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公共科学图书馆一号。2022; 17（5）：e0254296。
2022年5月6日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0254296
预防性维修识别码：PMC9075623型
PMID：35522669

人类易位蛋白与其线粒体蛋白相互作用的差异A147吨多态性变体

普里塔·阿西,数据管理,形式化分析,方法,可视化,写作——原稿,写作–审查和编辑,1,¤ 安妮·波尔贾克,数据管理,形式化分析,方法,写作–审查和编辑,2 迈克尔·卡西奥,资金获取,资源,监督,写作–审查和编辑,三 亚子·D·科,概念化,资金获取,监督,写作–审查和编辑,1和拉尔斯·M·伊特纳,概念化,资金获取,监督,写作——原稿,写作–审查和编辑通讯作者1,*
安贾尼·库马尔·蒂瓦里，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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数据可用性声明

摘要

转位蛋白（TSPO）与线粒体跨膜胆固醇转运、脑炎症和其他线粒体功能有关。在阿尔茨海默病的神经炎症期间，它在胶质细胞中上调。高亲和力TSPO显像放射性配体被用于显示神经炎症。然而，这受到了常见的A147T多态性的阻碍，这种多态性损害了配体结合。此外，这种多态性与神经精神疾病风险增加有关，并可能降低TSPO蛋白的稳定性。在这里，我们使用免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）来建立野生型（WT）TSPO和A147T多态性变体的线粒体蛋白结合谱。利用表达WT或A147T TSPO的人类胶质细胞线粒体，我们鉴定出30个WT TSPO结合伙伴，而A147T TS PO只有23个。证实TSPO的A147T多态性可能导致功能丧失，我们发现WT TSPO的一个已鉴定的相互作用体，14-3-3-θ（YWHAQ），一种参与调节线粒体膜蛋白的蛋白质，与A147T TSPO的相互作用更少。我们的数据显示了人类胶质细胞中TSPO及其A147T多态性变体的线粒体相互作用网络，并表明了A147T在线粒体蛋白网络中的功能相关性。

介绍

18kDa易位蛋白（TSPO）[1]是一种五跨膜结构域蛋白，位于线粒体外膜（OMM）中，位于线粒体内外膜之间的接触部位[2]. TSPO以高亲和力结合胆固醇，并可能促进其通过OMM的转运[三]. 然而，它的生理作用体内仍然难以捉摸。此前有报道称TSPO公司无明显表型的空小鼠[4].

TSPO在物种间高度保守[5]并且被广泛表达[6]类固醇合成所需的细胞和器官（如肾上腺皮质）中含量较高[7]. 有趣的是，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和创伤性脑损伤（TBI）在内的几种脑部疾病显示TSPO的表达水平显著增加，反映出小胶质细胞的激活可能导致保护性神经甾体的产生，这是一种稳态反应[8]. 随着用于正电子发射断层成像（PET）成像的大量TSPO配体的开发，这已被用于诊断[9,10]. TSPO还被认为是治疗神经退行性疾病的药物靶点[11]TSPO配体可减少癌细胞的增殖，因此也可能对癌症有治疗意义[12].

单核苷酸多态性(6971卢比)在中TSPO公司导致苏氨酸在147位取代丙氨酸的基因(A147吨)在胆固醇结合基序之前的螺旋旋转，阻碍了TSPO放射性标记配体作为炎症活性生物标记物的使用体内可视化（PET成像）[13]. 这种单点突变主要发生在高加索人群中，其中约10%为纯合子，高达30%为杂合子[14]. 这个A147吨多态性不仅降低了许多TSPO配体的结合亲和力，而且还被证明影响孕烯醇酮的产生，并被发现与双相情感障碍等神经疾病有关[15,16]. 然而，这些发现是通过配体的作用间接证明的。为了深入了解此功能的相关性A147吨点突变，我们询问这种突变如何影响线粒体复合体内TSPO的蛋白质相互作用组。因此，我们将全长人胶质瘤细胞U87MG转染TSPO公司重量或其A147吨变体（均带有C末端V5标签）并从这些细胞中分离出线粒体。这些富含线粒体的部分随后被免疫沉淀用于标记蛋白质，并进一步进行质谱分析（IP-MS）。选择的相互作用伙伴通过联合免疫沉淀进一步验证。

