sirtuin 1通过调节p53信号通路在先天性甲状腺功能减退大鼠脑发育中的作用

大鼠CH模型的建立

为了建立CH大鼠模型，怀孕大鼠在妊娠第15天腹腔注射丙基硫氧嘧啶（50 mg/天），然后每天注射一次，直到分娩[¹⁸]. 对于CH治疗，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg；腹腔注射）麻醉12天龄新生大鼠，并如前所述打开其颅骨。随后，对照CRISPR活化质粒（对照质粒，目录号sc-437275；Santa Cruz Biotechnology，Inc.；5µl；1 nmol/l）或SIRT1CRISPR-活化质粒用微量注射器注入12日龄大鼠的左心室。新生大鼠分为以下组（n=10）：i）对照组，ii）CH组，iii）CH+对照质粒组，iv）CH+SIRT1-质粒组。出生后第21天，用戊巴比妥钠（40 mg/kg；腹腔注射）麻醉大鼠（体重<200 g），并通过颈椎脱位处死。通过观察心脏和呼吸停止来证实死亡。安乐死后取不同组脑海马组织。当注射前大鼠体重减轻15%以上时，实验终止。在研究期间，没有一只老鼠死亡。

血浆fT4和TSH浓度的检测

通过离心（3500 rpm；4°C；15 min）收集大鼠幼鼠血液样本的血浆。随后，对血浆进行校准，并立即在−80°C下冷冻（韩国威斯科里）。根据制造商的说明，使用免疫分析（Cobas，e601，Roche Diagnostics）分析游离T4（fT4）水平。采用定量夹心ELISA技术测定血浆甲状腺刺激激素（TSH）[¹⁹].

大鼠行为测试

对患有CH的大鼠进行行为测试，包括开放场地和强迫游泳测试[¹⁹].

在野外试验中，首先在野外对大鼠进行评估。测试在一个分为16个小方块的盒子里进行。将每只大鼠放在盒子的一个角落里，让它们在场地上探索3分钟，然后记录下穿越和饲养的次数。

在强迫游泳试验中，将大鼠置于圆柱形水桶（25°C）中进行观察。在总共300秒的每5秒周期结束时，记录大鼠各种行为的频率，包括攀爬、站立和游泳。

细胞培养和转染

从正常大鼠海马组织中分离出神经细胞。简单地说，在大鼠被处死后，移除海马组织并无菌切割成碎片，通过胰蛋白酶（0.25%；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）消化分离细胞，然后在含有20%胎牛血清的DMEM/F12（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中培养.

神经细胞接种在6孔板（5×10⁴每孔细胞数），隔夜生长，然后转染1µg对照质粒（分类号sc-437275；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，1µgSIRT1-质粒（分类编号sc-437255；Sanda Cruz biotechnoology，Inc.），0.2µM对照小干扰RNA（siRNA；分类号sc-36869；Santa Cruz Bintechnologies，Inc.）或0.2µM SIRT1-siRNA（分类号sc-40986；Santa Cruz Biotechnology，Inc.），使用Lipofectamine®2000试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。在37°C下转染48小时后，收集细胞，并使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和western印迹法测定转染效率。

RNA提取和RT-qPCR

使用TRIzol®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从海马组织或神经元细胞中获得总RNA，并使用cDNA合成试剂盒（Invit罗gen；Thermo Fisher科学公司）将其反转录为cDNA。所有反应均使用Prism 7000实时PCR系统和SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech Co.，Ltd.）进行，以量化基因表达。引物是使用GenScript软件设计的。qPCR的扩增条件为：95℃下初始变性5min，然后在95℃下40个周期，10s，60℃下30s。β-actin作为内部对照。SIRT1、p53、超大型B细胞淋巴瘤（Bcl-xl）、Bcl-2-相关X（Bax）和细胞色素c的相对mRNA表达水平用2^-ΔΔCq方法[²⁰]. 引物序列如下：

