行动2突变体引起人iPSC来源心肌细胞的蛋白质病变

摘要

1.简介

α-肌动蛋白-2（ACTN2）是骨骼肌和心肌细胞中肌节的一种成分，它形成抗平行同源二聚体，可以将肌动蛋白细丝锚定并交联到Z盘上（有关综述，请参阅[1,2]). 此外，ACTN2参与组装大蛋白复合物以实现结构完整性、机械传递和细胞信号传递（有关综述，请参阅[三,4]).

基因变异行动2杂合状态与常见的遗传性心脏病相关，包括肥厚型（HCM）、扩张型（DCM）和限制性（RCM）心肌病[5,6,7,8]. 尽管被认为是一种罕见病基因[9]，最近的报告显示纯合子与行动2核心肌病变异[10]或渐进性严重RCM[6]. 此外，还发现杂合子行动2变异对心肌的结构和功能有重要影响[11]. 我们之前证明了杂合HCM错义行动2变异体（c.740C>T）在人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CM[8]). 错义的分子机制行动2变异导致不同形式的（心脏）肌病尚不完全清楚。据推测，突变转录物被翻译成蛋白质，预计蛋白质对肌节结构和/或功能具有显性负效应。然而，突变蛋白也可能被错误折叠并靶向泛素蛋白酶体系统（UPS）进行降解或形成聚集体，如果没有靶向自噬-溶酶体途径（ALP[12,13,14]).

在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9基因工具创建了两个表达野生型ACTN2（ACTN2wt；c.740C）或突变型ACTN1（ACTN2mut；c.740 T）的细胞系，并使用不同技术的组合，评估突变型ACTN2对hiPSC-CM细胞结构和功能的影响，包括免疫荧光和活细胞成像、RNA-seq和质谱（MS）分析。我们的数据显示，ACTN2mt hiPSC-CM呈现肥大、肌原纤维紊乱、ACTN2聚集、多核百分比较高以及UPS和ALP激活。它与肌节相关蛋白水平的显著降低和工程心脏组织（EHT）的力损伤有关。我们的数据表明，蛋白质病是由错义引起的一种额外的细胞特征行动2变异，可能有助于人类行动2-相关心肌病。

2.材料和方法

3.结果

3.1. ACTN2mut 2D培养的hiPSC-CM显示肥大、肌原纤维紊乱、蛋白质聚集和多核

ACTN2wt和ACTN2mut系均来自先前描述的杂合ACTN2-HCM-hiPSC系（ACTN2het；c.740C>T[8])使用CRISPR/Cas9基因编辑和同源定向修复。最初，这两个hiPSC株系旨在产生无突变的等基因对照。然而，测序分析显示ACTN2wt中只有一个功能性野生型等位基因[19]ACTN2mut中只有一个功能突变等位基因(图S1A). 两种细胞系的其他等位基因均含有CRISPR/Cas9的靶向缺陷（ACTN2wt的剪接突变[19]ACTN2mut中的大重排(图S1A、B))导致无义mRNA，RNA-seq无法看到(图S2D). 因此，我们创建了两个杂合功能敲除系，分别具有第二个野生型和错义ACTN2等位基因。ACTN2wt和ACTN2mut hiPSC株系的核型均正常(图S1C)因此，根据我们的方案将其与hiPSC-CM区分开来(图S1D). HiPSC-CM具有高纯度（平均>90%的心肌肌钙蛋白T（TNNT2）阳性细胞）和高数量(图S2A).

对两个hiPSC-CM株进行ACTN2丰度和定位、肌原纤维紊乱、细胞肥大和多核性评估。免疫荧光分析显示，两个hiPSC-CM株系中TNNT2均呈横纹状，表明肉瘤形成正常(图1A） ●●●●。然而，与ACTN2wt hiPSC-CM相比，ACTN2在ACTN2mut中的组织和形成聚集体较少。量化显示ACTN2mut hiPSC-CM中肌原纤维紊乱指数较高，ACTN2聚集物较多(图1B、 C）。此外，ACTN2mut hiPSC-CM中的细胞面积和体积较高(图1D、 E）。最后，ACTN2mut中多核（>1核）hiPSC-CM的百分比高于ACTN2wt(图1F） ●●●●。ACTN2wt hiPSC-CM中的单核与多核比率为80:20，支持之前在人类心脏中获得的估计[20]而其他HCM hiPSC-CM中报道的ACTN2mut为53:47[21].行动2mRNA水平在两个hiPSC-CM株系之间没有差异(图S2C、E)，而ACTN2mut hiPSC CMs中的ACTN2蛋白水平明显较低(图S2F，G).