材料和方法

线粒体分离

根据先前描述的方案从U87MG细胞中分离线粒体[17]. 简单地说，将细胞颗粒重新悬浮在1mL等分冰镇RSB次缓冲液（10 mM NaCl，1.5 mM MgCl）中2，10 mM Tris-HCl（pH 7.5），含有完整的EDTA游离蛋白酶抑制剂），并转移到2-mL Dounce均质器中。让细胞膨胀5-10分钟。用相控显微镜检查膨胀过程。用B杵几下将膨胀的细胞溶解，并用稳固稳定的压力将其直接压入试管。立即向每个样品中添加500μL冰镇2.5×MS均质缓冲液（525 mM甘露醇、175 mM蔗糖、12.5 mM Tris-HCl（pH7.5）和2.5 mM EDTA（pH7.5+蛋白酶抑制剂），以获得最终浓度为1×MS的均质缓冲。随后，用Parafilm覆盖均化器的顶部，并通过反转两次进行混合。保留部分匀浆以进行酶标记分析。然后将匀浆转移到离心管中进行密度梯度离心。使用冰镇1×MS均质缓冲液（210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、5 mM Tris-HCl（pH7.5）和1 mM EDTA（pH7.5+蛋白酶抑制剂）将最终体积增加至2 mL。然后，匀浆在1300×克持续5分钟，去除细胞核、未破裂的细胞和大的膜碎片。将上清液倒入干净的离心管中，再次以1300×g离心5分钟。此离心步骤再重复两次。将第三次离心的上清液转移到干净的离心管中，以17000×g离心15分钟，获得线粒体（颗粒）。将分离的线粒体在冰镇1×MS缓冲液中洗涤，并在17000xg下离心。丢弃上清液，将所得颗粒（线粒体）重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的NP40缓冲液中。

免疫沉淀

如前所述，对转染细胞进行免疫沉淀（IP）[18]. 采集转染细胞并分离线粒体后，用蛋白G-偶联磁珠（Invitrogen）预孵育样品1小时。然后用V5抗体在4℃孵育过夜。第二天，将样品与蛋白G偶联磁珠一起孵育（在旋转平台上，4°C，1小时），然后用IP缓冲液（50mM HEPES（pH 7.5）、140mM氯化钠、0.2%（v/v）NP40和蛋白酶抑制剂）洗涤4次。通过在热（95°C）样品缓冲液（1M Tris-HCl（pH 8.0）、20%（v/v）β-巯基乙醇、40%（v/v）甘油、9.2%（w/v）SDS和0.2%（w/v）溴酚蓝）中煮沸，从珠子中回收沉淀，通过SDS-PAGE分离蛋白质，Western blot转移到PVDF膜上，并探测Myc（1:5000）和V5（1:500）。转染细胞的第二种IP方法是用针对各自相互作用蛋白的抗体进行免疫沉淀。随后的步骤与上述步骤类似，用V5（1:5000）进行免疫印迹。

免疫印迹法

对于TSPO转染细胞的SDS-PAGE和Western blot分析，将10μg蛋白质加载到SDS-PACE凝胶上作为输入，并将每个样品的整个免疫沉淀加载到连续的通道中。随后在25V的Trans-Blot SD Semidry Transfer Cell（BioRad）中将蛋白质电泳转移到硝化纤维素膜（GE Healthcare）上45分钟。随后在室温下，将膜在含0.1%（v/v）吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中的5%（w/v）BSA中封闭1小时，然后用稀释在5%（w/v）BSA/TBS-T中的一级抗体孵育（在4°C的摇床上过夜）。对于使用TSPO-转染细胞进行的IP实验，使用的主要抗体是V5（1:5000）、myc（1:5000。第二天，去除一级抗体，用TBS-T清洗膜三次，并在室温下用碱性磷酸酶偶联二级抗体（1:10000，Sigma）在1%（w/v）BSA/TBS-T中培养45分钟。蛋白质条带用Immobilon化学发光碱性磷酸酶底物（Millipore）进行可视化，并在VersaDoc 4000型CCD相机系统（BioRad）中进行检测。为了确定等负荷和标准化，通过在蒸馏水中清洗5分钟，然后用0.2M氢氧化钠清洗10分钟，然后蒸馏水清洗5分钟来剥离膜，之后用GAPDH抗体重新对其进行检测。

