金纳米粒子定向自噬干预抗肿瘤免疫治疗通过抑制肿瘤相关巨噬细胞M2极化

2.2. 聚乙二醇共轭金纳米粒子（PEG-AuNPs）的合成

采用硼氢化钠还原法合成了直径为5nm的AuNP³⁴简而言之，HAuCl的混合水溶液₄·4小时₂O（0.25 mmol/L）和Na_三C类₆H（H）₅O（运行）₇·2小时₂用超纯水制备O（0.25 mmol/L）并剧烈搅拌1分钟。然后，2 mL新制备的NaBH₄将溶液（100 mmol/L）加入混合溶液中，并在25°C下搅拌12小时。使用超滤管（MWCO 100 kDa）以3500 rpm（中国上海Sorvall ST1 Plus公司的ThermoFisher）将溶液离心30分钟，以去除未结合或未反应的化学物质。那么，Na_三C类₆H（H）₅O（运行）₇·2小时₂添加O溶液（1.25 mmol/L），并用超声波重新溶解产物。通过改变HAuCl的浓度来制备直径为20、50和100 nm的AuNP₄·4小时₂O和Na_三C类₆H（H）₅O（运行）₇·2小时₂O。

为了最小化血清蛋白对AuNP的吸附并最大限度地提高其稳定性，对所有四种尺寸的AuNP进行聚乙二醇化。简而言之，NH₂-将PEG-SH（0.25 mmol/L，2.4 mL）添加到6 mL AuNP柠檬酸溶液中，并用Milli-Q®水调节至12 mL。将混合溶液在25°C下剧烈搅拌20分钟，并在4°C下保持过夜。在用超滤管以3500 rpm（ThermoFisher）离心30分钟以去除未结合的PEG后，利用超声波将产品重新溶解在Milli-Q®水中。类似地，如所述使用FITC-PEG-SH制备FITC标记的AuNP的程序。

所有PEG-AuNP均通过透射电子显微镜进行验证（TEM，JEM 2100；JEOL，日本东京）。TEM图像如下所述。简言之，将PEG-AuNP悬浮在超纯水中，并进行超声波处理10分钟以分散PEG-Aunp。然后，一小滴悬浮液沉积在碳涂层格栅上，然后蒸发。然后，在100kV的TEM下监测完全干燥的格栅。还通过动态光散射（DLS；Zetasizer Nano ZS90；Malvern，UK）分析了PEG-AuNP的尺寸，并使用Techcomp UV2500 UV-Vis分光光度计通过UV-Vis吸收光谱分析了其紫外吸收光谱。

为了研究PEG-AuNP在储存条件下的稳定性，将纳米粒子储存在25°C的PBS溶液中。在不同的时间点，通过DLS（Zetasizer Nano ZS90；英国马尔文）分析PEG-AuNP的大小。

2.3. 细胞系和细胞培养

Hepa1-6细胞（小鼠肝癌细胞系）和RAW 264.7细胞（小鼠巨噬细胞样Abelson白血病病毒转化细胞系）来自中国上海中科院。细胞培养如下所述。简单地说，细胞在补充10%的DMEM中培养(v（v）/v（v）)FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37°C，在含有5%CO的湿化大气中₂和95%的空气。模拟TAM在体外RAW264.7细胞与Hepa1-6细胞（TSN，肿瘤培养上清液）与孔径为0.4μmol/L的Transwell®平板间接共培养（美国纽约州科宁市科宁市）。RAW 264.7电池（1×10⁵)Hepa1-6细胞（5×10⁴)在上部培养箱中培养48h。

2.4. 细胞活力测定

使用CCK-8试验评估PEG-AuNPs对RAW264.7和Hepa1-6细胞的细胞毒作用。简单地说，RAW264.7和Hepa1-6细胞接种在密度为1×10的96个板中⁴每孔培养12h。然后，将细胞与一系列不同浓度的PEG-AuNP孵育48 h，然后添加10μL CCK-8试剂，再与试剂孵育2 h。然后，在450 nm处获得每个孔的吸光度，并计算细胞活力，如等式所示。(1):