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图1

30天龄2D培养hiPSC-CM的疾病建模。(A类)hiPSC-CM的代表性免疫荧光图像（标尺=50µm），包括右侧的更高放大倍数（标尺=10µm。30天后，hiPSC-CM被固定，并用抗ACTN2和TNNT2抗体进行染色，用Hoechst进行细胞核染色。(B类)使用高分辨率图片对肌原纤维紊乱进行盲法分析（ACTN2wt和ACTN2mut:N/d=16/3）。(C类)使用斐济软件对ACTN2骨料进行定量分析（ACTN2wt:N/d=14/3，ACTN2mut:N/d=15/3）。(D类)用斐济软件对细胞面积进行定量分析（ACTN2wt:N/N/d=548/3/3，ACTN2mut:N/N/d 319/3/3）。(E类)用Imaris软件定量分析细胞体积（ACTN2wt:N/N/d=54/3/3，ACTN2mut:N/N/d=29/3/3）。(F类)使用斐济软件分析每个hiPSC-CM的核数量化，并以百分比表示（ACTN2wt:N/N/d=548/3/3，ACTN2mut:N/N/d=319/3/3；奇方=280.1，对< 0.0001). 数据表示为平均值±SEM（面板B类–E类)或百分比（面板F类)，使用对-使用未配对学生的吨-测试（面板B类–E类)或双尾Chi-square试验（面板F类). 缩写：TNNT2，心肌肌钙蛋白T；N/N/d，细胞/微孔/分化的数量。箭头指向聚合。

3.2. 外源突变ACTN2导致聚集形成导致肉瘤细胞紊乱

然后，我们测试了外源突变体ACTN2是否可以在活体2D培养的ACTN2wt hiPSC CMs中诱导蛋白质聚集。因此，携带MUT的AAV6转导ACTN2wt hiPSC-CM-行动2-HaloTag标签^®（c.740T），并与携带WT的AAV6转导的ACTN2mut hiPSC-CM进行比较-行动2-HaloTag标签^®（约740C）。在96周培养板中培养7天后，使用TMR-配体结合Hoechst对ACTN2-HaloTag蛋白进行染色，进行活细胞成像实验(图2A；以及视频S1和S2中的示例）。ACTN2wt中的外源性MUT-ACTN2和ACTN2mut中的WT-ACTN2逆转了表型，分别在约83%和17%的hiPSC CM中诱导聚集(图2A、 B）。这表明MUT-ACTN2导致ACTN2wt聚集，WT-ACTN2逆转ACTN2mut聚集。对采集的ACTN2聚集物活细胞图像进行量化，发现MUT中聚集物越来越多、越来越大-行动2-转导ACTN2wt比WT-行动2-转导ACTN2mut(图2C） ●●●●。Western blot分析显示MUT中只有内源性ACTN2-行动2-转导ACTN2wt(图2D、 E），这表明正确折叠的MUT-ACTN2水平很低，应该可以作为更大分子量的蛋白质看到。相反，WT中检测到外源性和内源性ACTN2-行动2-转导ACTN2mt hiPSC-CM，约46%的内源性ACTN2被外源性ACTN1替代(图2F、 G）。