表达质粒

为了获得瞬时转染U87MG细胞的表达结构，编码人类TSPO的编码序列(hTSPO公司)从之前使用Trizol（Life Technologies）分离的HEK293总mRNA逆转录生成的cDNA中扩增，并克隆到pENTR/SD/TOPO载体（Invitrogen）或pGEM-T-Easy载体（Promega）中。要克隆到pGEM-T-Easy载体，hTSPO公司使用PfuTurbo高纯度DNA聚合酶（安捷伦科技公司）通过PCR扩增。将polyA尾部添加到该钝端PCR产物中，并在4°C下连夜连接到pGEM-T-Easy载体中。将连接的向量转换为单杆Top10 E.大肠杆菌对于pENTR/SD/TOPO，DH5型αE类.科利用于pGEM-T-Easy载体，并将其置于含有50μg/mL卡那霉素（pENTR/SD/TOPO）和100μg/mL氨苄西林（pGEM-T-Easy）的平板上。阳性克隆通过限制性消化鉴定，并通过DNA测序确认。

克隆和定点诱变

进行定点突变以引入A147吨点突变为hTSPO公司cDNA根据安捷伦科技公司的Quikchange XL定点突变试剂盒说明。简言之，含有A147吨使用点突变将突变引入hTSPO公司在pGEM-T-Easy中。在最终体积为50μl的条件下进行了25个PCR循环，其中包含1ng的hTSPO公司以pGEM-T-Easy为模板，10pmol正向和反向引物，2.5单位Pfu涡轮.退火温度设置为58°C。生成的PCR产物用10个单位的Dpn公司I限制酶在37°C下持续3小时以消化亲本DNA模板。消化的PCR产物转化为XL1蓝色并将其置于含有100μg/mL氨苄西林的琼脂平板上。通过DNA测序分析确认阳性克隆。

质粒DNA的转化

化学合格E类.大肠杆菌将细胞（100μl）在冰上解冻，并转移到冷冻的14-mL聚丙烯圆底管（BD Biosciences）中。然后将50 ng所需质粒DNA添加到E类.大肠杆菌和E类.大肠杆菌/DNA混合物在冰上培养20–30分钟。随后E类.大肠杆菌/将DNA混合物在42°C水浴中热震40秒，并在冰上冷却2分钟。加入S.O.C培养基（250μl，Life Technologies），并在37°C下以200rpm振荡试管1小时。被改造的E类.大肠杆菌将其置于含有适当抗生素的溶原肉汤（LB）琼脂平板上，并在37°C下培养过夜。为了对获得的克隆进行后续分析，采集单个菌落，接种在含有氨苄的LB培养基中，在37°C下培养过夜，并使用Promega Wizard微型探针试剂盒纯化质粒DNA。

瞬时转染

如前所述，使用聚乙烯亚胺（PEI）转染方法将质粒DNA导入10 cm培养皿中的U87MG细胞[19]经过小的修改。简单地说，细胞的密度为0.5 x 106每10厘米培养皿，并允许其粘附。第二天，当细胞达到60-80%的融合时，在转染前30分钟更换培养基。然后，使用PEI与DNA（w/w）的3:1比例制备PEI-DNA混合物。简单地说，将30μg PEI（1 g PEI溶于1000 mL pH7蒸馏水中）稀释成总体积为750μl的0.9%NaCl。然后，将10μg DNA稀释成总体积为750μl的0.9%NaCl。随后，将稀释的DNA添加到稀释的PEI中，并在环境温度下孵育15分钟。然后将PEI-DNA混合物逐滴添加到10 cm培养皿中，并静置48小时，之后，细胞准备在带有蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液中收获。

质谱和数据分析

简单地说，IP样品被脱盐，并使用3-kDa Amicon过滤装置（EMD Millipore）和50 mM碳酸氢钠交换缓冲液。通过添加2μl三（2-羧乙基）膦（Sigma）减少蛋白质样品（400μg），并在60°C下培养样品1 h。然后通过添加1μl碘乙酰胺（37 mg/mL）使样品烷基化，以阻断半胱氨酸侧链（10 min，环境温度）。使用4μg胰蛋白酶（测序级，低自溶胰蛋白酶；Promega）在37°C下消化蛋白质样品16小时。在微型离心机中短暂旋转消化样品，检查pH值，如有必要，使用几μL碳酸钠（500 mM Na）调节pH值至9–102一氧化碳三). 通过LC-MS/MS（QExative Plus上的HCD：Thermo Electron，Bremen，Germany）以生物三等分（每次注射6μg）对样品进行分析，然后进行Mascot搜索以鉴定肽和蛋白质。使用了之前发布的协议的改编[20,21].