哪里一=吸光度，T=处理，B=空白，C=对照。

2.5. 流式细胞术

将细胞从细胞培养板上分离，清洗，然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中重新悬浮。然后，对细胞进行胰蛋白酶处理，并在4°C下用FITC-偶联F4/80抗体和PE-偶联CD206或CD80抗体染色30分钟。然后，用PBS广泛清洗细胞。最后，将细胞悬浮在PBS中，并进行流式细胞术（FACSVerse™，BD BioSeciences，CA，USA）以分析细胞的荧光。

2.6. 酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（R&D Systems Inc.）测定细胞培养基中IL-10和IL-12的浓度。简言之，所有试剂、样品和标准品都是按照指示制备的。然后将50μL标准品或样品添加到微孔中，并添加50μL抗体混合物。在25°C下孵育1 h后，取出液体，并用PBS清洗每个孔三次。向每个孔中添加3,3ʹ，5,5-四甲基联苯胺（TMB）溶液并培养30分钟。然后，添加停止溶液，并在450 nm处获得吸光度。最后，在基于ELISA的分析中，将细胞因子的表达标准化为细胞数量。

2.7. 实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）

根据制造商的协议，使用RNA Fast 200提取试剂盒提取RNA。之后，根据制造商的协议，使用PrimeScript™RT Master Mix将RNA转换为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq™在LightCycler定量PCR机器（美国加利福尼亚州圣克拉拉市Stratagene）中进行qPCR分析。信使核糖核酸的表达水平被标准化为甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达水平(Gapdh公司).

2.8. 动物

所有在特定无病（SPF）条件下饲养的雄性BALB/c小鼠（18–20 g）均购自上海斯莱克实验动物有限公司（中国上海）。所有实验程序均按照海军医科大学（中国上海）动物委员会批准的协议执行，并符合国际公认标准。

2.9. PEG-AuNPs体内抗肿瘤试验

这个体内在皮下和异种移植性肝癌小鼠模型中进行PEG-AuNPs的抗肿瘤试验。简单来说，Hepa1-6细胞（4×10⁶)将PEG-AuNPs（0.02 mg/kg或0.1 mg/kg）接种于BALB/c小鼠右侧皮下。7天后，用以下公式测量肿瘤体积（宽度²×长度）：/2。21天后，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重以评估疗效。计算肿瘤抑制率（IRT），如等式所示。(2):

哪里W公司_{e（电子）}和W公司_c（c）分别为实验组和对照组的肿瘤重量）。在第7天和第14天，对一组小鼠实施安乐死，并采集其肿瘤组织进行免疫荧光和TAM分析。

为了研究PEG-AuNPs对肿瘤环境中免疫细胞的影响，对第14天切除的肿瘤组织中的树突状细胞（DC）和T细胞进行如下分析。简单地说，将肿瘤组织切成块，并添加1 mL IV型胶原酶（0.05 mg/mL）消化液。将混合物置于37°C水浴中持续摇晃1 h，直到肿瘤组织分离为单个细胞。然后，将细胞悬液通过无菌70μm细胞过滤器，并在1000×克持续5分钟以除去上清液。将ACK（氯化铵-钾）裂解缓冲液添加到细胞碎片中，通过在25°C下培养3分钟来裂解红细胞。然后添加过量的PBS缓冲液以终止裂解，并通过1500×离心将上清液丢弃克持续5分钟。用PBS重新悬浮细胞悬浮液，并通过70μm无菌细胞过滤器。将悬浮液中的细胞密度调整为1×10左右⁶/毫升。用指示的抗体对DC和T细胞进行染色，以检测成熟DC（CD11⁺CD86型⁺)，CD3⁺CD4细胞⁺T细胞和CD3⁺CD8（CD8）⁺T细胞。