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图2

2D培养的hiPSC-CM在培养7或30天后的活细胞成像和免疫荧光。(A类)使用携带行动2-MUT-HaloTag标签^®或行动2-WT-标签^®构建并播种在96个板中（2500–5000个细胞/孔）。7天后，通过添加TMR-配体对ACTN2-HaloTag染色进行活细胞成像^®蛋白质和Hoechst用于细胞核染色（比例尺=50µm；缩放=20µm）。(B类)ACTN2wt-hiPSC-CM（N/N/d=292/3/1）或ACTN2mut-hiPSC-CM中WT-ACTN2的肌节整合或聚集的盲法定量。(C类)hiPSC CM品系中ACTN2聚集体的定量。使用斐济软件进行分析（ACTN2wt+MUT-ACTN2:N/d=26/1，ACTN2mut+WT-ACTN2:N/d=9/1）。(D类,E类)ACTN2和TNNT2的Western blot染色以及非转导（NT）ACTN2wt或转导行动2-MUT-HaloTag标签^®30天后（n/d=3/1）。(F类,G公司)对ACTN2和TNNT2进行Western blot染色，并对非转导（NT）ACTN2mut或转导行动2-WT-标签^®30天后（n/d=3/1）。(H（H）)固定ACTN2wt和ACTN2mut hiPSC-CM的代表性图像，使用携带动作2-MUT-HaloTag标签^®或行动2-WT-标签^®培养30天后，用针对HaloTag的抗体染色^®ACTN2和Hoechst用于细胞核染色（比例尺=50µm）。使用蔡司LSM 800显微镜拍摄图像。数据以百分比表示（面板B类)或平均值±SEM（面板C类,E类,G公司)，使用对-通过单尾卡方试验获得的值（面板B类)或未成对学生的吨-测试（面板C类). 缩写：AAV6，腺相关病毒血清型6；MUT，突变体；NT，非转口；TNNT2、心肌肌钙蛋白T；WT，野生型；N/N/d，细胞/微孔/分化的数量。箭头指向聚合。

WT-或MUT转导hiPSC-CM的免疫荧光分析-行动2使用针对HaloTag的抗体^®和总ACTN2显示WT-ACTN2-HaloTag的共定位^®ACTN2mut中的总ACTN2染色证实外源性WT-ACTN2的Z盘整合，而外源性MUT-ACTN2在ACTN2wt中几乎检测不到，并且在某些部位与总ACTN1共定位(图2H） ●●●●。

3.3. ACTN2mut hiPSC-CM展示了几种典型路径的改变

了解由行动2在2D培养的hiPSC-CM中进行MS突变。将每个hiPSC CM系的三个重复进行合并，并分析三批分化。火山图显示ACTN2mut与ACTN2wt中481个（高250个，低231个）失调蛋白(图3A） ●●●●。灵巧路径分析（IPA）揭示了ACTN2mut hiPSC-CM中几种典型路径、疾病和生物功能的失调(图3B类；数据集S1）。具体而言，ACTN2mut的线粒体功能、sirtuin信号传导、蛋白泛素化、遗传性肌病、肌丝滑动和mRNA稳定高度失调。对蛋白质组数据的深入分析表明，ACTN2、其他一些与肌粒相关的蛋白质和桥粒蛋白质在ACTN2mut hiPSC-CM中的蛋白质水平显著降低(表S1). 已知其中一些蛋白质（FLNC、MYOZ2、NEBL、SYNPO2、SYNPO2L、TTN）与ACTN2直接相互作用[22,23,24]. 另一方面，FHL1和FHL2位于肌节的Z盘[25,26]ACTN2mut含量更丰富。一些与UPS和/或ALP相关的蛋白质（例如，BAG3、CTSC、GBA、HSPA1A、PSMA3、PSMA6、PSMB5、PSME2、TRIM54、UBA1、UBE2O、UBQLN2）在ACTN2mut hiPSC-CM中更为丰富(表S2).

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图3

30天龄、2D培养的hiPSC CMs的MS和RNA-seq分析。(A类)基于MS的ACTN2mut与ACTN2wt（250向上，231向下）hiPSC-CM之间的蛋白质水平变化显示在火山图中，该图显示了对-浅灰色圆点表示的数值与变化幅度（log2比率）对>0.05和深灰色圆点对< 0.05. (B类)基于使用Ingenuity Pathway analysis（IPA）的MS分析，选择了2D培养的ACTN2mut与ACTN2wt hiPSC-CM中显著失调的典型路径和生物功能。对显著改变的蛋白质进行无监督的IPA（Fisher精确检验；对< 0.05). (C类)基于RNA-seq分析，ACTN2mut与ACTN2wt（164向上，180向下）hiPSC-CM中mRNA水平的变化显示在火山图中，显示了帕杰-值与变化幅度（log2比率），其中浅灰色点表示FDR>0.1，深灰色点表示FDR<0.1。(D类)基于使用IPA的RNA-seq分析，选择了2D培养的ACTN2mut与ACTN2wt hiPSC-CM中显著失调的典型路径和生物功能。对显著改变的基因进行无监督的IPA（Fisher精确检验；FDR<0.1）。