SIRT1-正向，5ʹ-TTCCAGCCATCTCTGTC-3 \697；

背面为5ʹ-ATTCCCGCAACCTGTTC-3 \697]；

p53向前，5ʹ-CAGATCCTAGCGTCGAGCCC-3 \697'；

背面为5ʹ-CTGGTCTTCAGTGAACCATTGTTTC-3 \697]；

Bcl-xl向前，5′-TGCAGGTATTGGAGTCGG-3′；

背面，5′-AAGCGTTTCCTGGCCCCTTTC-3′；

Bax正向，5°-CCCGAGAGGGTTTTTCCGAG-3°；

背面为5ʹ-CAGCCATGATGTTCTGAT-3；

细胞色素c-forward，5′-TTGCACTACTTACCTTACTTAAGC-3ʹ；

背面，5’‐ACGTCCCCACTCTCTAAGTCAA-3’；

β-肌动蛋白前向，5′-GAGCAGAGCCTCGCCTTT-3′；

背面为5′-GCCACATAGGAATCCTTCTG-3′。

蛋白质印迹分析

用放射免疫沉淀分析缓冲液溶解神经细胞或大鼠海马组织，将溶解液在10000×g，4°C离心15 min，获得总蛋白。接下来，使用BCA蛋白检测试剂盒（贝尤泰姆生物技术研究所）对蛋白质进行定量，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）上，该膜用PBS-0.1%吐温20（PBST）封闭含5%脱脂奶1小时。随后，将膜与SIRT1（类别号2496；稀释1:1000；Cell Signaling Technology，Inc.）、p53（类别号2527；稀释1:1000；Cell信号技术，Inc.），Bcl-xl（类别号2764；稀释1:000；Cell-Signaling Technical，Inc.）和Bax（类别号5023；稀释1:100；细胞信号技术公司）、细胞色素c（分类号4280；稀释液1:1000；细胞信号技术公司）或GAPDH（分类号5174；稀释液1/1000；细胞信号技术公司）在4°c下过夜。接下来，用PBST清洗膜三次，并在室温下与二级抗体（ab7090，1:1000，Abcam）孵育1小时。用于稀释一级和二级抗体的缓冲液成分为1×TBST，含5%BSA。根据制造商的说明，使用增强化学发光底物（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.）观察蛋白质带[²¹]. GAPDH起到了装载控制的作用。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性测定

根据制造商的说明，使用比色分析试剂盒（贝尤泰姆生物技术研究所）测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性[²²]. 简单地说，通过在4°C下600×g离心5分钟收集细胞，然后在冰浴中溶解15分钟。随后，将细胞裂解物在16000×g的温度下在4°C下离心10 min，并将上清液转移到冰凉离心管中。最后，立即测定caspase 3的酶活性。

流式细胞术（FCM）分析

进行FCM分析以确定细胞凋亡[²³]. 收集从大鼠海马组织或转染细胞制备的单细胞悬浮液。为了获得大鼠海马组织的单细胞悬浮液^三新鲜大脑皮层用0.25%胰蛋白酶（1ml）消化30分钟，不含乙二胺四乙酸。然后将收集的细胞以1000×g离心5 min，丢弃上清液，收集细胞，并将细胞轻轻地重新悬浮在PBS中并进行计数。随后，100µL细胞悬浮液（10⁶根据制造商的协议，用5µL膜联蛋白V荧光素异硫氰酸盐（FITC）和碘化丙啶（BD Biosciences）培养。使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）分析染色细胞，并使用Kaluza分析软件（版本2.1.1.20653；Beckman Coulter，Inc.）分析数据。

3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定

MTT分析用于评估神经元细胞的活性[²⁴]. 转染48小时后，细胞（1×10⁴细胞/孔）接种到96 well板中，细胞接种24 h后，向每个孔中添加20μL MTT溶液（Beyotime生物技术研究所）并培养4 h。去除培养基后，向每个孔中添加100μL二甲基亚砜以终止反应。使用微孔板阅读器（Bio-Read Laboratories，Inc.）在570 nm处记录吸光度。

SIRT1过表达对CH模型大鼠的保护作用

为了探讨SIRT1在CH模型大鼠中的作用，采用SIRT1质粒治疗大鼠，将大鼠分为以下四组：i）对照组，ii）CH，iii）CH+对照质粒组，iv）CH+SIRT1-质粒组。如所示图2（a，b）与对照组相比，CH组SIRT1的表达显著降低，SIRT1过度表达可显著逆转这种降低。