使用下述程序对第14天切除的福尔马林固定和石蜡包埋肿瘤进行Tunel（TdT-介导的dUTP缺口末端标记）和KI67染色。简单地说，将切除的肿瘤固定在含有4%多聚甲醛的PBS中，并切割成4μm的切片。将石蜡包埋的切片脱蜡到水中，并使用蛋白酶K的工作溶液进行抗原修复。含3%H的PBS₂O（运行）₂添加到切片中，并使用Tunel试剂盒进行Tunel染色。以KI67抗体为一级抗体，辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔抗体为二级抗体进行KI67染色。新鲜二氨基联苯胺（DAB）显色液用于免疫组织化学染色，苏木精用于细胞核染色。最后，将切片用中性树胶密封，并在显微镜下观察。

为了阐明巨噬细胞在PEG-AuNPs抗癌作用中的作用，我们使用氯膦酸盐脂质体清除小鼠的巨噬细胞体内简单地说，小鼠每4天腹腔注射一次200μL阴离子氯膦酸盐脂质体（氯膦甲酰氯膦酸酯脂质体，FormuMax），共三次。最后一次注射氯膦酸盐脂质体四天后，Hepa1-6细胞（4×10⁶)在添加或不添加PEG-AuNPs（0.02 mg/kg或0.1 mg/kg）的情况下，将其皮下接种到BALB/c小鼠的右侧。7天后，测量肿瘤体积，21天后，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重以评估疗效。第14天，对一组小鼠实施安乐死，并采集其肿瘤组织进行免疫荧光和TAM分析。

2.10. 隔离体内TAM公司

采用双Percoll密度梯度法从实体瘤中分离TAM。简单地说，实体肿瘤是酶消化的。将实体瘤分离成单个细胞后，离心这些细胞以获得单细胞悬浮液。然后，用双Percoll密度梯度（35%和45%）从肿瘤细胞悬浮液中富集肿瘤巨噬细胞，富集的细胞悬浮液用PE结合F4/80抗体染色，然后用磁珠结合抗PE抗体染色，并使用LS MACS列进行排序（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）。

2.11. 蛋白质印迹

根据如下所述的标准方案进行蛋白质印迹。简而言之，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）装载并分离细胞提取物（30μg蛋白质）。分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在250 mA下持续90分钟。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜后，用抗鼠LC3、beclin1、P62/固碳体1（SQSTM1）或β-肌动蛋白一级抗体分别在4°C下过夜。然后，用PBS清洗膜3次，并用HRP-偶联抗鼠IgG二级抗体孵育2 h。结果由奥德赛系统（LI-COR，Lincoln，NE，USA）获得。

2.12. mRFP-GFP-LC3腺病毒的转染

RAW 264.7电池（1×10⁵)在下Transwell®室中接种，并以100倍感染率（MOI）转染mRFP-GFP-LC3腺病毒6小时。在TSN共培养前，将转染的巨噬细胞与含有10%FBS的DMEM再培养48小时⁺红色⁺)和自溶体（绿色^-红色⁺)通过共焦显微镜进行观察和计算（Leica TCS SP8，Leica，Biberach，Germany）。为了分析自噬通量，通过点刺数除以细胞数计算荧光点刺/细胞的比率。

2.13. 溶酶体酸度和稳定性测定

如前所述进行溶酶体酸度和稳定性分析³⁵用PEG-AuNPs（10或50μmol/L）处理TSN共培养的RAW 264.7细胞48 h。对于溶酶体酸度测定，用PBS洗涤细胞两次，然后用100 nmol/L溶酶体传感器绿色DND-189染料在37°C的预加热培养基中溶解30分钟进行染色。染色后，用荧光显微镜（Olympus IX71，Tokyo，Japan）观察细胞。然后收集细胞并用流式细胞仪进行分析。溶酶体稳定性分析如下所述。简言之，将细胞清洗两次，然后在37°C下用20μg/mL吖啶橙（AO）溶解在预加热培养基中15分钟。AO染色后，清洗、收集细胞，并通过流式细胞仪分析其红色荧光。

2.14. Atg5 siRNA转染

小干扰RNA（siRNAs）附件5Gene-pharm Biotech合成了一个非特异性的干扰siRNA，并根据标准协议使用Lipofectamine 2000进行转染。简单地说，在细胞生长到80%融合后，用20 pmol siRNA和Lipofectamine 2000转染细胞6小时。然后，向细胞中添加新鲜培养基。20小时后，进行RT-qPCR以评估基因表达。