然后，我们对来自3个心脏分化批次的每个hiPSC-CM品系的3个合并复制品进行RNA-seq。火山图显示ACTN2mut与ACTN2wt中有344个（高164个，低180个）失调的mRNA(图3C） ●●●●。与ACTN2wt相比，IPA分析揭示了ACTN2mut中几种不同的失调典型途径、疾病和生物功能(图3D类；数据集S2）。一些突出的IPA途径是代谢、缺氧、氧化和细胞应激、心肌肥大和细胞重塑，而肌动蛋白细胞骨架的信号传导不太明显。具体来说，两组之间的肌节相关蛋白的mRNA水平没有差异，除了FHL2型和MYH6年ACTN2mut中的含量分别低于和高于ACTN2wt中的含量(表S1). 使用nanoString n计数器进行的mRNA计数分析证实了这些数据^®元素技术(图S2E). RNA-seq还揭示了ACTN2mut hiPSC-CM中涉及UPS和ALP的编码蛋白的几个基因的失调(表S2).

总之，Omics分析支持ACTN2mut hiPSC-CM中结构肌节异常的实验结果，并提示细胞应激反应、细胞存活/凋亡或蛋白质稳态等途径的改变，这直接表明蛋白质病变是一种重要的疾病特征。

3.4. ACTN2mt hiPSC-CM显示泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径的高活性

ACTN2mut hiPSC-CM中几个UPS和/或ALP-相关蛋白的较高丰度以及ACTN2聚集体的存在表明蛋白质平衡发生了改变。因此，在2D培养的hiPSC CMs中评估了两种系统的活性。为了评估UPS，用载体（0.05%二甲基亚砜）或UPS抑制剂环氧霉素（250 nM；图4A–D）。在基础条件（DMSO）下，细胞株之间用于自噬介导降解的（多）泛素化蛋白及其穿梭蛋白SQSTM1的水平没有差异，而ACTN2mut中ACTN2的水平低于ACTN2wt，这再次证实了我们的发现(图S2F，G). 艾波西霉素治疗诱导hiPSC-CM中（多）泛素化蛋白和SQSTM1的显著积累(图4A–C），验证治疗效果。相反，环氧肟酸并没有增加任何细胞系中ACTN2的水平，这表明在这种实验条件下，UPS不会降解ACTN2(图4A、 D）。另一方面，蛋白酶体的类糜蛋白酶活性在ACTN2mut hiPSC-CM中显著升高(图4E） ，建议UPS启动。

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图4

评估行动230天龄2D培养的hiPSC-CM蛋白水解酶系统的基因变异。代表性的Western blots和Ponceau(A类)和量化（标准化为蓬索）(B类)（聚）泛素化蛋白质(C类)SQSTM1、(D类)在37°C下，用二甲基亚砜（0.05%）或环氧霉素（Epoxo；250 nM）处理16.5小时的hiPSC CM中的ACTN2（ACTN2wt:n/d=7–8/3，ACTN2mut:n/d=7–8/3）。(E类)hiPSC-CM中蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶活性（ACTN2wt:n/d=8/3，ACTN2mut:n/d=8/3）。(F类)典型的Western blots、Ponceau和蛋白质水平定量(G公司)LC3-II和(H（H）)用二甲基亚砜（0.05%）或巴非霉素A1（Bafilo；50 nM）在37°C下处理hiPSC-CM的ACTN2 3小时（ACTN2wt:n/d=6–7/3，ACTN2mut:n/d=6–7/2）。(我)通过测定自噬体（绿色点）和自溶体（红色减去绿色点）的数量间接测量ALP活性，其中点的数量与每个孔的CM数量相关（ACTN2wt和ACTN2mut：n个= 9). 数据表示为平均值±SEM对-通过双向方差分析和Tukey后验（面板）获得的值B类–D类,G公司–我)或与未成对学生的吨-测试（面板E类). 缩写：n/d，井数/差异。

