评估Circ-Sirt1对Sirt1和Sirt1表达的影响其在肺动脉高压病理中的作用

摘要

介绍

肺动脉高压（PAH）的特点是在导致肺血管收缩的肺组织和肺动脉血管随着肺血管阻力的逐渐增加，最终导致重塑在许多情况下最终导致右心衰竭 ¹ 报告的多环芳烃发病率为每百万2.0至7.6例成年人每年 ² 虽然有几种临床模式可以缓解症状，这种病理学的不可治愈性使其无法逆转疾病的进展，因此PAH患者的预后是贫穷的^三,4。由于由于缺乏有效的治疗方案，该领域一直备受关注多年来的研究热点。

PAH的发病机制很复杂，但目前的共识支持缺氧以肺血管重构为主要病理机制动脉平滑肌细胞（PASMC）被认为是受此影响的关键细胞条件。在缺氧条件下，PASMC的增殖和迁移起着在肺血管结构重建中的重要作用 ⁵ 。有多种内部因素在增殖和迁移PASMC；研究表明，DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA失调可能发挥重要作用^1,6，但确切的分子机制尚不清楚。

CircRNA是一种高度稳定的共价闭环结构，几乎没有蛋白质编码能力。研究逐渐表明，CircRNA具有多种生物活性并参与一些肺部疾病的病理学以及心血管疾病 ⁷ 沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin 1，SIRT1）据报道参与血液的炎症细胞反应血管，同时显示转化生长因子（TGF）-β1、Smad3和Smad7在血管重塑中发挥关键作用^8,9此外，研究还发现表明circ_0006872在慢性病中调节miR-145-5p/NF-κB通路阻塞性肺疾病，促进肺血管细胞凋亡，炎症和氧化应激 ¹⁰ 然而，几乎没有任何研究探讨过这种关系在CircRNA和PAH之间。

在本实验中，我们构建了缺氧性PAH大鼠模型，并利用随后产生低氧诱导的大鼠PASMC细胞以证明其减少通过细胞表达circ-Sirt1和Sirt1 mRNA以应对缺氧功能测试、细胞拯救测试和物理测试。这一发现表明circ-Sirt1和Sirt1可能与PAH有关。

材料和方法

结果

低氧诱导肺损伤大鼠的Circ-Sirt1和Sirt1降低高血压

低氧诱导肺动脉高压后进行右心导管插入术建立高血压模型(图1A). 与常压相比组，RVSP和右心室肥大指数在低氧诱导大鼠(图。1B年,​，C）。肺的C类).肺动脉血管增厚和管腔狭窄也见于低氧诱导的PAH大鼠模型(图1D)，这表明动物模型是成功的。Western blot和RT-PCR分析显示circ-Sirt1和Sirt1在缺氧诱导大鼠PAH模型中的表达正常组(图。1E级,​，F）。基于F类).基于此，我们推测circ-Sirt1和Sirt1可能与PAH有关。

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图1。

低氧诱导肺动脉高压时circ-Sirt1和Sirt1下降在大鼠体内。（A） 右心导管插入术操作示意图颈静脉插管。（B） 右心室收缩压（RVSP），（比例尺=2.5s，n=5）。（C） 右心室/左心室心室+隔膜（RV/LV+S）比率（n=6）。（D） H&E染色和α-SMA显示肺小血管的形态学改变每组（原始放大倍数，×200，×400；比例尺=50µm；n=6). （E） Western blot检测SIRT1蛋白在肺组织（n=3）。（F） qRT-PCR检测mRNA表达肺组织中的circ-Sirt1和Sirt1（n=6）。表达的层次被归一化为β-actin。数值以平均值±标准差表示。H&E：苏木精伊红染色；DAPI:4ʹ，6-二氨基-2-苯基吲哚，2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；定量RT-PCR：定量实时聚合酶链反应；Nor：正常；欢呼声：缺氧*P（P）与正常组相比，<0.05。

原发性肺动脉平滑肌的获取与培养细胞

在我们的实验中，我们能够成功分离出原代大鼠PASMC，并且用组织补片法培养(图2A). 我们还观察了信徒PASMC的生长。免疫荧光法检测α-SMA以确认细胞纯度。视野中的大多数细胞被染色α-SMA为正(图。2B型).