2.15. 纳米粒子在巨噬细胞内吞机制的研究

研究了TSN共培养RAW 264.7细胞对PEG-AuNPs的摄取机制。简单地说，RAW 264.7细胞以1.5×10的密度在6孔板上培养⁵隔夜每个孔的细胞数。在PEG-AuNPs治疗前，用以下抑制剂之一处理RAW 264.7细胞1h：dynasore（100μmol/L）；氯丙嗪（100μmol/L）。然后，用PBS清洗细胞以去除所有抑制剂，并用含有50μmol/L PEG-AuNPs的培养基培养1h。然后，将细胞清洗三次，用胰蛋白酶消化，并收集用于ICP-AES分析。

3.2. TAM中PEG-AuNPs的细胞摄取

TAM是纳米材料的良好靶点，主要是因为纳米级材料对巨噬细胞具有天然靶向性，因此巨噬细胞对其具有强大的吞噬作用³⁸为了研究PEG-AuNP的大小与细胞摄取效率之间的关系，我们用5、20、50和100 nm PEG-Au纳米粒处理RAW 264.7和Hepa1-6细胞4 h。使用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）定量测量细胞悬浮液中PEG-AuNP的浓度³⁹。如所示图2A、 结果表明，PEG-AuNPs的细胞摄取与大小有关，5 nm和20 nm的纳米粒子最容易被巨噬细胞和癌细胞内吞。据报道^39,40纳米颗粒的细胞摄取与粒径密切相关，粒径较小的纳米颗粒具有更好的细胞穿透性。特别是，据报道，直径小于10 nm的AuNP在癌细胞中的定位和渗透性优于直径大于10 nm的auNP³⁹。我们的结果还表明，与较大的纳米粒子相比，较小尺寸的纳米粒子可能会增加细胞摄取。

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图2

PEG-AuNPs的细胞摄取和渗透。（A） 定量ICP-AES测量RAW264.7和Hepa1-6细胞中PEG-AuNPs的摄取。（B） CD206的分析⁺/80层/四层⁺流式细胞仪检测与TSN共培养48h的RAW264.7细胞；（C） ELISA法测定RAW 264.7细胞与TSN共培养上清液在不同时间点的IL-10浓度；（D） M2表型相关基因水平精氨酸1和抄送1RT-qPCR检测与TSN共培养48h的RAW264.7细胞中63 mRNA的表达；（E） 与TSN共培养的RAW264.7细胞中PEG-AuNPs摄取的定量ICP-AES测量；（F） TAM中PEG-AuNPs摄取和穿透的TEM图像。数据表示为平均值±SD(n个 = 5). ∗∗对 < 0.01, ∗∗∗对 < 0.001. 比例尺=50 nm、500 nm、1μm和2μm。

据报道⁴¹肿瘤微环境可诱导巨噬细胞极化为M2表型，这是由于肿瘤细胞衍生的可溶性因子所致。有证据表明TSN可以诱导RAW264.7细胞向M2 TAM极化^41,42在此，我们使用Transwell®板将RAW264.7细胞与Hepa1-6细胞共同孵育，并评估M2表面标记CD206的表达。与癌细胞共培养48小时后，CD206的百分比⁺80层/四层⁺TSN组的巨噬细胞（75.4%）明显高于对照组（27.2%）(对<0.001），表明与TSN共培养后巨噬细胞向M2表型极化(图2B） ●●●●。IL-10是M2巨噬细胞中高度表达的特征性细胞因子¹⁶因此，我们使用ELISA检测与TSN共培养12、24、36和48小时的巨噬细胞中IL-10的分泌。TSN组IL-10水平随时间延长而升高(对<0.01），而在对照组中没有观察到实质性变化，进一步证明了在TSN存在的情况下巨噬细胞以时间依赖的方式向M2表型极化(图2C） 。然后我们进行RT-qPCR检测M2表型相关标记(精氨酸1和抄送163)并发现与对照组相比，TSN共培养组的表达上调(对 < 0.001) (图2D） ●●●●。这些数据表明，与TSN共培养成功地诱导了巨噬细胞极化在体外.