为了评估ALP，用二甲基亚砜（0.05%）或晚期ALP抑制剂巴非霉素A1（50 nM；图4F–H）。在基础条件下，不同基因型之间的微管相关蛋白1轻链3b-II（LC3-II）水平没有差异。用巴非霉素A1治疗后，两组患者的LC3-II水平均显著升高(图4F、 G）。巴非霉素处理样品和二甲基亚砜处理样品之间的LC3-II水平差异（代表自噬通量）在ACTN2mut中高于ACTN2wt（log2差异，ACTN2wt:1.93，ACTN2mot:2.09）。另一方面，巴非霉素A1没有增加ACTN2水平(图4H） 这意味着ACTN2不会被ALP降解。为了支持自噬通量数据，我们对用AAV6编码mTagRFP-mWasabi-hLC3转导的hiPSC-CM细胞系进行了高含量成像，该细胞系由TNNT2公司发起人。培养30天后，固定hiPSC CMs，并对TNNT2和Hoechst进行免疫染色，以确保（单独）心肌细胞的成像(图S3A; >80%TNNT2+，数据未显示）。使用一种无偏且统计功能强大的方法量化每个井的绿色和红色斑点数量，并将其归一化为每个井的hiPSC-CM数量。ACTN2mut中每个hiPSC-CM的绿色斑点数显著低于(图S3B)，而每组hiPSC-CM的红点数量在各组之间没有差异(图S3C). 由于绿色荧光（mWasabi）易受低pH值的影响，因此利用LC3-串联结构可以确定自噬体（AP）和自溶体（AL），从而在Als中猝灭。因此，绿色点对应Aps，红色点对应Aps+Als，红色和绿色点之间的差异（=红色减去绿色点）对应Als。ACTN2wt hiPSC-CM的Aps和Als数量与hiPSC-CMs相似(图4一） 表明存在稳态自噬通量。相反，ACTN2mut中每个hiPSC-CM的AP数明显更低，每个hiPSC-CM的AL数更高(图4一） ●●●●。低AP数和高AL数的组合支持自噬激活的观点，特别是在AP与溶酶体融合以在ACTN2mut hiPSC CMs中形成自溶体的步骤。

综上所述，这些数据表明，在2D培养的ACTN2mut hiPSC-CM中，这两个蛋白质降解系统的活性较高，最有可能消除导致蛋白质病变的蛋白质聚集体。

3.5. ACTN2mt hiPSC-CM在工程心脏组织中表现出力损伤

ACTN2mut hiPSC-CM中几种肌节相关蛋白的低丰度(表S1)提示收缩功能受损。因此，我们评估了30天后3D EHT中ACTN2wt和ACTN2mut的力振幅和动力学(图5A、 B）。从第9天开始，未经处理的ACTN2mut EHT产生的力明显低于ACTN2wt EHT(图5C） ●●●●。ACTN2mut组的心跳频率显著高于ACTN2wt EHT组（从第21天开始，分别为每分钟50次和28次(图5D） ●●●●。为了比较与可变基线频率无关的功能参数，对EHT进行1 Hz的电起搏（视频S3和S4）。EHT收缩痕迹显示ACTN2mut的收缩力明显低于ACTN2wt EHT(图5E、 F）。归一化平均力的峰值时间缩短了19%（TTP_−80%;图5G、 H）和25%的松弛时间（RT_80%;图5G、 I）在ACTN2mut EHT中。在1.5和2 Hz时获得了类似的结果（数据未显示）。总的来说，ACTN2mut EHT表现出明显的力损伤，这可以解释为在2D培养的hiPSC-CM中检测到的肌节相关蛋白明显缺乏(表S1)和EHT(表S3).