仅使用吉祥物中含有≥2个注释肽的蛋白质进行进一步分析。吉祥物得分是实验数据与数据库序列匹配程度的统计得分[22]和吉祥物参数包括使用15-ppm母体质量耐受性、0.5Da片段质量耐受性和蛋白质错误发现率等于或低于1%。对Uniprot、Swissprot和NCBI等多个数据库进行了搜索。使用基于Java的肽先知算法的重新实现对吉祥物结果进行统计解释[23]将搜索引擎得分转换为肽识别概率。使用Scaffold 2.4.0对每个实验组的3个IP生物复制品进行数据汇编和量化，并应用95%的蛋白质概率阈值。Scaffold在两个级别上计算蛋白质分组：首先确定单个MS/MS样品中已识别的蛋白质组，然后再跨实验中的所有MS/MS样本确定实验范围内的蛋白质识别列表[24]. Scaffold使用肽Prophet算法的重新实现，通过考虑分配给每个蛋白质的肽数量分布的统计模型，将肽组合到蛋白质识别中。利用Scaffold Q的定量分析，对3个生物复制品进行平均，并应用第页值（学生的t吨测试）标准第页<0.05以确定具有统计学意义的差异结合蛋白。使用DAVID基因本体数据库（v6.8）对蛋白质本体进行分析，使用整个人类基因组的基因本体注释作为背景列表。使用CytoScape（v3.7.1）直观地表示相互作用体和网络属性。TSPO的蛋白质-蛋白质相互作用的现有证据来自BioGRID（v3.1.180）和STRING（v10.5）数据库，并通过文献检索获得。

结果

hTSPO的标识重量和hTSPOA147吨人脑胶质瘤细胞中的相互作用蛋白

TSPO与其他蛋白质的相互作用已通过传统方法进行表征，例如凝胶内消化和质谱分析[25]或下拉方法[26]它们受到抗体亲和力、溶解性和溶解度条件的限制。此外，TSPO胆固醇结合域（CRAC域）的相互作用伙伴已通过共免疫沉淀鉴定[27]. 然而，TSPO互动伙伴的识别在频繁147吨多态性尚未被研究。为了深入了解A147吨线粒体TSPO相互作用的多态性，我们采用免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）。IP-MS的使用被认为是鉴定蛋白质相互作用（复合物）敏感性和特异性的金标准[28]. 我们标记了全长人类TSPO公司重量和TSPO公司A147吨在U87MG细胞中表达C末端V5标记，这是一种来源于中枢神经系统的人脑星形胶质瘤/微胶质瘤细胞系[29]. V5标记的TSPO蛋白水平在两种基因中的转染率相同TSPO公司重量和TSPO公司A147吨(图1A). 从这些细胞中分离的线粒体显示线粒体蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）富集，而核蛋白异源核核糖核蛋白（hnRNP）缺失，表明线粒体成功纯化(图1B-1D以及整个研究过程中引用的western blots图的非剪切blots支持信息，主要图中显示的区域突出显示为红色破碎框）。此外，V5标记的TSPO的表达水平相等重量和TSPOA147吨在分离的线粒体中通过免疫印迹证实(图1C). 针对IP的V5抗体优化表明，每400μg总蛋白中2μl抗体是消除V5标记的TSPO的最佳条件重量和TSPOA147吨(图1D). 为了评估V5抗体的特异性并控制非特异性结合，两种分离的TSPO线粒体重量和TSPOA147吨用IgG抗体作为阴性对照，对表达细胞和未转染细胞进行免疫沉淀(图1D). 输入物的免疫印迹（占总裂解物的10%）进一步证实了TSPO之间的可比表达水平重量和TSPOA147吨而未结合V5标记蛋白的免疫印迹（FT=流经）显示相对少量的非沉淀TSPO(图1D). 接下来，对三分之一的IP样品进行SDS-PAGE电泳，银染，结果表明TSPOA147吨与TSPO相比，条带较少和/或强度较弱重量样品(图1E). 总的来说，这些结果表明V5标记的TSPO在TSPO中的表达重量和TSPOA147吨在U87MG细胞的分离线粒体中产生类似的表达水平，这支持后续MS的有效和可比的免疫沉淀。

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用于鉴定人TSPO及其突变体之间结合伴侣的样品制备的优化A147吨通过IP-MS。