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图2。

肺动脉平滑肌原代细胞的获取与培养肌肉细胞。（A） 获取和培养原发性肺动脉平滑肌细胞。（B） 免疫荧光方法用于检测α-SMA（绿色）的表达大鼠PASMC标记物（原始放大倍数，×400）。α-SMA：a-光滑肌肌动蛋白；DAPI:4ʹ，6-二氨基-2-苯基吲哚，2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺。

Circ-Sirt1的过度表达抑制了细胞的增殖和迁移肺动脉平滑肌细胞

大鼠PASMC在缺氧条件下培养，转染circ-Sirt1后对过表达质粒、western blot和RT-PCR检测进行了比较与对照组。可以看出，circ-Sirt1的过度表达，上调大鼠PASMC中circ-Sirt1的表达。此外，SIRT1 mRNA蛋白质水平也相应增加，而表达水平TGF-β1、Smad3和Smad7的含量降低。PASMC标记的表达水平，VCAM-1和α-SMA也降低(图3A,​，B）。B类). 流式细胞术检测大鼠PASMC的细胞周期，发现细胞成分G2/S期细胞数量显著减少G0/G1期。这表明circ-Sirt1的过度表达抑制了细胞大鼠PASMC增殖(图3C). CCK8方法用于检测24小时时的细胞活力小时、48小时和72小时，以及大鼠PASMC的细胞活力circ-Sirt1的过度表达显著减少(图3D). 划痕试验用于测定细胞在24小时和48小时后的迁移能力注意到当circ-Sirt1过度表达时，大鼠PASMC的迁移能力被明显抑制(图3E). 免疫荧光实验表明α-SMA和大鼠PASMC中VCAM-1在circ-Sirt1过度表达后降低(图3F). 这些结果表明circ-Sirt1可能在控制扩散和通过TGF-β1/Smad3/Smad7影响SIRT1 mRNA对大鼠PASMC迁移的影响调节通路，从而参与肺部疾病的进展高血压。

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图3。

过度表达circ-Sirt1质粒对肺动脉平滑肌的影响肌肉细胞。（A） circ-Sirt1过度表达后，western blot用于检测SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad7、，大鼠PASMC中的VCAM-1和α-SMA。（B） qRT-PCR检测mRNAcirc-Sirt1、Sirt1、TGF-β1、Smad3、Smad7、VCAM-1和α-SMA的表达在大鼠PASMC中。（C） 用流式细胞仪测定PASMC的细胞周期细胞术。（D） 采用CCK-8法检测PASMC的细胞活力。（E）刮伤试验用于测定24小时和48小时后的细胞。（F），α-SMA，VCAM-1免疫荧光大鼠肺动脉染色。（原始放大倍数，×100）。表达水平归一化为β-肌动蛋白。所有值均为表示为平均值±SD（n=3）。转化生长因子-β1：转化生长因子-β1；VCAM-1：重组人血管细胞黏附分子1；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；CCK-8：细胞计数试剂盒-8；OE：过度表达；NC：阴性对照；DAPI:4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺；OD：光密度*P（P）<0.05，与对照组比较。

