炎症脱髓鞘过程中，小胶质细胞通过MiR‐126a‐5p/MMP9轴调节血脑屏障完整性

2.2. 小胶质细胞中Mir‐126a‐5p与炎症性脱髓鞘过程中BBB损伤呈负相关

MiRNAs在MS的发病机制中起着关键作用。虽然在许多不同的细胞类型中报道了MS相关的MiRNAs调控，但其对BBB完整性的作用仍然是个谜。^{[ 31 ]}为了探讨炎症脱髓鞘过程中BBB破坏的小胶质细胞机制，我们比较了EAE小鼠BBB破坏高峰前后分类小胶质细胞的miRNome(图  2A类). 我们根据之前的研究选择了EAE进展中的时间点，^{[ 32 ]}这表明第5天为早期阶段，第15天为中期阶段，第25天为晚期阶段。

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图2

小胶质细胞miR‐126a‐5p与EAE和MS的BBB损伤呈负相关。A）与Ctrl组（Naive microglia）相比，EAE小鼠脊髓小胶质细胞FACS中miRNA表达谱的热图显示了上调或下调的miRNA。N个=3个独立的重复（每组包含5只小鼠）。B） 描述重叠四种条件的miRNA的维恩图：早期（1）或中期（2）组与Ctrl组的差异miRNA，（3）共表达分析，以及（4）miRNA丰度层次中的TOP 50。使用Holm–Sidak多重比较测试的单向方差分析。对显示每个Ctrl组的值。左侧：N个=每组6人。正确的：N个=每组5人。D） miR‐126a‐5p在EAE不同阶段的代表性图像。箭头表示Iba‐1⁺miR‐126a‐5p⁺细胞。星星表示Iba‐1⁺miR‐126a‐5p^–细胞。比例尺：20µm。N个=每组3只小鼠。E） 使用LFB‐PAS染色对MS病变进行组织学分析。比例尺：50µm。N个=每组8人。F） 不同MS病变部位miR‐126a‐5p的代表性图像。注意更多的Iba‐1⁺miR‐126a‐5p⁺慢性活动斑块中心的细胞（箭头），而更多的Iba-1⁺miR‐126a‐5p⁻细胞（恒星）在边缘（虚线）附近。比例尺：20µm。N个=每组8人。G） Iba‐1的定量分析⁺miR‐126a‐5p⁺/伊巴-1⁺EAE患者腰椎脊髓中的细胞。N个=每组3只小鼠。H） Iba‐1的定量分析⁺miR‐126a‐5p⁺/伊巴-1⁺MS.N=8个细胞/组。（G，H）中使用了带有Tukey多重比较测试的单向方差分析。数据显示为平均值±SEM。

EAE小鼠的BBB损伤经历了一个加重然后部分缓解的过程（图1B年). 为了筛选与BBB完整性相关的小胶质细胞miRNA，将FACS分类的早期（D5）（集合1）和中期（D15）（集2）小胶质细胞的miRNA谱分别与对照组（Ctrl）进行比较（图2B型). 我们选择了与EVB外渗模式同步的miRNAs（|R|>90%，对<0.05），小胶质细胞中前50个miRNAs丰度为4（另见表S1（第一阶段），支持信息）（图2B型). 因此，我们确定了六个重叠的miRNAs（图2B型)其丰度最高，差异显著，表达模式与BBB的渗透性变化一致。我们对这些miRNAs进行了QPCR验证（图2摄氏度). 具体而言，我们发现miR‐126a‐5p的表达在D5短暂降低，随后出现不完全恢复（图2A、C). 因此，EAE小鼠小胶质细胞中miR‐126a‐5p的水平与BBB损伤呈负相关，BBB损伤在前5天内达到峰值，在随后几天内得到部分缓解（图1B，C).

为了进一步表征miR‐126a‐5p的表达，我们进行了荧光原位杂交（FISH）分析。结果表明，在D5脊髓小胶质细胞中miR‐126a‐5p水平显著下调，并在D15和D25逐渐恢复（图二维，G).

考虑到miRNA的保守性，我们还检测了MS患者脑切片中miR‐126a‐5p的表达模式（图第二版). 与正常出现的白质（NAWM）相比，miR‐126a‐5p水平在急性活动性病变中极低，但在慢性非活动性病变的小胶质细胞中显著增加。我们还发现miR‐126a‐5p的百分比⁺慢性活动性病变中心（BBB损伤缓解区）的小胶质细胞高于病变边缘（图2F、H).