A） V5标记TSPO的转染效率重量和TSPOA147吨在U87MG细胞中（42.6%±5.93），表明蛋白质表达水平相等；红色、抗V5免疫荧光和蓝色，DAPI指示细胞核。n=3。B） 通过Western blot评估U87MG细胞的线粒体富集，VDAC作为线粒体标记蛋白，hnRNP作为核标记蛋白，表明纯化的线粒体是分离出来的，n=2。C） V5标记TSPO转染U87MG细胞线粒体裂解物的代表性免疫印迹重量和TSPO147吨这证实了V5在两种TSPO中的表达水平相等重量和TSPOA147吨提取物。D） TSPO免疫沉淀重量和TSPOA147吨从转染的U87MG细胞中提取越来越多的小鼠V5抗体，每400μg总蛋白中选择2μg用于后续实验。使用非特异性小鼠IgG抗体作为阴性对照。输入的免疫印迹（占总裂解物的10%）证实了TSPO之间V5标签的可比表达水平重量和TSPOA147吨。未结合V5标记的免疫印迹显示非沉淀TSPO的数量。E） TSPO免疫沉淀重量和TSPOA147吨来自转染的U87MG细胞。通过SDS-PAGE银染色观察沉淀蛋白。

识别V5标记的TSPO的交互伙伴重量和TSPOA147吨，我们在亚汇合状态下对U87MG细胞富集的线粒体部分进行MS，并转染表达V5标签的构建物TSPO公司重量，V5标签TSPO公司A147吨或未转染细胞。IP-MS分析程序和结果的概要示意图如所示图2A为了进行蛋白质鉴定，免疫沉淀蛋白是胰蛋白酶在溶液中消化的，所得肽通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定。质谱数据包含准确的肽质量和肽片段质量列表。使用Mascot软件包对包含已知蛋白质氨基酸序列的序列数据库进行搜索。基于Mascot LC-MS/MS搜索引擎（Swissprot数据库，人类分类学），共鉴定出647种独特蛋白质，蛋白质错误发现率≤1%，并在TSPO中鉴定出重量、TSPOA147吨和由V5抗体或对照IgG免疫沉淀的非转染（WT）线粒体(图2A,S1表). 使用Scaffold软件进行进一步的人工分析，以排除野生型TSPO样品和IgG对照中存在的肽序列，从而得出TSPO中特异性表达的307个蛋白质的最终列表重量、TSPOa147吨，样本，但在控件中没有表示（或最小）。其中44个蛋白是已知的线粒体蛋白，51个蛋白是细胞质定位蛋白，其余是核GO注释蛋白。随后，采取了进一步的手动严格措施，以去除仅存在于3个IP TSPO中不到2个的肽序列重量和TSPOA147吨复制。这进一步限制了TSPO候选蛋白的数量为56个重量TSPO为47A147吨.显著差异(第页<0.01-第页<0.1）每个TSPO的三个生物复制品之间的总光谱计数重量和TSPOA147吨是用于识别TSPO绑定伙伴的进一步选择标准。23个候选蛋白与两种TSPO相互作用重量和TSPOA147吨，7个候选蛋白仅与TSPO相互作用重量(图2A). 使用STRING和Cytoscape生物信息学软件对已识别的TSPO相互作用伙伴进行功能蛋白关联网络分析，如所示图2B所有这些候选蛋白都处于最高交互概率和丰度（光谱计数）的前50%。值得注意的是TSPO的已知交互伙伴，包括VDAC1、VDAC2、VDAC3和ATAD3A，这些也在我们的IP-MS实验中确定，增加了我们方法的信心(图2B).

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hTSPO结合伙伴的识别重量和hTSPOA147吨通过无标记半定量蛋白质组分析。

A） 识别TSPO的免疫沉淀质谱法示意图重量和TSPOA147吨相互作用。我们为V5标记的人类TSPO鉴定了56种蛋白质重量和47种人类TSPO蛋白质A147吨其中三分之二由线粒体蛋白组成，其余为细胞质蛋白和核蛋白。其中，23名候选人与TSPO进行了互动重量和TSPOA147吨7名候选人仅与TSPO互动重量，进一步选择标准后，蛋白质折叠差异为第页<0.01–0.1 B）使用STRING（v10.5）和Cytoscape（v6.3.0）生物信息学软件生成的功能蛋白关联网络。网络边缘表示蛋白质与蛋白质的关联，并表示置信度，关联强度由线条粗细表示。圆圈（节点）表示特定蛋白质，颜色表示每个蛋白质的亚细胞定位，如图例所示。仅与TSPO相互作用的7种候选蛋白重量用红色轮廓表示节点。没有网络边缘的节点表示以前从未被报道为TSPO相互作用伙伴的蛋白质。

