照组的受试者相比，有少量但显著的增加（CFS=187±13 pg/ml；对照=141±11 pg/ml[P（P）< 0.01]). 因此，与静态条件下的淋巴细胞测试相比，对其他细胞因子的评估或对受刺激淋巴细胞功能的评估可能为CFS患者的免疫功能障碍提供更一致的证据。

然而，鉴于我们对患有慢性疲劳综合征的海湾战争退伍军人的免疫参数的调查结果，认为我们一直在研究错误的免疫学变量的说法不太可能成立。与患有慢性疲劳综合征的平民的数据相比，患有慢性疲劳综合症的海湾战争退伍军人在淋巴细胞亚群和细胞因子信息中显示出明确的免疫状态改变的证据。虽然我们假设发现的任何免疫激活都主要发生在CFS患者的特定亚群中，即那些没有并发重大精神病理学的患者，但数据并不支持这一点。免疫上调，反映为T细胞数量的增加和PBL细胞因子水平的增加，无论患者分组如何。

该研究的第二个原因是为了测试Rook和Zumla的假设(33)CFS患者和海湾战争退伍军人（尤其是CFS患者）会表现出2型细胞因子激活模式。我们的数据不支持这两组患者的假设。事实上，患有慢性疲劳综合征的退伍军人表现出的细胞因子激活模式为1型，或炎症型，IL-2和IFN-γ增加，可能与CD3同时增加有关⁺CD4细胞⁺-T细胞数量。如果有什么区别的话，这种1型转变是被抑制的，因为众所周知，在患有CFS的退伍军人中也存在较高水平的IL-10可以抑制IFN-γ的合成(27). 由于这两种细胞因子都是由IL-12诱导的(26,31)IL-10通常与1型免疫反应相关。

当我们开始这些研究时，我们假设，如果我们发现任何一组患者存在免疫功能障碍的证据，那么这将发生在平民身上。我们根据已发表的数据得出了这一思路，这表明散发性CFS通常涉及感染后过程(17)而海湾战争退伍军人的严重疲劳通常没有传染性或突发性发作。事实上，我们自己的数据支持这一观点，因为我们发现患有慢性疲劳综合征的平民报告的突发疾病发病率明显高于海湾战争退伍军人（表（表1）。1). 然而，我们发现海湾战争退伍军人CFS患者的免疫状态发生改变，而非平民患者。

我们如何解释这个结果？这个问题有两个完全不同的答案。一种可能性是，海湾战争中服役的某些特殊因素改变了CFS退伍军人免疫系统的正常控制。到目前为止，我们一直在谨慎地避免使用异常或功能失调等词来描述这些变化，因为退伍军人的标准化实验室细胞表面标记数据在标准范围内。然而，对于生病和健康的退伍军人来说，每个测量值的变异性都大大小于非永久性退伍军人（图。（图11和和2）。2). 这表明退伍军人在免疫学上比非退伍军人更加同质。正如Rook和Zumla假设的那样(33)，免疫异质性的降低可能是部署部队多次接种疫苗的结果(33)最近一项关于接种疫苗的儿童的研究支持了这一解释牛分枝杆菌卡介苗(35). 发现如此程度的同质性表明，将海湾战争退伍军人的免疫学数据与标准的非永久性群体的数据进行比较是不合适的。如果采取这种观点，这将表明患有慢性疲劳综合征的海湾战争退伍军人确实有证据表明，相对于各自的海湾战争老兵控制措施，免疫功能紊乱。

另一种解释是，假定的免疫异常反映了患者和对照组之间的差异，而这些差异与疾病无关。一个例子将再次关注NK细胞数量。改善体质可以增加淋巴细胞数量(30)而部分睡眠障碍可以减少(15). 慢性疲劳综合征患者由于缺乏活动和睡眠障碍而导致的健康状况下降很常见。然而，有一些免疫学数据与这一解释相矛盾。据报道，条件较差的受试者T细胞数量没有变化(30)睡眠障碍患者IL-2的产生减少(15). 相反，患有慢性疲劳综合征的海湾战争退伍军人的总T细胞计数和IL-2水平高于海湾战争退伍军人对照组。

对于发现患有慢性疲劳综合征的海湾战争退伍军人和健康的海湾战争老兵之间免疫学特征的差异，我们提出了两种截然不同的可能解释。显然，要确定哪个答案是正确的，还需要进一步的研究。然而，我们认为数据支持第一种可能性，即海湾战争中服役的某些因素改变了这群同样患有慢性疲劳综合征的退伍军人的免疫状态。我们得出这样的结论是因为退伍军人的免疫学数据相对均匀，但在患病和健康受试者之间仍有明显差异，并且患有慢性疲劳综合征的退伍军人比平民的病情轻(32)因此，与CFS患者相比，CFS患者不活动和睡眠不良的问题更少，CFS的免疫学数据与精心选择的对照组相似。

确认

本研究由DVA医学研究基金和NIH中心拨款AI-32247支持。

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文章来自临床和诊断实验室免疫学由以下人员提供美国微生物学会（ASM）