接下来，我们评估了TSN共培养RAW264.7细胞中PEG-AuNPs的细胞摄取。巨噬细胞对5 nm和20 nm PEG-AuNP的吸收最大(图2E） ●●●●。此外，我们进一步使用TEM检测TAM中不同大小PEG-AuNP的细胞内位置。TEM图像证实，5个和20 nm PEG-AuNP位于细胞质中，大量分布在细胞核周围，这些纳米粒子被发现均匀分布在细胞中(图2F） ●●●●。然而，在细胞中很少出现直径为50和100 nm的PEG-AuNP，其细胞穿透效率不如小尺寸纳米粒子。这些结果表明，PEG-AuNP在TAM中的细胞摄取和渗透依赖于大小，较小的纳米粒子（直径为5 nm和20 nm）具有更好的细胞摄取渗透性。我们的结果与研究不同尺寸纳米颗粒的细胞摄取的研究一致⁴³.

随后，我们研究了纳米材料的内吞机制。纳米材料有四种类型的内吞机制：吞噬作用、大胞饮作用、网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径⁴⁴吞噬作用和大胞饮作用是调节纳米材料摄取的肌动蛋白依赖性内吞途径⁴⁵而网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞是物质通过网格蛋白或小窝蛋白包被的囊泡通过质膜进入细胞的方式，这些囊泡是由动力蛋白的收缩作用形成的⁴⁶.Dynasore是一种防止dynamin形成的内吞途径的特异性抑制剂⁴⁷。如所示支持信息图S3，dynasore治疗显著抑制了5、20和50nm的PEG-AuNP的内化，这表明5、20、50nm的聚乙二醇AuNP内吞作用可能在原则上采用氯氰菊酯或小窝蛋白介导的内吞作用。相反，100 nm的PEG-AuNP没有观察到明显的抑制作用。此外，5、20和50nm的PEG-AuNPs的内吞作用也被氯丙嗪显著抑制，氯丙嗪可以抑制网格蛋白包被囊泡的形成，而100nm的PEG-AuNPs的摄取不受这些抑制剂的影响，这表明100nm的PEG-AuNP的内吞途径不是网格蛋白和小窝蛋白介导的。如果PEG-AuNPs的大小为100 nm，它们的内吞作用可能主要通过大胞吞途径进行⁴⁴.

由于20 nm PEG-AuNP在TAM中表现出最低的毒性和最有效的细胞摄取，我们在随后的实验中使用了20 nm PEG-AuNP。

3.3. PEG-AuNPs抑制M2巨噬细胞极化在体外

研究PEG-AuNPs对巨噬细胞极化的影响在体外，我们将TSN培养的巨噬细胞与20 nm的PEG-AuNPs孵育48 h，并通过流式细胞术评估巨噬细胞表面蛋白CD80和CD206¹⁶PEG-AuNPs没有改变TSN共培养巨噬细胞的CD80表达，但显著降低CD206表达(图3A和B）。然后，用ELISA检测细胞因子IL-12（M1表型）和IL-10（M2表型）的分泌。结果表明，PEG-AuNPs显著降低了IL-10的产生，而PEG-AuNPs不影响IL-12的分泌(图3C） 。此外，PEG-AuNPs可显著降低精氨酸1和抄送163（M2基因），但不影响Tnf-α和诱导型一氧化氮合酶(伊诺斯)（M1基因）(图3D） ●●●●。Pal等人。¹⁷已经证明AuNPs可以下调TAM中的IL-10，但也可以上调IL-12，导致TAM的M2到M1表型极化。我们的结果一致表明，PEG-AuNPs可以抑制TAM的M2极化，这反映在M2标记物如CD206、，抄送163,精氨酸1和IL10。

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图3

PEG-AuNPs抑制巨噬细胞向M2表型的极化在体外TSN共同培养的RAW264.7细胞分别在10和50μmol/L浓度下用或不用PEG-AuNPs处理48 h。用流式细胞术检测巨噬细胞（A）CD80和（B）CD206的表达。（C） 用ELISA分析巨噬细胞IL-12和IL-10的浓度。（D） mRNA水平Tnf-α,伊诺斯,精氨酸1和抄送163用RT-qPCR检测巨噬细胞的数量。数据表示为平均值±SD(n个 = 5). ∗对 < 0.05, ∗∗对 < 0.01, ∗∗∗对 < 0.001.