TSPO分析重量和TSPOA147吨蛋白质域本体相互作用体鉴定出一组丰富的线粒体外膜蛋白(表1.DAVID INTERPRO结构域富集簇1，p=3.7 x 10–9）和离子通道结合蛋白(表1DAVID INTERPRO域富集集群2，p=1.5 x 10–6）。构成簇1的线粒体外膜蛋白为VDAC1、VDAC2、VDAC3、HK2、MGST1、TOMM20和TOMM40(表1)而组成簇2的离子通道结合蛋白是HSP90AA1、HSP90AB1、YWHAE、YWHAQ和VDAC1(表1).

表1

从V5标记的TSPO中提取TSPO绑定伙伴的功能注释聚类分析重量和TSPOA147吨-转染样品，MS检测。

前3名DAVID生物信息学资源注释集群（n=31个来自三个生物复制品的蛋白质）。折叠变化是指与整个人类蛋白质组相比的富集（背景列表）。

生物过程基因计数第页-价值基因折叠更改飞行数据记录器
注释簇1。浓缩分数4.41      
线粒体外膜83.7 x 10−9香港2号,MGST1公司,托姆20,托姆40,TSPO公司,VDAC1型,VDAC2型,VDAC3型324 x 10−6
线粒体122.5 x 10−7ATAD3A公司,香港2号,MGST1公司,PRKCA公司,SLC25A1型,TFB1M型,托姆20,托姆40,TSPO公司,VDAC1型,VDAC2型,VDAC3型7.12.7 x 10−4
阴离子运输41.7 x 10−6TSPO公司,VDAC1型,VDAC2型,VDAC3型1602.2 x 10−3
HLTV-I感染56.6 x 10−3CREB1号机组,TSPO公司,VDAC1型,VDAC2型,VDAC3型6.27.2
运输82.1 x 10−2SCAMP3（SCAMP3）,SLC25A1型,托姆20,汤姆40,TSPO公司,VDAC1型,VDAC2型,VDAC3型2.72.1
注释簇2。丰富分数3.3      
离子通道结合61.5 x 10−6HSP90AA1型,HSP90AB1型,TSPO公司,YWHAE公司,YWHAQ公司,VDAC1型291.8 x 10−3
注释簇3。浓缩分数3.14      
蛋白质靶向44.1 x 10−5托姆20,是的,YWHAQ公司,YWHAZ公司575.5 x 10−2

缩写：FDR，错误发现率；质谱；HLTV-I，人类T细胞白血病病毒1型。

我们的IP-MS结果确定了TSPO的相互作用重量和TSPOA147吨培养的胶质细胞中含有具有异质功能的蛋白质，包括蛋白质跨膜转运到细胞内细胞器、离子通道结合和蛋白质靶向调控，可能解释了TSPO在细胞中的多重功能。重要的是，TSPO分析A147吨与TSPO相比，interactiome显示与7种蛋白质的相互作用丢失重量即线粒体导入受体亚基TOM40同源物（TOMM40）、14-3-3蛋白亚基ε（YWHAE）、143-3蛋白亚基tau/theta（YWHAQ）、己糖激酶2（HK2）、固碳体1（SQSTM1）、磷脂酰丝氨酸合酶1（PTDSS1）和反式-2,3烯醇基CoA还原酶（TECR）(图2B). 总的来说A147吨TSPO的点突变可能导致对线粒体和细胞功能重要的相互作用伙伴的丢失。

选定人类TSPO蛋白质相互作用的验证

人类TSPO的几个候选结合伙伴的特定相互作用重量和TSPO147吨通过瞬时转染细胞的联合免疫沉淀（co-IP）和免疫印迹证实。选择的候选结合伙伴为电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）、热休克蛋白HSP90-alpha（HSP90AA1）、14-3-3蛋白亚基θ（YWHAQ）和固碳体1（SQSTM1）。采用了两种联合IP方法。第一种方法涉及下拉过度表达V5标记TSPO的细胞重量或TSPO147吨用针对各自相互作用蛋白的抗体，然后用V5抗体免疫印迹TSPO。用这种方法验证的候选蛋白是VDAC1和HSP90AA1。过度表达V5标记pcDNA的细胞被用作阴性对照。正如MS结果所预期的那样，VDAC1没有差异(图3A)和HSP90AA1相互作用(图3B)与任一TSPO重量或TSPOA147吨分别是。

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hTSPO的验证交互重量和hTSPO147吨.