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图5

三维培养hiPSC工程心脏组织的力测量.的代表性图像(A类)ACTN2wt和(B类)ACTN2mut EHT培养30天（比例尺=1 mm）。(C类)力和(D类)在EHT培养基或1.8 mM Ca中，在未经包装的条件下测量每分钟心跳次数²⁺37°C下的Tyrode溶液（ACTN2wt:N/d=27–44/3，ACTN2mut:N/d=32–44/3）。(E类)平均力(F类)力(G公司)标准化力(H（H）)峰值时间−80%（TTP_−80%)，以及(我)基线松弛时间80%（RT_80%)在1.8 mM Ca下以1 Hz的频率测量²⁺37°C下的Tyrode溶液（ACTN2wt:N/d=37/3，ACTN2mut:N/d=37/3）；数据表示为平均值±SEM对-通过混合效应分析和Sidak对混合批次（面板）进行的多次比较试验获得的值C类,D类)或使用嵌套吨-测试与ACTN2wt（面板F类,H（H）,我). 缩写：EHT，工程心脏组织；N/d，EHT数量/差异。

4.讨论

这项研究调查了行动2hiPSC-CM中的基因变异（c.740C>T；p.Thr247Met）。与ACTN2wt相比，ACTN2mut hiPSC-CM表现出（i）细胞肥大、肌原纤维紊乱、多核化、ACTN2蛋白聚集以及2D培养中UPS和ALP的激活，（ii）2D和EHT中肌粒相关蛋白水平显著降低，以及（iii）EHT中的力损伤。这些发现表明，肌生成障碍和蛋白质病变是ACTN2mut的典型特征。

我们复制了先前在2D培养的杂合ACTN2（ACTN2het）hiPSC CMs中观察到的发现[8]例如ACTN2mut hiPSC-CM中的肥大和肌原纤维紊乱。此外，病变细胞表现出与肌节功能和蛋白质沉积有关的通路的失调，ACTN2mut EHT表现出力损伤，类似于DCM表型[27,28,29,30]. 这与一些肌节蛋白的低丰度相一致，包括ACTN2mut hiPSC-CM中的ACTN2，导致肌节发育不良，可能导致心肌细胞更加不成熟。此外，SYNPO2和SYNPO2L通过与丝蛋白和ACTN2的相互作用，有助于Z盘的早期组装和稳定[22,27]也不太丰富，支持ACTN2相互作用组的破坏和ACTN2mt hiPSC-CM中肌节发育不足。通过活细胞成像，外源MUT-ACTN2在ACTN2wt中的Z盘整合减少，支持突变ACTN2对聚集的敏感性。相反，ACTN2mut中的外源WT-ACTN2改善了肌节整合，并部分替代了内源性突变体，但未改变ACTN2的总水平。肌节掺入和聚集之间的负相关表明，非掺入突变蛋白形成聚集，并导致ACTN2mut hiPSC-CM中ACTN2蛋白的低水平。之前对两个行动2错义变异体（p.Ala119Thr和p.Gly111Val）也位于钙调素同源域，显示出类似的表型[31]. 通过生化检测，这两个突变体与F-actin的结合亲和力降低，并且在mEos2-tagged基因转移后Z盘定位和动态行为发生改变行动2成年心肌细胞。

本研究中发现的ACTN2mut hiPSC-CM中参与蛋白质平衡的几种蛋白质的较高水平，如UPS和ALP，与之前HCM隔膜切除术中的发现一致[32]. 这与蛋白酶体的高糜蛋白酶样活性和ACTN2mut hiPSC-CM中ALP的全局激活有关。尽管其他人已经表明WT ACTN2被UPS降级[33]通过Western blot和蛋白质组学分析，在ACTN2mut系中检测到的低ACTN2蛋白水平不太可能是由于UPS或ALP降解所致。这表明UPS和ALP的整体激活是相当补偿的，对ACTN2聚集的保护机制。ACTN2和其他几种肌节蛋白的低丰度可能反映了mRNA翻译和蛋白掺入肌丝的减少，以维持肌节的整体化学计量[34]. 这可能解释了ACTN2mut hiPSC-CM中肌节形成不良和减少的原因。最近在携带p.Gly1674X或p.Val1668_Gly1674 del的hiPSC-CM中报道了Z盘蛋白周转的改变以及随后的自噬激活FLNC公司变异，分别导致单倍体不足和错误折叠的蛋白质[35]. 同样，携带p.Gly2151Ser或p.Ala1539Thr FLNC变体的HCM患者的心肌标本中也报告了FLNC蛋白聚集和肌原纤维紊乱，并且与心脏性猝死的高风险相关[36]. 这些数据强调了蛋白质毒性在FLNC公司-并推测其治疗潜力。