2.3. 骨髓细胞Mir‐126a‐5p缺乏增加BBB通透性并加重EAE进展

为了评估EAE进展期间小胶质细胞miR‐126a‐5p在BBB完整性中的功能，我们使用骨髓细胞特异性敲除小鼠（LysM^克里：miR‐126^{飞行/飞行}，LysM‐126KO）（图5安，支持信息）。正如预期的那样，脊髓Iba‐1阳性小胶质细胞中miR‐126a‐5p的水平显著降低（图5亿，支持信息）。EVB外渗结果表明，LysM‐126KO小鼠的BBB损伤比对照EAE小鼠（LysM^Cre公司：miR‐126^+/+，LysM‐Ctrl）（图S5C系列，支持信息）。通过白蛋白免疫染色，我们还发现LysM‐126KO组的BBB损伤比对照组更严重（图S5E系列，支持信息）。有趣的是，LysM‐126KO组早期的白蛋白渗出似乎很显著（图中的插入物S5E系列，支持信息）。因此，LysM‐126KO小鼠的EAE评分高于对照组（图S5D系列，支持信息）。此外，髓细胞miR‐126a‐5p基因敲除增加了炎性细胞浸润和脱髓鞘（图第5章F、 G，支持信息），通过LFB‐PAS和荧光髓磷脂染色显示。这些结果表明，髓系细胞中的miR‐126a‐5p对于保护BBB完整性和缓解EAE进展是必要的。

2.4. 小胶质细胞中MiR‐126a‐5p缺乏会加剧血脑屏障破坏和EAE进展

据报道，多种髓系细胞参与了多发性硬化症的发展。^{[ 17,33 ]}为了进一步了解小胶质细胞miR‐126a‐5p在EAE中的具体作用，我们使用CX3CR1^CreER公司：miR‐126^{飞行/飞行}（CX3CR1‐126CKO）小鼠特异性删除小胶质细胞中miR‐126a‐5p(图  三A类). Iba‐1中miR‐126a‐5p的水平确实降低了⁺三苯氧胺诱导28天后脊髓中的小胶质细胞（图3B、C). EVB外渗试验表明，CX3CR1‐126CKO EAE小鼠的BBB受损程度比CX3CR1−Ctrl EAE小鼠更严重（图三维). 非EAE CX3CR1‐126CKO小鼠的血脑屏障没有显著破坏（图三维)提示小胶质细胞miR‐126a‐5p可能在病理条件下维持BBB完整性方面发挥关键作用。此外，白蛋白外渗在CX3CR1-126CKO组比CX3CR1-Ctrl组更显著，尤其是在晚期（图第三方). 电镜分析显示，与对照组相比，CX3CR1‐126CKO组的基底膜随着空泡的形成而变得不连续。此外，在CX3CR1‐126CKO小鼠中，相邻内皮细胞之间的紧密连接从毛细血管腔分离到基底膜（图第三层). 一贯地，CX3CR1‐126CKO小鼠的EAE评分较高（图第三代移动通信)与对照组相比，细胞浸润和脱髓鞘更多（图3H–J型)苏木精-伊红（H&E）和LFB‐PAS染色显示。这些结果表明，小胶质细胞miR‐126a‐5p缺乏加剧了BBB破坏和EAE进展。

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图3

小胶质细胞中miR‐126a‐5p的消融加剧了BBB渗漏和EAE进展。A） 小胶质细胞特异性miR‐126a‐5p条件敲除小鼠的生成示意图。B、 C）小胶质细胞中miR‐126a‐5p的表达分别由FISH和QPCR测定。箭头表示Iba‐1⁺miR‐126a‐5p⁺细胞。箭头表示Iba‐1⁻miR‐126a‐5p⁺细胞。星星表示Iba‐1⁺miR‐126a‐5p⁻细胞。比例尺：50µm。在（B）中：N个=9个控制字段（CX3CR1^CreER公司:126^+/+，CX3CR1‐Ctrl）组；N个=条件敲除的8个字段（CX3CR1^CreER公司:126^{飞行/飞行}，CX3CR1‐126CKO）组。在（C）中：N个=每组3只小鼠。D） 代表性图片显示，在之后的第15天，CX3CR1-Ctrl或CX3CR1-126CKO小鼠在带有或不带有EAE的情况下的BBB完整性静脉注射.通过光学成像进行EVB注射。N个=每组3只小鼠。E） 共焦的代表性正交投影z（z）轴堆栈显示白蛋白（红色）在腰椎脊髓中的泄漏超出血管边界（层粘连蛋白，绿色）。比例尺：50µm。N个=每组3只小鼠。F） D15上BBB的EM分析。白色箭头，基底膜。箭头，相邻内皮细胞之间的紧密连接。黑色箭头，内皮细胞空泡化，邻近组织严重水肿。比例尺：2µm。N个=每组3只小鼠。G） EAE小鼠的临床评分。N个=CX3CR1‐Ctrl组的10只小鼠。N个=CX3CR1‐126CKO组的11只小鼠。H、 I）EAE小鼠H&E和LFB‐PAS染色后的代表性脊髓切片。比例尺：200µm。J） 浸润和脱髓鞘程度的组织学分析。N个=每组3只小鼠，用于两种染色。未付费学生的t吨测试用于（B、C、J）。使用Holm的单向方差分析–Sidak的多重比较测试用于（D，E）。Mann–Whitey检验用于（G）。数据显示为平均值±SEM。

星形细胞末梢、内皮细胞、周细胞和小胶质细胞形成构成BBB的神经血管单元。^{[ 34 ]}我们在研究中进一步监督了这些成分的任何变化。如Aqp4染色所示，BBB处星形胶质细胞终末中高度富集的水通道，miR‐126a‐5p组的小胶质细胞消融显示星形胶质细胞末梢破坏增加，通过药理学和遗传学方法，小胶质细胞耗竭可改善这种破坏（图S6系列，支持信息）。我们还得出结论，miR‐126a‐5p的小胶质细胞消融导致CD31减少⁺内皮细胞活化，而小胶质细胞耗竭挽救了它（图S6系列，支持信息）。miR‐126a‐5p诱导的并发PDGFR小胶质细胞消融β ⁺周细胞缺陷，通过小胶质细胞耗竭得到改善（图第7部分，支持信息）。