A） 电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和hTSPO的协同免疫沉淀（IP）重量或hTSPOA147吨用VDAC抗体和免疫印迹法检测V5和VDAC1。GAPDH用作负载控制，不会与VDAC1共沉淀。用VDAC1与每种TSPO共同纯化相当数量的V5-TSPO重量和TSPOA147吨.B）热休克蛋白HSP90-alpha（Hsp90AA1）和hTSPO的Co-IP重量或hTSPOA147吨使用Hsp90AA1抗体，并通过免疫印迹检测V5和Hsp90AA 1。用Hsp90AA1与每种TSPO共同纯化相当数量的V5-TSPO重量和TSPOA147吨.C-D）14-3-3θ和固碳体1（SQSTM1）与V5标记的人类TSPO在U87MG细胞中表达重量或TSPOA147吨.C）14-3-3θ和hTSPO的Co-IP重量或hTSPOA147吨用V5抗体，免疫印迹法检测myc和V5。14-3-3θ与V5共纯化，在TSPO中观察到较弱的相互作用A147吨与TSPO比较重量.D）SQSTM1和hTSPO的Co-IP重量或hTSPOA147吨用V5抗体，免疫印迹法检测myc和V5。与TSPO共同纯化了相当数量的SQSTM1重量和TSPOA147吨使用图像J通过密度测定法对3个独立实验的结果进行量化，并表示为平均值±S.D.（Student t检验）*第页<0.05.

第二种方法涉及过表达V5标记TSPO的细胞的协同IP和V5抗体重量、TSPOA147吨或pcDNA及其各自带有Myc标记的相互作用蛋白。用这种方法验证的候选蛋白是14-3-3蛋白亚基θ（YWHAQ）和螯合体-1（SQSTM1）。TSPO公司A147吨与TSPO相比，YWHAQ的相互作用显著降低重量，表明YWHAQ相互作用较弱，因为A147吨突变(图3C). 然而，TSPO之间的SQSTM1与TSPO的相互作用没有可检测的差异重量和TSPOA147吨(图3D). 14-3-3蛋白亚基eta（YWHAH）和14-3-3β亚基（YWHAB）不在相互作用蛋白列表中，因此用作阴性对照。YWHAH和YWHAB没有像预期的那样与TSPO共同纯化，这表明相互作用伙伴的质谱测定列表的稳健性和特异性(S1图).

讨论

人类全长TSPO及其涉及胆固醇识别/相互作用氨基酸共识（CRAC）基序的结构域的蛋白质相互作用已在以前的研究中记录，这些研究使用蓝活性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）结合MS[25]和计算建模电子版筛选[30]分别是。然而，常见TSPO多态性的影响A147吨关于蛋白质相互作用的研究尚不清楚。迄今为止，只有A147吨已报道TSPO对蛋白质结构和稳定性的影响[31,32]. 我们目前的研究确定了人类全长TSPO及其A147吨使用IP-MS的多态性变体偏向线粒体蛋白。使用从过度表达TSPO的细胞中分离的线粒体蛋白的IP-MS重量和TSPOA147吨以及使用Scaffold软件进行下游严格的肽分析[24]，我们检测到hTSPO的30个蛋白-蛋白质相互作用（PPI）重量hTSPO的23个PPIA147吨充满信心，表明A147吨人类TSPO的变异导致TSPO蛋白相互作用组的改变。这个A147吨突变不仅显著改变了蛋白质的灵活性和稳定性，而且使突变蛋白质的半衰期缩短了约25%[31]. 这种结构变化将增加TSPOA147吨这可能至少部分解释了它对减少蛋白质相互作用数量的影响。