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图2。

SIRT1质粒对CH模型大鼠的影响。（a） 分别采用RT-qPCR和western blotting分析法测定不同组大鼠海马组织中SIRT1 mRNA和（b）蛋白的表达水平。（c和d）大鼠血浆中的fT4和TSH水平。（e-g）通过野外和强迫游泳试验对患有CH的大鼠进行认知行为检查**与对照组相比P<0.01；^##与CH+对照组相比P<0.01。SIRT1，sirtuin 1；CH，先天性甲状腺功能减退。

此外，我们发现与CH模型组相比，SIRT1过度表达显著提高了CH大鼠血浆中fT4水平，降低了TSH水平(图2（c，d）).

此外，野外和强迫游泳试验的结果表明SIRT1过度表达改善了CH模型大鼠的行为(图2（e–g)). 此外，FCM结果显示SIRT1过度表达降低了CH诱导的神经细胞凋亡(图3（a，b）)和caspase 3活性(图3（c）)).

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图3。

SIRT1质粒对CH模型大鼠海马神经元凋亡的影响。（a） 流式细胞术检测大鼠海马神经元凋亡。（b） 凋亡率统计图。（c） 使用Caspase 3活性检测试剂盒测定Caspase 3的活性**与对照组相比P<0.01；^##与CH+对照组相比P<0.01。SIRT1，sirtuin 1；CH，先天性甲状腺功能减退。

SIRT1过表达对培养神经元凋亡的影响

对从正常大鼠海马组织分离和培养的神经元细胞的转染效率的评估表明，SIRT1质粒转染48小时后，在mRNA和蛋白质水平上的表达显著增加(图4（a，b）). MTT分析和FCM分析表明，SIRT1过度表达显著提高了细胞存活率(图4（c))并抑制细胞凋亡(图4（d，e）)培养的神经元。与对照质粒组相比，SIRT1质粒转染组caspase 3活性显著降低(图4（f)).

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图4。

SIRT1质粒对培养神经元凋亡的影响。（a） 分别使用western blotting和RT-qPCR分析评估转染细胞中SIRT1的mRNA和（b）蛋白表达水平。（c） 使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）检测转染细胞的活性。（d和e）流式细胞术检测转染细胞的凋亡。（f） 测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性**与对照组相比P<0.01。SIRT1，无声交配型信息调节1/sirtuin 1。

SIRT1过度表达对p53信号通路相关分子水平的影响

为了进一步探讨SIRT1在培养神经元中过度表达的作用机制，采用RT-qPCR和western blotting检测p53信号通路相关分子（p53、Bcl-xl、Bax和细胞色素c）的表达。结果表明，SIRT1过度表达导致p53、Bax和细胞色素c的mRNA和蛋白表达显著降低，Bcl-xl的表达增加(图5（a-e）)在培养的神经元中。

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图5。

SIRT1质粒对培养神经元中p53信号通路的影响。（a-d）使用RT-qPCR分析测定转染神经元中p53、Bcl-xl、Bax和细胞色素c的mRNA表达水平。（e） 用western blotting分析检测转染神经元中p53、超大型B细胞淋巴瘤（Bcl-xl）、Bcl-2-相关X（Bax）和细胞色素c的蛋白表达水平**与对照组相比P<0.01。

SIRT1基因敲除对培养神经元凋亡的影响

转染效率评估表明，SIRT1-siRNA在培养神经元中转染48小时后，显著降低了SIRT1在mRNA和蛋白质水平的表达(图6（a，b）). MTT分析和FCM分析表明，SIRT1敲除显著降低了小鼠的生存能力(图6（c))促进细胞凋亡(图6（d，e）)培养的神经元。此外，与对照siRNA组相比，SIRT1-siRNA转染组caspase 3活性显著增强(图6（f)).

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图6。

SIRT1-小干扰RNA（siRNA）对培养神经元凋亡的影响。（a） 用western blotting分析评估转染细胞中SIRT1的mRNA表达水平。（b） 使用RT-qPCR分析测定转染细胞中SIRT1的蛋白表达水平。（c） 用MTT法检测转染细胞的活性。（d和e）流式细胞术检测转染细胞的凋亡。（f） 测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性**与对照siRNA.SIRT1，sirtuin 1相比P<0.01；小干扰RNA。