2.5. 小胶质细胞中的Mir‐126a‐5p对保持内皮细胞屏障完整性至关重要

为了探讨小胶质细胞中miR‐126a‐5p对BBB完整性的直接影响，我们使用来自小胶质细胞的条件培养基（CM）在跨孔插入物中培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行了细胞旁通透性测定。我们发现，来自小胶质细胞的CM感染了编码miR‐126a‐5p‐干扰序列的慢病毒，导致异硫氰酸荧光素（FITC）‐右旋糖酐的扩散增加（图S8A系列，支持信息）。相反，感染编码miR‐126a‐5p序列慢病毒的小胶质细胞CM对屏障有保护作用，表现为扩散液中荧光强度较低（图S8A，支持信息）。我们还测量了内皮单层的跨内皮电阻（TEER），电阻越高，表明屏障越紧密。^{[ 35 ]}miR‐126a‐5p‐i组屏障的电阻抗显著降低，表明屏障完整性遭到破坏（图S8B型，支持信息）。相反，miR‐126a‐5p‐OE组屏障的阻抗增加，表明屏障的完整性保持不变。免疫荧光染色（图第8节C、 D，支持信息）和免疫印迹分析（图第8节E、 F，支持信息）进一步证实了miR‐126a‐5p‐OE组中ZO‐1和闭塞素（OCLN）的表达增加，而miR‐）-126a‐5 p‐i组中这些紧密连接蛋白的表达减少。为了证实miR‐126a‐5p在BBB完整性中的功能，我们进一步使用培养的小鼠脑微血管内皮细胞（BMVEC）。同样，miR‐126a‐5p‐i组BMVEC的TEER较低，miR−126a­5p­OE组较高，分别表现出屏障完整性的破坏和保护（图S8G系列，支持信息）。此外，我们通过miR-126a-5p模拟物操纵小胶质细胞中的miR-126a‐5p。用miR‐126a‐5p模拟物孵育的小胶质细胞CM可显著增加BMVEC中的ZO‐1水平（图S8H–J型支持信息），进一步证实小胶质细胞中的miR‐126a‐5p维持屏障完整性。综上所述，这些结果表明小胶质细胞miR‐126a‐5p对保护内皮细胞体外屏障完整性至关重要。

2.6. MMP9服务器是小胶质细胞Mir‐126a‐5p的目标

为了研究小胶质细胞miR‐126a‐5p作用的机制，我们首先测量了活性氧（ROS）、白细胞介素-1（IL-1）的产生β（IL‐1）β)、肿瘤坏死因子（TNF‐α)以及已知调节BBB完整性的小胶质细胞中的一氧化氮（NO）。^{[ 三,36 ]}结果表明，操纵小胶质细胞中的miR‐126a‐5p并不影响这些炎症介质的水平（图第9部分，支持信息）。

为了确定小胶质细胞中miR‐126a‐5p的潜在靶点，我们进行了蛋白质阵列分析，以检测转染了miR-126a-5p拟态或NC拟态（对照拟态）的LysM‐126KO小胶质细胞的小胶质细胞裂解物上清液(图  4A–C; 表S2系列，支持信息）。通过比较两组之间的差异蛋白谱，并基于靶点预测网站（TargetScan、TarBase、RNAhybrid）分析miR-126a‐5p的靶基因，鉴定出五种重叠分子（基质金属蛋白酶9、Sonic Hedgehog、E‐selectin、C反应蛋白和Toll样受体4）。其中，我们选择了基质金属肽酶9（mmp9），它是小胶质细胞特异性高表达的^{[ 37 ]}和变化最显著的基因（logFC=−1.59，第页=0.011，表S2系列支持信息），作为miR‐126a‐5p的候选目标进行进一步调查。

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图4

MMP9是小胶质细胞中miR‐126a‐5p的靶点。A） 散点图、B）火山图和C）热图显示了miR‐126a‐5p模拟物组和NC模拟物组之间小胶质细胞中差异表达的蛋白质。N个=每组3人。D） ELISA法检测小胶质细胞上清液中MMP9的水平。N个每组≥3个。E） 如图所示，小胶质细胞中MMP9的免疫印迹和密度分析。N个=每组6人。F） 上图：物种间MMP9 mRNA 3'UTR中推测的miR‐126a‐5p结合位点。底部：miR‐126a‐5p、靶保护物（TP）或突变miRNA（Mut miRNA）与MMP9 3'UTR或突变mRNA 3'UTR（Mut UTR）的序列比对。G） 左图：携带MMP9 3'UTR或突变mRNA 3'UTR-（Mut-UTR）的报告者的荧光素酶活性与miR-126a-5p模拟物、模拟控制物（miRNA-NC）或突变miRNA（Mut-miRNA）共同转染到HEK293T细胞。N个=每组3人。右：与MMP9 mRNA 3'UTR和miR‐126a‐5p共转染的HEK293T细胞中报告者的荧光素酶活性模拟携带TP或Ctrl（TP‐NC）。N个=每组9人。（H） ELISA显示EAE小鼠脑脊液中MMP9水平。N个=每组3人。一） 表明EAE小鼠腰椎脊髓小胶质细胞中MMP9的代表性图像。的正交投影z（z）轴叠加显示MMP9和Iba‐1在小胶质细胞中的共同定位。比例尺：50µm。N个=每组9人。使用Holm的单向方差分析–Sidak的多重比较测试用于（D，G，H，I）。未付费学生的t吨在（D，E）中使用了‐test或Mann-Whitney测试。（G）中使用了Kruskal–Wallis检验和Dunnett的多重比较检验。数据显示为平均值±SEM。