SIRT1的SiRNA抑制逆转过度表达的Circ-SIRT1对肺动脉平滑肌细胞的增殖

为了证实circ-Sirt1对大鼠PASMC影响的机制，我们在用siRNA转染的细胞中进行拯救试验以抑制SIRT1circ-Sirt1过表达质粒。RT-PCR和western blot测试表明si-SIRT1可以显著抑制circ-SIRT1对SIRT1的增强作用。同样，si-SIRT1可以显著恢复circ-Sirt1对TGF-β1/Smad3/Smad7以及PASMC标记物VCAM-1水平的影响和α-SMA(图4A,​，B）。B类). 流式细胞术，CCK8方法和划痕实验表明，circ-Sirt1的过度表达抑制大鼠PASMC的细胞增殖、细胞活力和迁移si-SIRT1逆转了这种效应(图4C​4厘米–E类). 免疫荧光实验表明，在circ-Sirt1、α-SMA和VCAM-1过度表达后大鼠PASMC减少，SIRT1-siRNA抑制这种作用(图4F). 以上内容研究结果表明，circ-Sirt1正向调节SIRT1 mRNA，从而抑制TGF-β1/Smad3/Smad7参与对照大鼠PASMC的增殖和迁移，并参与肺动脉高压的进展。

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图4。

siRNA抑制SIRT1在大鼠肺动脉平滑肌中的作用细胞。（A） Western blot检测SIRT1、，大鼠PASMC中的TGF-β1、Smad3、Smad7、VCAM-1和α-SMA。（B） 定量RT-PCR检测SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad7、VCAM-1和大鼠PASMC中的α-SMA。（C） 用流式细胞仪测定PASMC的细胞周期细胞术。（D） 用CCK-8法检测PASMC的细胞活力。（E）划伤试验用于确定24h和48h后的细胞（F）α-SMA、VCAM-1免疫荧光染色大鼠肺动脉损伤。（原始放大倍数，×100）。级别表达量归一化为β-actin。所有值都表示为平均值±SD（n=3）。TGF-β1：转化生长因子-β1；SiRNA，小干扰RNA；VCAM-1：重组人血管细胞粘附分子1；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；PASMC：肺动脉平滑肌细胞；qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应；CCK-8：细胞计数套件-8；OE：过度表达；NC：阴性对照；OD：光密度；DAPI:4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺*P（P）<0.05，与对照组比较#P（P）< 0.05,与OE-circ-Sirt1组相比。

Circ-Sirt1过度表达在大鼠肺损伤模型中的作用高血压

为了验证肺动脉高压的潜在机制，我们年将circ-Sirt1腺病毒或空腺病毒注射到大鼠尾静脉低氧诱导的肺动脉高压模型。40天后低氧诱导、右心导管插入术测量RVSP并分析RV/LV+S比值。与缺氧组相比，缺氧+circ-Sirt1腺病毒组RVSP较低(图5A,​，B）B类)和右心室肥厚索引(图5C). 逆转录聚合酶链反应Western blot检测肺组织。与缺氧相比组，缺氧+circ-Sirt1腺病毒的肺组织（pcDNA3.1-circ-Sirt1）组的circ-Sirt1水平显著升高，SIRT1的表达也增加(图5D​第五天–F类). mRNA和蛋白表达TGF-β1、Smad3和Smad7的水平随着PASMC标记（α-SMA和VCAM-1）(图5D​第五天–F类). ICAM-1的蛋白表达水平，肺组织中PCNA和波形蛋白也减少(图5G). 苏木精伊红染色表明缺氧组大鼠肺动脉增厚管腔变窄，而缺氧+circ-Sirt1腺病毒组血管厚度和管腔狭窄明显减少(图6A). 肺部用免疫荧光法检测大鼠的动脉，并与缺氧模型组，发现缺氧+circ-Sirt1腺病毒组α-SMA、ICAM-1、PCNA和波形蛋白减少(图6B,​，C）。C类). 这表明在低氧诱导的肺动脉高压动物模型，增加circ-Sirt1的表达可以延缓肺动脉平滑肌的增殖和迁移从而减轻肺动脉高压的过程。