在ACTN2mut EHT中发现的功能缺陷与最近的一项疾病模型研究一致，该研究调查了磷蛋白聚糖（PLN[29]). 作者表明，在PLN引起的hiPSC-CM和EHT的低收缩状态下，未折叠蛋白反应的激活是一种补偿和保护机制。p.Arg14del小鼠模型中PLN蛋白聚集体的证据进一步支持了这些发现[37]. 有趣的是，在功能缺陷出现之前，观察到PLN聚集体和改变的蛋白质稳态途径。

迄今为止，只有一项研究调查了纯合子截断行动2突变携带者中与RCM相关的变异体（p.Gln860Stop）[6]. 相应的hiPSC-CM表现为肥大、收缩力受损和肌原纤维紊乱。与我们的发现相反，ACTN2蛋白水平没有降低。然而，由于C端截短，作者认为蛋白质-蛋白质相互作用的丧失是疾病发展的主要原因。这意味着截断和错义的操作模式不同行动2变体，进一步取决于受影响的功能域。然而，这些发现与ACTN2mut EHT收缩功能减弱一致，因为患者受到纯合截断的影响行动2变异体（p.Gln860Stop）在23岁时发展为RCM和心力衰竭[6]. 根据本研究中发现的心肌病表型的严重程度，结合最近的证据行动2链接到HF[38]，可以假设患者携带纯合子行动2错义变体会导致DCM或RCM导致HF。

总之，本研究揭示了p.Thr247Met的额外细胞病理学行动2变异，导致蛋白质病。我们的数据表明ACTN2mut hiPSC-CM中蛋白水解机制的（补偿性）激活可能“应对”蛋白质聚集。

5.研究限制

在使用hiPSC-CM时，重要的是要考虑模型的可能局限性，例如基因组完整性不稳定、hiPSC系的存储、不成熟和重复性（有关综述，请参阅[39,40,41]). 为了遵守最佳细胞培养实践，我们应用常规核型分析和基因分型，并建立了每个hiPSC株的主细胞库[42]. 然而，使用CRISPR/Cas9遗传工具和同源性定向修复（HDR）从ACTN2het-hiPSC系中产生了ACTN2wt和ACTN2mut-hiPSC系。我们发现两个hiPSC株系都有一个正确的WT或MUT等位基因，而HDR后的另一个重组等位基因包含额外的CRISPR/Cas9介导的位点缺陷，即ACTN2wt的剪接突变([19])ACTN2mut的大规模基因组重排(图S1A、B)都会导致无意义的mRNA(图S2D; [19]). 因此，其结果是ACTN2wt心肌细胞中只存在WT mRNA和蛋白质，而ACTN2mut心肌细胞仅显示MUT mRNA和蛋白，这使得这两种细胞系仍然值得比较。另一个局限性是，我们无法确定ACTN2聚集体的形成是否有害，是否有助于疾病进展，或者更有益于避免肌节并入突变蛋白。

致谢

补充资料

以下支持信息可在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/cells11172745/s1图S1:ACTN2wt和ACTN2mut细胞系的产生；图S2：心脏分化和mRNA和蛋白质分析的验证；图S3：在2D培养的hiPSC-CM中进行的高含量筛选的代表性数据；表S1:2D培养的ACTN2mut与ACTN2wt hiPSC-CM中肌节相关蛋白的RNA-seq和质谱分析；表S2:2D培养的ACTN2mut与ACTN2wt hiPSC-CM中UPS和ALP的RNA-seq和质谱分析；表S3：3D培养的ACTN2mut与ACTN2wt hiPSC CMs中肌节相关蛋白的RNA-seq和质谱分析；表S4：使用nanoString计数器评估的基因缩写和名称^®元素技术；表S5:LC-MS/MS参数（数据相关模式、光谱库）；表S6:LC-MS/MS参数（数据独立模式；定量数据）；补充实验程序：道德声明、2D和EHT格式的hiPSC衍生心肌细胞（hiPSC-CM）的生成和培养、Southern blot DNA分析、hiPSC-CMs的免疫荧光染色、2D培养hiPSC-MM的形态学分析、2D培育hiPSC-CRM的活细胞成像、，二维培养hiPSC-CM的高含量成像、RNA分离和基因表达分析、Western blot分析、蛋白酶体类糜蛋白酶活性的测定、蛋白质组分析、腺相关病毒载体颗粒的制备和纯化；数据集S1:IPA分析的2D ACTN2mut hiPSC-CM MS数据；数据集S2:IPA分析的2D ACTN2mut hiPSC-CM的RNA-seq数据；视频S1：与WT转产的ACTN2wt hiPSC-CM签订合同-行动2HaloTag；视频S2：承包用MUT转产的ACTN2wt hiPSC-CM-行动2HaloTag；视频S3：承包ACTN2wt EHT。视频S4。承包2万吨EHT[8,15,17,21,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58].