3.4. PEG-AuNPs对皮下肿瘤生长和M2巨噬细胞极化的体内抑制作用

确定PEG-AuNPs是否会影响肿瘤生长体内将Hepa1-6细胞皮下注射到雄性BALB/c小鼠的右侧，添加或不添加20 nm PEG-AuNP。如所示图4A、 结果表明，注射PEG-AuNPs后肿瘤体积明显缩小，高剂量（50μmol/L）的PEG-AuNP与低剂量（10μmol/L）相比具有更好的疗效(图4A） 。与低剂量PEG-AuNP治疗的小鼠相比，高剂量PEG-AuNP治疗小鼠的平均最终肿瘤重量更低(对 < 0.05) (图4B和C）。评估PEG-AuNP是否可以重新编程TAM极化体内用免疫荧光染色、流式细胞术和RT-qPCR分析PEG-AuNPs治疗的肿瘤和TAM。在植入后第7天和第14天获得的肿瘤切片中，CD206的数量⁺PEG-AuNPs联合注射肿瘤中的细胞数低于对照肿瘤，这表明PEG-AuNPs治疗减少了M2 TAM的数量(图4D） ●●●●。对第7天和第14天获得的肿瘤组织进行酶消化以分离TAM，并使用流式细胞术定量F4/80和CD206（M2 TAM标记物）的表达。CD206的数量⁺/80层/四层⁺与对照组相比，PEG-AuNPs联合注射肿瘤中的细胞显著减少(图4E） ●●●●。在第7天和第14天精氨酸1,抄送163、和伊尔-10与对照组相比，PEG-AuNPs联合注射肿瘤TAM中的（M2标记物）显著减少(图4F） ●●●●。为了阐明PEG-AuNPs是否对肿瘤细胞具有直接活性以及巨噬细胞对PEG-AuNPs抗癌作用的作用，我们使用氯膦酸盐脂质体清除小鼠的巨噬细胞体内然后，将Hepa1-6细胞接种到含有或不含PEG-AuNP的BALB/c小鼠皮下。14天后，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重以评估疗效。结果表明，PEG-AuNPs治疗没有任何疗效，这反映在三组小鼠的平均最终肿瘤重量没有差异(支持信息图S4A–C)在植入后第14天获得的肿瘤切片中，F4/80⁺和CD206⁺各组细胞均消失(图S4D). 这些结果表明，PEG-AuNPs对肿瘤没有直接疗效，巨噬细胞的清除会抵消PEG-AuNPs的疗效。

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图4

体内PEG-AuNPs的抗肿瘤活性和抑制M2巨噬细胞极化。（A） 肿瘤生长曲线。将Hepa1-6细胞接种于有或无20nm PEG-AuNPs的雄性BALB/c小鼠右侧皮下，并监测肿瘤生长21天。（B） 实验结束时小鼠切除肿瘤的大体图像。（C） 终点处的肿瘤重量。（D） CD206的代表性免疫荧光染色⁺和F4/80⁺植入后第7天和第14天肿瘤组织中的巨噬细胞。比例尺=200μm。（E） CD206型⁺/80层/四层⁺植入后第7天和第14天，用流式细胞术分析肿瘤组织中的巨噬细胞。（F） 小鼠植入后第7天和第14天用RT-qPCR测定肿瘤中基因（M2表型）的mRNA水平。数据表示为平均值±SD(n个 = 5). ∗对 < 0.05, ∗∗对 < 0.01, ∗∗∗对 < 0.001.