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图5。

腺病毒circ-Sirt1的过度表达延缓了低氧诱导大鼠多环芳烃。（A） 和（B）RVSP的变化（比例尺=5s，n=5、5、5和6）。（C） 右心室/左心室+的变化隔膜（RV/LV+S）比（n=6）。（D） qRT-PCR检测mRNAcirc-Sirt1、Sirt1、TGF-β1、Smad3、Smad7、VCAM-1和α-SMA的表达肺组织中（n=6）。（E） 和（F）Western blot用于检测SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad7、VCAM-1和α-SMA的蛋白变化肺组织（n=3）。（G） 蛋白质印迹检测肺组织中ICAM-1、PCNA和波形蛋白的变化（n=3）。级别表达量归一化为β-actin。值表示为平均值±标准差。PAH：肺动脉高压；转化生长因子-β1：转化生长因子β1；RVSP：右心室收缩压；RV：右心室；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应；VCAM-1：重组人血管细胞粘附分子1；α-SMA：a-平滑肌肌动蛋白；ICAM-1：细胞间粘附分子-1；PCNA：增殖细胞核抗原；Nor：正常；Hyp：缺氧；第页：pcDNA3.1；NC：阴性对照；LV+S：左心室+室间隔。*P（P）<0.05，与正常组比较；#P（P）与缺氧组相比，<0.05。

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图6。

各组大鼠肺组织H&E染色和免疫荧光。（A） H&E染色显示肺小细胞的形态学改变每组血管（原始放大倍数，×200，×400）。（B）大鼠肺动脉α-SMA免疫荧光染色（标度bar=50µm）。（C） ICAM-1、PCNA和波形蛋白免疫荧光染色大鼠肺动脉（比例尺=50µm）。H&E：苏木精&曙红染色；DAPI:4，6-二脒基-2-苯基吲哚，2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；ICAM-1：细胞间粘附分子-1；PCNA：增殖细胞核抗原；Nor：正常；Hyp：缺氧；第页：pcDNA3.1；NC：阴性对照；（n＝6）。

讨论

PASMC是PAH发病机制中的关键细胞，参与PAH的发病肺血管重塑。然而，circRNA与PAH的相关性及其血管重塑的作用很少被研究。我们在低氧诱导PAH大鼠模型，circ-Sirt1和Sirt1表达降低，因此，我们预测circ-Sirt1和Sirt1与PAH相关。本研究旨在探讨这种关系。首先，从培养大鼠进行细胞功能实验。circ-Sirt1过度表达后，值得注意的是，SIRT1 mRNA和蛋白水平上调。然而，TGF-β1、Smad3和Smad7的表达受到抑制VCAM-1和α-SMA也降低。circ-Sirt1过度表达削弱PASMC细胞活性和增殖，抑制细胞周期进展和迁移能力。其次，通过救援实验，发现circ-Sirt1正相关调节SIRT1 mRNA的翻译过程，从而抑制TGF-β1/Smad3/Smad7，从而削弱大鼠PASMC的增殖和迁移。最后，通过实验大鼠模型验证了增加circ-Sirt1的表达可抑制PASMC的增殖和迁移患有多环芳烃的大鼠。

研究表明TGF-β1/Smad信号通路参与心肺疾病的发病机制^9,11.之前的研究Tingting等人 ¹² 证明七里强心可能抑制TGF-β1/Smad2/3信号转导减弱心房重构和改善心脏功能的途径疾病。Wang等人 ¹³ 发现8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶-1调节细胞TGF-β1诱导的转化，从而促进博莱霉素诱导的肺损伤小鼠肺纤维化与肺纤维化过程中p-Smad2/3的激活也通过与Smad7的部分相互作用。我们的研究结果表明TGF-β1、Smad3和Smad7的表达与表达变化一致VCAM-1和α-SMA。TGF-β1/Smad3/Smad7可能介导PASMC的变化。