为了在体外确定miR‐126a‐5p和mmp9之间的关系，我们对野生型小胶质细胞（WT MG）上清液或LysM‐126KO小鼠（126KO MG。结果表明，miR-126a-5p上调（miR-126a‐5p‐OE或miR‐126a-5p-mimics）降低了MMP9的水平，而miR-126 a-5p下调（miR-26a‐5 p-i）增加了MMP九的水平（图4D（四维）). 此外，Western blotting进一步证实miR‐126a‐5p模拟物显著降低了野生型和126KO小鼠小胶质细胞中MMP9的水平（图第四版). 因此，miR‐126a‐5p能够调节小胶质细胞中MMP9的表达。

为了检测miR‐126a‐5p是否能与mmp9基因直接相互作用，我们进行了荧光素酶报告分析。如图所示4楼mmp9的3'UTR中存在miR‐126a‐5p的潜在结合位点，该位点在不同物种间高度保守。事实上，miR‐126a‐5p与mmp9的3'UTR位点特异性相互作用以抑制荧光素酶活性，因为miR‐126a‐5p序列或3'UTR上的突变将减轻抑制（图4G网络). 此外，LNA修饰的靶保护物（TP）可以减轻miR‐126a‐5p对mmp9 3'UTR的抑制（图4G网络). 综上所述，这些结果表明miR‐126a‐5p通过与其3'UTR结合对mmp9表达产生抑制作用。

接下来，我们测试了miR‐126a‐5p是否调节体内MMP9的表达。如ELISA所示（图4小时)与对照组（CX3CR1‐Ctrl）小鼠相比，在EAE期间，CX3CR1−126CKO小鼠的脑脊液（CSF）显示MMP9激增。此外，免疫组织化学研究显示，在EAE进展中，CX3CR1-126CKO小鼠小胶质细胞中的MMP9水平持续高于非敲除组。这些结果表明，小胶质细胞中miR‐126a‐5p的缺乏导致EAE小鼠中枢神经系统中MMP9的高水平。

2.7. MMP9对小胶质细胞Mir‐126a‐5p缺乏诱导的BBB损伤必不可少

为了研究MMP9在EAE期间miR‐126a‐5p依赖性BBB损伤中的作用，我们首先进行了药理学研究。在MOG免疫前后给CX3CR1‐126CKO小鼠服用MMP9抑制剂I‐1（MMP9 I‐1）(图  5A类). EVB外渗试验表明，与溶媒组相比，MMP9I‐1治疗后BBB损伤减轻（图5亿). MMP9I‐1治疗组CX3CR1‐126CKO小鼠的EAE评分也降低（图5摄氏度).

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图5

MMP9对于miR‐126a‐5p小胶质细胞消融诱导的BBB损伤必不可少。A） miR‐126a‐5p小胶质细胞消融和MMP9抑制剂（MMP9I‐1）给药方案。B） 典型图像显示，在D25上给药或不给药MMP9I‐1的CX3CR1‐126CKO EAE小鼠中，BBB完整性。N个=每组3只小鼠。C） MMP9I‐1治疗的CX3CR1‐126CKO EAE小鼠的临床评分。N个=车辆为5。N个=MMP9I‐1的7。D） CX3CR1‐126CKO EAE小鼠中小胶质细胞特异性MMP9抑制方案。E） 代表性图像显示，CX3CR1‐126CKO EAE小鼠在D25上有或没有细胞特异性MMP9抑制的BBB完整性。N个=每组3只小鼠。F） 转染DIO‐MMP9‐i‐AAV的CX3CR1‐126CKO EAE小鼠的临床评分。N个=每组5人。G） 具有或不具有小胶质细胞MMP9抑制的CX3CR1‐126CKO小鼠BBB的EM分析。左侧面板中的框在右侧面板中被放大。AAV‐DIO‐Ctrl‐i组基底膜不连续，一些紧密连接分离并松动。相反，AAV‐DIO‐MMP9‐i组保留了连续的基底膜和紧密的连接。比例尺：2µm。N个=每组3人。H） YFP、白蛋白、层粘连蛋白和Hoechst的代表性图像显示D25腰椎脊髓切片中的BBB完整性。注意白蛋白泄漏的边界（箭头）（星形）和层粘连蛋白的边界⁺船只（虚线）。一） 定量分析（H）中白蛋白的相对强度。N个对于AAV‐DIO‐MMP9‐i组，=6。N个=7，对于AAV‐DIO‐Ctrl‐i组。未付费学生的t吨测试用于（B，E）。Mann-Whitney检验用于（C，F）。数据显示为平均值±SEM。

接下来，我们构建了一种Cre驱动的AAV，以基因下调MMP9（AAV‐DIO‐MMP9‐i）。鞘内注射AAV‐DIO‐MMP9‐i耗尽小胶质细胞中的MMP9后，用MOG免疫CX3CR1‐126CKO小鼠（图第五天). 我们发现，与对照组（AAV-DIO-Ctrl-i）相比，AAV-DIO‐MMP9‐i组的BBB泄漏大大减轻（图第五版)而AAV‐DIO‐MMP9‐i组的EAE评分显著降低（图5英尺).