随后，分析PEG-AuNPs治疗后肿瘤微环境中的免疫状况。图5A和B表明PEG-AuNPs有效诱导树突状细胞（DC）成熟。0.02mg/kg和0.1mg/kg PEG-AuNPs显著促进DC的成熟，分别是对照组的2倍和4倍。如所示图5C-F、PEG-AuNPs有效增加CD3的频率⁺CD4细胞⁺T细胞和CD3⁺CD8（CD8）⁺肿瘤中的T细胞，而0.1 mg/kg PEG-AuNP在所有治疗组中显示出最高的T细胞比例。KI67和Tunel染色也分别检测肿瘤环境中的细胞增殖和凋亡。如所示图5G–J，经PEG-AuNPs治疗后，免疫组化染色显示KI67表达显著降低，Tunel染色增加，提示肿瘤细胞增殖减少，凋亡增加。

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图5

PEG-AuNPs对肿瘤环境中的免疫细胞和肿瘤细胞的影响。（A） 成熟DC（CD11）的代表性流式细胞术图和（B）定量分析⁺CD86型⁺)在肿瘤中。（C） CD3的代表性流式细胞术图和（D）定量分析⁺CD4细胞⁺肿瘤中的T细胞。（E） CD3的代表性流式细胞术图和（F）定量分析⁺CD8（CD8）⁺肿瘤中的T细胞。数据表示为平均值±SD(n个 = 6). （G） 肿瘤中KI67染色的代表性图像和（H）定量分析。（一） 肿瘤Tunel染色的代表性图像和（J）定量分析。比例尺=50μm。数据表示为平均值±SD(n个 = 10). ∗对 < 0.05, ∗∗对 < 0.01, ∗∗∗对 < 0.001.

总之，这些数据表明PEG-AuNPs可以抑制TAM向M2表型的极化体内从而降低免疫抑制作用并启动抗肿瘤免疫治疗。M1巨噬细胞具有吞噬肿瘤细胞的内在功能，还可以分泌免疫刺激细胞因子（IL-6、IL-12、TNF等）来激活包括树突状细胞和T细胞在内的其他免疫细胞⁴⁸我们已经证明，在清除巨噬细胞后，PEG-AuNPs的治疗效果被取消，这表明巨噬细胞在PEG-AuNPs的抗肿瘤活性中起着关键作用，并且PEG-Au纳米粒对肿瘤细胞没有直接疗效。用PEG-AuNPs治疗后，成熟树突状细胞CD3的比例⁺CD4细胞⁺T细胞和CD3⁺CD8（CD8）⁺T细胞显著增加，伴随着凋亡肿瘤细胞比例显著增加。结果表明，PEG-AuNPs可以抑制TAM向M2表型的极化，并激活包括树突状细胞和T细胞在内的其他免疫细胞，从而引发抗肿瘤免疫和随后的肿瘤抑制。同样，据报道，几种纳米材料可以调节TAMs的极化，并在调节生物效应中发挥积极作用^14,38,49例如，氧化铁纳米粒子可以诱导巨噬细胞极化为M1表型，增加活性氧（ROS）和TNF水平-α抑制乳腺癌生长和肝、肺转移¹⁴阳离子聚合物、阳离子右旋糖酐和聚乙烯亚胺（PEI）也可以通过类toll受体4（TLR-4）逆转TAM的极化，促进IL-12的表达，从而促进癌症免疫治疗⁵⁰此外，一些纳米材料，如银和氧化锌纳米颗粒，可以调节巨噬细胞极化³⁸因此，使用纳米材料逆转M2 TAM用于癌症免疫治疗是一种很有前景的治疗策略。

3.5. PEG-AuNPs阻断TAM中的自噬通量

自噬是一种动态的细胞过程，其特征是自噬体的形成、溶酶体与自噬体相融合、自噬溶酶体的形成以及随后的降解⁵¹自噬受到多种蛋白质的严格调控，包括自噬相关蛋白（ATG）、LC3、P62/SQSTM1和beclin1⁵²LC3是一种自噬体标记物，LC3有两种形式：LC3-I（16kDa细胞溶质蛋白）和LC3-II（14kDa加工形式）。LC3蛋白的总量或LC3-II/LC3-I比值可以反映自噬的水平⁵²P62/SQSTM1（P62）是一种多功能衔接蛋白，是一种选择性自噬受体⁵³Beclin1是自噬体形成所必需的，通过介导自噬蛋白在吞噬体中的定位，其蛋白水平与自噬呈正相关⁵⁴。如所示图6A、 TSN共培养后，巨噬细胞中beclin1和LC3的总量显著增加，P62水平下降，表明TSN培养的巨噬细胞中自噬被激活。经PEG-AuNPs治疗后，LC3蛋白总量继续增加，P62表达增加，beclin1表达降低，提示PEG-AuNPs可以阻断巨噬细胞的自噬流量。