资金筹措表

这项工作得到了德国心血管研究中心（DZHK）对M.P.、M.D.L.、E.H.、U.V.和L.C.的全部或部分支持，德国研究教育部（BMBF）对M.P.、M.D.L.、E.H.、U.V.和L.C.的支持，德国Herzstiftung（F/51/17）对Sa.S的支持，Helmut und Charlotte Kassau Stiftung对L.C.的支持。，欧洲研究委员会对T.E.的高级拨款（IndivuHeart），对A.T.L.Z.、M.P.和M.D.L.的医学院（汉堡）研究促进基金（“临床医生计划”和“年轻科学家项目资助”），对L.C.的Leducq基金会（20CVD01），国家更换、改进中心，将研究中的动物减少到D.M.（NC3Rs:NC/S001808/1），将埃克塞列齐亚前体4.0减少到S.R.S。

作者贡献

概念化和分析：A.T.L.Z.、M.P.和L.C。；方法和调查：CRISPR/Cas9:M.P.和N.P。；克隆和病毒生产：A.T.L.Z.、S.R.S.和I.B。；心脏分化：A.T.L.Z.、M.P.、N.P.和A.M。；细胞培养、转导和处理：A.T.L.Z.、M.P.、M.M.-J.、J.B.、C.S.B.、A.M.和G.M。；EHT生成、维护和测力：上午。；免疫荧光和活细胞成像：A.T.L.Z.、M.P.和J.B。；蛋白质组学/生物信息学：E.H.、M.D.、M.G.S.、U.V.和M.P。；RNA分离和基因表达分析：M.P.、M.D.L.和E.K。；RNA-seq:D.I.和S.V。；Omics分析：A.T.L.Z.、M.P.、S.V.和L.C。；蛋白质印迹：S.R.S.、E.O.、E.A.和S.S。；高含量成像：D.M。；书面原稿：A.T.L.Z.、M.P.和L.C。；写作-审查和编辑：A.T.L.Z.、M.P.、S.R.S.、A.M.、M.D.L.、M.D.、D.M.、U.V.、W.T.P.、T.E.、E.H.、S.S.和L.C.所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。

机构审查委员会声明

所有程序均符合《世界医学协会道德规范》（赫尔辛基宣言）。该研究由汉堡大学道德委员会（PV3501）审查和批准。

知情同意书

携带杂合子的HCM患者行动2（c.740C>T；dbSNP ID:rs755492182）突变是在汉堡大学心脏和血管中心的门诊HCM诊所招募的，并为基因分析和皮肤成纤维细胞的使用提供了书面知情同意书[8].

数据可用性声明

应要求，将向其他研究人员提供数据集、分析和研究材料，以再现结果或复制程序。材料和的完整说明见补充资料OMIC实验的所有数据均已公开。质谱数据已通过数据集标识符为PXD034258的PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange Consortium。RNA-seq数据已保存在欧洲核苷酸档案馆（ENA）EMBL-EBI，登记号为PRJEB52889。

利益冲突

A.M.现在是阿斯利康的员工和股东。通用现在是DiNAQOR的员工。T.E.和L.C.是DiNAQOR科学咨询委员会的成员，并持有DiNAQOR的股份。其余作者声明没有相互竞争的利益。

脚注

工具书类