电子显微镜分析表明，AAV‐DIO‐MMP9‐i组腰椎血管内皮的基底膜保留良好（图5克). 相反，AAV‐DIO‐Ctrl‐i组基底膜不连续，伴有松散或分离的紧密连接。免疫25天后，CX3CR1‐126CKO小鼠的AAV‐DIO‐MMP9‐i组腰椎脊髓中的白蛋白渗出持续减少（图5H，我).

EAE诱导

如前所述进行EAE诱导。^{[ 45,81 ]}简言之，用含有热灭活的完全弗氏佐剂的MOG35-55（100µg/小鼠，GL Biochem）对雌性C57BL/6小鼠（8-10周）进行皮下免疫结核分枝杆菌（H37Ra菌株；Difco）。在第0天和第2天腹腔注射PBS中的百日咳毒素（200 ng/只小鼠，钙生物化学-EMD化学品）。独立研究人员每天对小鼠进行盲目的疾病体征检查，并按照0-5分制进行评分，如下所示：0，无临床体征；1、尾巴麻痹；2、轻瘫；3、截瘫；4、截瘫伴前肢无力或瘫痪；5、垂死或死亡。

PLX5622导致小胶质细胞耗竭

该药物按照TargetMol的方案（编号：1303420‐67‐8）制备。简言之，将PLX5622原液以79 mg/mL的浓度溶解在二甲基亚砜（DMSO）中⁻¹(199.79 × 10⁻³ 米); 制备0.5%羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）作为稀释剂。在每个给药日，通过添加1体积的药物储备（79 mg mL）将PLX5622储备稀释10倍⁻¹)在9体积稀释剂中，制备7.9 mg mL的工作溶液⁻¹用稀释剂和二甲基亚砜的混合物制备车辆溶液。为了消除EAE模型中的小胶质细胞，自MOG免疫前14天起每天灌胃给药指定浓度的PLX5622，直至处死。

EVB荧光的光学成像

如前所述，BBB通透性在体内测定。^{[ 26 ]}简单地说，在指定的时间点，将PBS（pH 7.4）中的100µL 1%（w/v）Evans blue（Sigma‐aldrich）以5的剂量静脉注射到小鼠的尾静脉中μL克⁻¹体重。注射后4小时，对小鼠进行麻醉，并灌注PBS和多聚甲醛。大脑和脊髓被切除并放置进行光学成像。光学平面荧光成像系统（Quick View 3000，Bio‐Real，Austria）用于量化EVB染料荧光积聚的程度，激发和发射滤光片分别设置为655和716 nm。

脊髓源性小胶质细胞的流式细胞术分离

小胶质细胞（CD11b⁺/CD45型^整数)如前所述进行了纯化。^{[ 45 ]}将正常或EAE小鼠的脊髓分离、均质、过滤、离心并悬浮在70%Percoll（GE Healthcare）中，并覆盖37%和30%的梯度。离心后，收集了37%和70%Percoll界面中的大多数单核细胞。按照制造商的说明（BD Biosciences），将这些细胞与小鼠CD16/CD32抗体（BD生物科学）孵育5分钟，并用PE标记的CD45和FITC标记的CD11b抗体或PE标记的CD45、APC标记的CD11-b和PE标记的Ly-6C进行表面染色。CD45型^整数/CD11b型⁺然后在Moflo XDP（Beckman Coulter）上对细胞进行评估和分类。CX3CR1‐YFP公司⁺/CD11b型⁺/CD45型^整数/赖氨酸-6C⁻细胞也通过BD LSRFortessa（BD Biosciences）进行评估。

人类MS组织标本

MS和对照病例样本（湿重/样本在1克到1.5克之间）由荷兰大脑银行慷慨赠送。根据记录，7名MS患者（年龄范围40-77岁；平均年龄56岁）的未固定全脑（pH值范围6.22-7.08；平均6.50）在荷兰脑库管理下于死亡后10小时内进行尸检（平均尸检延迟6.8小时）。使用来自7名不同多发性硬化患者的25个组织块和来自7名无任何已知神经疾病的受试者的7个组织块进行miRNA分析。这些福尔马林固定、石蜡包埋的多发性硬化组织样本是根据尸检MRI选择的。对照白质样本来自7名非痴呆受试者的供体。多发性硬化病变的特征如前所述，^{[ 81 ]}使用Luxol Fast Blue‐periodic acid Schiff（LFB‐PAS）染色。NAGM，通常表现为灰质，由神经元细胞体和相对较少的有髓鞘轴突组成。NAWM通常表现为白质，髓鞘完整。实质和血管周围炎性细胞浸润、髓鞘碎裂、脱髓鞘边缘模糊的病变被归类为急性活动性斑块。慢性活动性斑块分为广泛脱髓鞘、边界清楚、病变边缘有大量炎性细胞的斑块。慢性非活动性斑块被归类为具有广泛脱髓鞘和边界清楚，但脱髓鞘区域任何部分很少或没有炎性细胞的斑块。^{[ 19 ]}人体组织的收集和使用得到了中国上海市SMMU机构审查委员会（Li900）的批准。