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图6

PEG-AuNPs阻断自噬通量并导致巨噬细胞溶酶体功能障碍。（A） 自噬相关蛋白的蛋白质印迹分析。（B） 代表性免疫荧光图像和黄色自噬体数量的定量分析（G⁺R（右）⁺)和红色自溶体（G⁻R（右）⁺)巨噬细胞中的mRFP-GFP-LC3点。比例尺=10μmol/L。（C）LysoSensor Green DND-189染色巨噬细胞的荧光图像。比例尺=50μmol/L。（D）LysoSensor Green DND-189染色巨噬细胞的流式细胞术分析。（E） 吖啶橙（AO）染色巨噬细胞的流式细胞术分析。数据表示为平均值±SD(n个 = 5). ∗对 < 0.05, ∗∗对 < 0.01, ∗∗∗对 < 0.001.

mRFP-GFP-LC3（mRFP是红色荧光标记，GFP是绿色荧光标记）用于进一步监测自噬通量⁵⁵在自噬的初始阶段，mRFP-GFP-LC3聚集于自噬体上，并可观察到红/绿共定位点。在自噬的后期，自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。由于GFP不稳定并在酸性条件下猝灭，因此在此阶段只能检测到红色荧光斑点。因此，细胞中的自噬体被标记为黄点（绿色和红色荧光的重叠），而自噬溶酶体则被标记为红点（绿色荧光的熄灭）。首先，我们用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染RAW264.7细胞，然后用TSN培养巨噬细胞，或不用TSN，并用PEG-AuNPs（10或50μmol/L）处理48小时。然后，mRFP-阳性（R⁺)和GFP阳性（G⁺)使用共焦显微镜检测点(图6B） ●●●●。结果表明，黄色（G⁺R（右）⁺)和红色（G⁻R（右）⁺)TSN共培养后，点显著增加，表明TSN培养巨噬细胞中的自噬通量被激活。用PEG-AuNPs孵育后，黄点的数量（G⁺R（右）⁺)在TSN培养的巨噬细胞中，红点（G⁻R（右）⁺)显著降低，表明PEG-AuNPs抑制自噬小体的形成并诱导自噬体的积累。因此，在TSN共同培养的巨噬细胞中，PEG-AuNPs阻断了自噬通量。

为了进一步阐明PEG-AuNPs诱导自噬通量阻断的机制，我们探讨了PEG-AuNPs对TAM溶酶体功能的影响。溶酶体是一个具有稳定膜结构的酸性腔室，而溶酶体碱化和溶酶体膜通透性会导致溶酶体功能障碍^25,51。如所示图6C和D，通过溶酶体传感器绿色DND-189染色（这是用荧光强度检测pH值的指标），与对照细胞相比，经PEG-AuNPs处理的TSN培养的巨噬细胞中根据荧光强度评估的溶酶体酸化显著降低。吖啶橙（AO）是一种溶酶体嗜性、异染性荧光染料，当其在溶酶体内积聚时会产生红色荧光²⁵.图6E显示PEG-AuNPs可以浓度依赖性地降低AO的红色荧光强度，表明AO从溶酶体泄漏³².

总之，我们的结果证实PEG-AuNPs可以通过诱导溶酶体碱化和溶酶体膜通透性而导致溶酶体功能障碍，从而抑制TAM中的自噬通量。因此，各种纳米材料已被证明可诱导溶酶体功能障碍，而与纳米材料治疗相关的溶酶体障碍的一种常见类型是溶酶体膜渗透，因为纳米材料通常被隔离在溶酶体室中⁵¹.