研究发现，circRNA在多种疾病中发挥着关键作用，因此它可能成为未来许多疾病的新诊断或治疗靶点。例如，Zheng等人 ¹⁴ 发现circ-000595在患者组织中的表达增加并进一步研究了circ-00059抑制表达miR-19a在细胞中的表达并促进人主动脉平滑肌细胞的凋亡缺氧引起的。Xu等人 ¹⁵ 在他们的研究中敲下rno-circ_005717（circDiaph3），发现它可以上调透明度相关的formin-3的水平，从而促进血管平滑肌细胞（VSMC）向收缩和抵抗分化动脉内膜增生。在Gorski等人关于心力衰竭的研究中， ¹⁶ 研究表明，SIRT1的药理学激活可以促进赖氨酸492的脱乙酰化与肌内质网活性的恢复Ca2+-APase（SERCA2a），从而降低心力衰竭的几率。Kong等人 ¹⁷ 发现circ-Sirt1与miR-132/212结合，干扰Sirt1 mRNA和促进宿主基因SIRT1的表达，从而影响炎症VSMC的表型转变。这表明circ-Sirt1在动脉粥样硬化的发病机制。之前的研究表明，过度表达circ-Sirt1在蛋白水平显著增加Sirt1的表达，这与我们的研究结果一致。此外，我们发现上调circ-Sirt1的表达可以抑制细胞增殖和PASMC的迁移，这是我们研究的一个新发现。

许多研究表明，在ncRNA中，微小RNA和lncRNA参与PAH的原因。Kang等人 ¹⁸ 发现miR-124通过靶向多个基因（包括NFATc1、CAMTA1和PTBP1，从而削弱人类PASMC的增殖。Xing（兴）等， ¹⁹ 在他们的研究中，发现lncRNA的上调在体内表达基因3（lncRNA-MEG3）促进低氧诱导的PASMC增殖迁移、细胞周期进展和PASMC凋亡减少。在他们的研究中，Li等人 ²⁰ 发现lnc-Rps4l编码的肽RPS4XL参与PASMC缺氧诱导的增殖。作为转录后调节因子，circRNA在心肌发育中受到越来越多的关注损伤、心肌纤维化、心肌肥厚、心力衰竭和PAH。Zhou等人al发现hsa_circ_0016070、miR-942和CCND1在PAH患者。该领域的进一步研究表明，hsa_circ_0016070诱导PASMC通过miR-942-5p/CCND1轴增殖并参与PAH血管重塑 ²¹ .Yang等人 ²² 发现mmucirc000790在两种缺氧性肺动脉高压中均上调肺血管组织和低氧PASMC，可竞争性结合miR-374c上调靶基因FOXC1，促进缺氧PASMCs的增殖并减少其凋亡，从而加速肺血管重塑多环芳烃小鼠。上述研究表明，ncRNAs在PAH的形成。我们研究的最重要发现是过度表达缺氧大鼠的circ-Sirt1明显减缓了细胞增殖因此，circ-Sirt1可能是一个新的治疗靶点用于PAH。

此外，许多研究表明，circRNAs可以调节mRNA^23,24因此，circ-Sirt1调节的具体机制SIRT1 mRNA的表达是我们下一步的研究重点。

尽管该实验证明circ-Sirt1在大鼠体内的PAH，这一发现的下一步临床应用仍需实验验证。因此，需要在这一领域进行进一步的研究探讨circ-Sirt1在PAH中的临床价值和应用。

结论

我们的研究结果表明，circ-Sirt1调节Sirt1 mRNA的表达并抑制PASMC的增殖和迁移。这种影响可能被调节通过TGF-β1/Smad3/Smad7(图。7). 这些结果提供了关于分子PAH肺动脉血管重塑的机制及可能在开发新的有效的多环芳烃治疗方案。

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图7。

Circ-Sirt1/Sirt1调节TGF-β1/Smad3/Smad7通路的表达，从而影响肺的增殖和迁移模式缺氧诱导的动脉平滑肌细胞。

补充材料

脚注

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