细胞培养

产生中枢神经系统混合神经胶质细胞培养物，并在含有10%胎牛血清（D10；Invitrogen）和抗生素混合物（1%青霉素/链霉素；Invitrogen）的DMEM/F‐12中在37°C和5%CO下培养₂为了纯化小胶质细胞，在37°C下以180 rpm的速度摇晃培养物6小时以收集小胶质细胞。HUVEC（ATCC PCS‐100‐010）保存在康宁组织培养皿（康宁公司，纽约州康宁）上，湿度为5%CO₂如前所述，DMEM（Hyclone.sh30243.01）中95%的空气含有10%的胎牛血清。^{[ 82 ]}如报告所述，分离出BMVEC。^{[ 83 ]}简单地说，在脑膜分离后，将大脑皮层切碎并用0.6 mL胶原酶CLS2（10 mg mL）的混合物消化⁻¹在DMEM，沃辛顿，{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”LS004176“，”term_id“：”1321650548“}}LS004176号)和0.2 mL DNAse（1 mg mL⁻¹在PBS，沃辛顿，{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”LS002138“，”term_id“：”1321652586“}}LS002138型)在DMEM中。去除髓磷脂后，将颗粒重新悬浮在9 mL DMEM和1 mL胶原酶/脱氨酶中（最终浓度为1 mg mL⁻¹)0.1mL DNAse。悬浮、离心和再悬浮后，将消化后的细胞悬浮液添加到33%Percoll（17-0891-01，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）梯度上并离心。采集细胞的间期，离心，并将其重新悬浮在BD内皮细胞培养基中（基本培养基中含有以下成分：0.1 mg mL⁻¹肝素；0.03–0.05毫克毫升⁻¹内皮细胞生长补充剂。将细胞接种、培养并在90%的汇合处分裂。通过CD31免疫荧光染色鉴定纯化的BMVEC（Sigma‐Aldrich，P‐8590）。

细胞旁通透性测定

使用FITC‐右旋糖酐荧光素测定体外渗透性。^{[ 84,85 ]}将HUVEC接种到0.4µm孔12孔胶原涂层的Transwell嵌件上（康宁Costar Corp.，Cambridge，MA），5×10⁵并在BD内皮培养基（BD Biocoat内皮细胞生长环境；BD Bioscience，San Jose，CA）中培养。每隔一天更换一次培养基，将1.5 mL的培养基放在外室，将0.5 mL的培养液放在内室。当细胞在第5天汇合时，用所示的小胶质细胞条件培养基培养。在每个时间点，50µL 12.5 mg mL⁻¹将FITC‐右旋糖酐4（FD4，Sigma‐Aldrich，St.Louis，MO）添加到内室中，最终总体积为0.5 mL。为了测定细胞屏障的渗透性，在所示的每个时间点从外室中取出20µL的等分样品。使用NanoQuant Infinite M200 Pro（瑞士苏黎世帝肯）在490和520 nm的激发和发射波长下测量外渗的FITC‐右旋糖酐4。用已知浓度的连续稀释FITC-右旋糖酐4制备标准曲线。针对重复采样校正荧光素值。

经内皮细胞电阻分析

据报道，TEER分析用于检测培养的HUVEC和BMVEC的单细胞BBB通透性。^{[ 35,86 ]}简单地说，HUVEC或BMVEC接种于20万个细胞cm⁻²在实验前72小时，在胶原涂层的24孔跨孔嵌件（Corning）上。然后将细胞血清饥饿4小时，并用所示的小胶质条件培养基刺激。使用带EVOM2仪表的筷子电极在指定的时间点测量TEER（美国佛罗里达州世界精密仪器公司）。然后，减去在transwell插入物中没有细胞的情况下测得的空白TEER值。每厘米电阻²在刺激开始时（0h）计算并标准化为未处理的对照细胞。结果表示为减去空白过滤器后的稳态TEER值。

蛋白质阵列分析

培养24小时后收集小胶质细胞培养基，并通过20µm网眼（BD Falcon）过滤。抗体阵列（小鼠L308阵列；RayBiotech AAM‐BLG‐1‐2，GA，30092）用于分析小胶质细胞上清液中对miR‐126a‐5p过度表达的反应蛋白。每种蛋白质分三份进行检测，并在miR‐126a‐5p模拟物组和NC模拟物组之间比较308种蛋白质中每种蛋白质的平均值。阵列分析是按照制造商的指示进行的（中国广州瑞生物科技有限公司）。简单地说，蛋白质点击了基于生物素标签的G系列。使用纳米滴对点击的产品进行量化。按照制造商的建议，使用Cy3标记的链霉亲和素检测阵列。阵列使用InnoScan 300微阵列扫描仪（法国卡蓬，Parc d’activités Activestre）在532 nm处进行扫描。对于每个蛋白质，平均每个阵列上的重复点，减去局部背景荧光，并通过阵列上的内部阳性对照物对产生的荧光信号进行标准化。对用于显著性分析的基本统计数据进行调节t吨‐统计。结果包括褶皱变化和第页‐每种蛋白质和每种对比剂的值。差异表达蛋白（DEPs）是指那些具有第页‐值小于0.05，折合率大于1.2或小于0.83。

病毒感染与MiRNA模拟转染

将miR-126a-5p（miR-126a‐5p‐OE）（MIMAT0000137）或GFP单独（Ctrl-OE）的编码序列连接到GV287质粒（GeneChem）。将miR‐126a‐5p（miR‐126a‐5p‐i）或单独的GFP（Ctrl‐i）的siRNA连接到GV280质粒（GeneChem）中。miR‐126a‐5p siRNA的序列如下：5′-AAUUCUUUUUCAUUAUUACUUUGUACG‐3′。浓缩病毒颗粒的滴度在1×10之间⁸和2×10⁹转换单位mL⁻¹第2天将慢病毒颗粒添加到培养的小胶质细胞中。感染24小时后去除上清液，并用D10培养基替换。mmp9中的靶序列（GeneBank，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_013599”，“term_id”：“2020930347”}}NM_013599)从六个候选RNAi中选择如下：5'-CCCCACTATGTCCCACTATA-3'。使用以下引物将一对含有目标序列和粘性末端的引物退火并连接到线性化载体WX647（AAV2/9‐hEF1a‐DIO‐mCherry）（中国上海泰图生物科学）中：5′-TGCTGTAGAGTGGACACATAGTGGGTTTGCCACTGACCCCTAGTCCCACTATA‐3′，5’‐CCTGTATAGTGGACATAGTGGGTCAGTGAGTGCCAAACCACTATGTGCCCACTATAC‐3’。然后将表达质粒与Ad Helper和RepCap质粒共同转移到293T细胞中。通过CsCl密度梯度离心完成AAV2/9-hEF1a‐DIO‐Mmp9‐miRNAi‐mCherry的纯化。浓缩病毒颗粒的滴定度为1.65至1.95×10¹³五、。G.毫升⁻¹为了使Cre驱动的AAV病毒转导干扰mmp9，在MOG免疫前14天，将AAV病毒干预mmp9（AAV‐DIO‐mmp9‐i）（中国上海Taitool Bioscience）或对照（AAV∙DIO∙Ctrl i）第五天).

用miRNA模拟物转染小胶质细胞，200×10⁻⁹ 米根据制造商的建议（中国广州RiboBio）使用miR‐126a‐5p模拟物（5′-CAUUAUACUUUGUACGG‐3′）或控制模拟物（miRNA‐NC）（5′-UUUUGUCUACAAAAGUACUG‐3'）。

小RNA‐序列

使用miRNeasy Mini Kit（德国QIAGEN 217004）在指定时间点从EAE小鼠脊髓中FACS分类的小胶质细胞中提取总RNA。使用生物分析仪2100系统（安捷伦科技公司）评估RNA质量。按照制造商的说明，使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇，E7580S），将小RNA连接到其上，并制备条形码cDNA。根据BioAnalyzer 2100系统（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）测定的适当大小（140–150 bp），分析单个文库中是否存在连接的cDNA。随后，根据上海生物技术公司的制造商说明，从琼脂糖凝胶中纯化扩增的cDNA构建物，并使用Illumina Xten平台（Illuminia，San Diego，CA）进行测序分析。使用FASTX工具包（版本：13）对小RNA序列读取进行预处理，以排除低质量读取（不明确的N，3'问< 10 (问=−10log错误率），长度<18 nt）和3'适配器、5'适配器和poly（A）序列。其余高质量读取与miRBase（版本21.0）参考序列和小鼠基因组（GRCm38）对齐。完成所有注释步骤后，测序库用于尺寸分布和饱和度分析。对于BBB断裂（EVB密度）和miRNA表达模式（|R|>0.95和第页<0.05）和miRNA丰度层次中的TOP 50，请参见表S1（第一阶段）（支持信息）。

鱼类

如前所述，用于FISH的LNA microRNA探针购自EXIQON。^{[ 45,87 ]}TSA‐Plus荧光素系统购自PerkinElmer。

荧光素酶测定

如前所述，^{[ 88 ]}本研究使用双荧光素酶报告系统，荧光强度降低显示miR‐126a‐5p与mmp9的3'UTR之间的结合。在pGL3‐basic载体中克隆了mmp9的3'UTR或mmp9突变的3'UTR（mut UTR）。miR‐126a‐5p和与荧光素酶mRNA相关的mmp9的3'UTR之间的结合阻碍了荧光素素酶的翻译。HEK‐293 T细胞与荧光素酶报告基因构建物、pRL‐SV40 Renilla荧光素素酶构建物和miR‐126a‐5p模拟物、突变的miR‐）或阴性对照模拟物（miRNA‐NC）共转染（中国广州RiboBio）。转染后24小时制备细胞提取物，并用双荧光素酶报告物测定系统（Promega，017319）测量荧光素酶活性。miRCUYR LNA microRNA Power Inhibitors（TP）（丹麦Exiqon）是为竞争miR‐126a‐5p对mmp9的影响而定制的。序列如下所示：

TP:5′-CGTGTTATAGAAACAGT-3′；TP‐NC:5′‐GCTCCCTTCAATCCAATAATAATCA‐3′。

RNA分离和QPCR

如前所述，^{[ 89 ]}用Trizol（Invitrogen）从脊髓或原代细胞培养物中提取总RNA。使用RevertAid First strand cDNA Synthesis kit（Thermo Fisher Scientific，Fermentas）或Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit（Sermo Filter Sciefic，Vilnius，立陶宛）合成第一链cDNA。定量PCR在LightCycler 480实时PCR系统（Roche）上进行。基因表达表示为miRNA水平，使用ΔΔCT方法将其归一化为标准看家基因（Rnu6或snoRNA202）的水平。表中列出了底漆对第5章（支持信息）。

检测细胞因子、ROS和NO

所有样品在−80°C下冷冻，直到获得所有生物复制品。然后立即检测细胞因子、ROS和NO。TNF-浓度α（MN研发系统）、MMP9（中国武汉博斯特）和IL‐1β根据制造商的说明，使用ELISA检测（R&D Systems，MN）。分光光度计在490 nm处读取吸光度，并使用标准曲线生成的方程计算样品浓度。根据制造商的说明，使用总ROS分析试剂盒520 nm（Affymetrix，88‐5930），通过FACS测定ROS。采用硝酸还原酶法，使用NO检测试剂盒（中国南京建成生物工程有限公司）测定NO。简单地说，在分光光度计上在550 nm处读取吸光度，以及NO的含量₂ ⁻用比色法测定。^{[ 90 ]}

免疫荧光染色

将细胞或组织切片固定、渗透并与一级抗体[Iba1（wako）、层粘连蛋白（Boster）、CD31（Boster、Abcam、HuaBio）、白蛋白（Invitrien）、YFP（SAB）、ZO‐1（Proteintech）、mCherry（Abcam）、MMP9（Bosterβ（Abcam）]在4°C下过夜，然后用TRITC偶联、Alexa647偶联或FITC偶联二级抗体（Jackson ImmunoResearch）孵育，并用Hoechst33342（Sigma‐Aldrich）复染。使用荧光显微镜（DXM1200，尼康）或共焦显微镜（TCS SP5，徕卡）捕获荧光图像，并使用Image‐Pro Plus（媒体控制论）或Image J（NIH Image，贝塞斯达，马里兰州）进行量化。^{[ 45 ]}

免疫印迹分析

原代细胞培养物在添加了蛋白酶鸡尾酒抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液中均质。使用ZO‐1（Proteintech）、OCLN（Invitrien，Life tech）和MMP9（Boster）抗体对细胞裂解产物进行Western blot分析。使用ChemiDoc XRS系统和ImageLab软件（加利福尼亚州Hercules Bio‐Rad）采集并分析蛋白质带，通过Image‐Pro Plus（媒体控制论）将指示蛋白质归一化为GAPDH带。

苏木精、曙红和卢克索快速蓝染色

如前所述，使用H&E或Luxol耐晒蓝和周期性酸Schiff（LFB‐PAS）。分离腰椎或胸椎脊髓并切割成冰冻切片（7-14µm厚）进行免疫组化。从每只动物身上采集每六个连续切片中的一个。一池切片用LFB‐PAS染色。另一组切片用H&E溶液染色并安装在Permount（Fisher Scientific）。LFB‐PAS或H&E部分的评分由独立读者进行盲检。

透射电子显微镜

如前所述，^{[ 45 ]}小鼠脊髓在2.5%戊二醛中固定2小时，在1%四氧化锇中后固定45分钟，脱水，并包埋在Araldite树脂中。切片（1µm）用甲苯胺蓝染色。超薄切片（60 nm）在醋酸铀酰和柠檬酸铅中染色。使用100 kV的透射电子显微镜（H‐7650；Hitachi）观察样品。

药物筛选

来自BML‐2842（v1.2）库的640种FDA批准药物化合物（10×10⁻³ 米在DMSO中，中国上海国家化合物资源中心）在DF12中稀释。为了进行药物筛选，用qPCR检测10×10处理的小胶质细胞中miR‐126a‐5p mRNA⁻⁶ 米每种指定化合物（表第3章，支持信息）持续24小时。使用DMSO处理作为对照。为了验证，通过qPCR测定每种选定化合物处理的小胶质细胞中mmp9 mRNA的水平（表S4系列，支持信息）。在筛选期间，研究人员对化合物的分配一无所知，直到最后的统计分析。

作者感谢梅奥诊所的吴龙俊教授批判性地阅读了这份手稿。本研究得到了科技部中国脑倡议基金（2022ZD0204702 to C.H.）的资助；国家自然科学基金项目（31771129 to L.C.，31871026 to C.H.）；军事医学基金（16QNP085 to Z.Y.）；上海市科技重大项目（2018SHZDZX01至Y.D.）。Y.D.得到了ZJ实验室和上海脑科学与脑启发技术中心的支持。