在30个TSPO中重量PPI和23 TSPOA147吨PPI是许多已知的线粒体TSPO相互作用伙伴，增加了我们对蛋白质组数据集的信心。这些包括电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）[27]、电压依赖型阴离子选择性通道蛋白2（VDAC2）、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白质3（VDAC3）[33]，和ATP酶家族AAA结构域蛋白3A（ATAD3A）[25]. 由于我们使用分离的线粒体进行IP-MS，因此，线粒体蛋白在30种TSPO中最为普遍也就不足为奇了重量PPI和23 TSPOA147吨确定PPI。然而，我们也确定了一些核蛋白和细胞质蛋白是TSPO相互作用的伙伴。虽然这可能反映了线粒体制备过程中的杂质，但另一种解释是，这反映了TSPO所在的线粒体表面的相互作用[34]. 我们发现A147吨TSPO的多态性与线粒体外膜组织、离子通道结合和蛋白质靶向功能相关的一小部分相互作用伙伴的丢失有关。在已确认的相互作用伙伴中，只有14-3-3蛋白亚基θ（YWHAQ）与TSPO的相互作用较弱A147吨这表明，该点突变特异性地调节蛋白质相互作用。我们的结果表明A147吨与非突变全长人类TSPO相比，人类TSPO的多态性部分改变了其相互作用体，从而改变了其分子功能。我们的IP-MS数据表明TSPO的差异相互作用重量和TSPOA147吨线粒体外膜蛋白HK2和TOMM40与hTSPO结合A147吨以及离子通道结合蛋白和靶向蛋白YWHAE和YWHAQ。这些正常的相互作用是否与TSPO直接相关重量或间接剩余待显示。据报道，在YWHAE中，TSPO通过VDAC1蛋白与核蛋白间接相互作用[35]. 通过VDAC1或VDAC2进行间接交互[27,36]不太可能，因为他们与TSPO的交互没有受到A147吨多态性。TSPO与YWHAG的相互作用通过类固醇生成性急性调节蛋白（STAR）的Ser-194介导[37]. 然而，在我们的研究中没有发现YWHAG，可能是因为Aghazadeh及其同事使用了不同的细胞类型（MA10小鼠Leydig细胞），与我们研究中使用的人类胶质母细胞瘤细胞（U87MG）相比，这些细胞具有非常不同的蛋白表达模式[38].

据我们所知，这是YWHAQ作为TSPO互动者的第一份报告重量与hTSPO亲和力降低A147吨已发现200多个蛋白质与14-3-3家族成员相互作用（哺乳动物中有7种亚型：β、γ、ε、η、ζ、σ和τ/θ），这是一组蛋白质，不仅是类固醇生成相关蛋白，还包括蛋白激酶、酶、细胞周期控制相关蛋白和凋亡相关蛋白[39]. 此外，14-3-3蛋白定位于大脑中的疾病特异性损伤位点和毒性蛋白聚集体，这可能有助于调节疾病的发病机制[40]. 因此，14-3-3蛋白可能通过促进致病蛋白的隔离而起到保护作用，也可能通过促进蛋白质聚集物的形成、神经毒性和/或结合伙伴稳定性的丧失而起到有害作用[41]. 例如，已发现YWHAQ和YWHAE在PD细胞模型中抑制鱼藤酮诱导的凋亡[42]. 基于DAVID功能聚类富集分析，TSPO与YWHAQ相互作用的一个可能作用可能是调节TSPO靶向参与凋亡信号通路的线粒体膜。但未来的研究需要提供直接证据。因为YWHAQ已知抑制细胞凋亡[42]研究表明，TSPO通过与VDAC的相互作用参与细胞凋亡，产生ROS，从而激活有丝分裂[43]，运营商A147吨TSPO与YWHAQ的相互作用较弱，可能更容易导致细胞凋亡。了解与TSPO互动的作用需要进一步调查。

二十多年来，TSPO与VDAC的交互已经有了很好的记录[36]并且在连接线粒体内外膜的转导体中持续观察到。这种相互作用因其在激素诱导的类固醇生成中的作用而最具特点[44]. TSPO与VDAC的直接相互作用已通过各种方法进行了演示，包括蓝色本征聚丙烯酰胺凝胶电泳[25]免疫沉淀和显微镜检查[44]和铜提纯[45]. 然而，尽管两种TSPO都出现了高分辨率晶体结构，但这种相互作用在分子水平上的模式仍然没有很好的表征[46]和VDAC[47,48]. 热休克蛋白（HSPs），包括HSP90AA1，在将蛋白质传递到线粒体外膜（OMM）以ATP依赖的方式导入和促进易位方面发挥着重要作用[49].

支持信息

S1图

hTSPO的已验证非相互作用体重量和hTSPOA147吨.

A-B）14-3-3η蛋白（YWHAH）和14-3-3β（YWHAB）与V5标记的人TSPO在U87MG细胞中表达重量或TSPO147吨.A）YWHAH和hTSPO的Co-IP重量或hTSPOA147吨用V5抗体和免疫印迹法检测myc。YWHAH未与V5共同纯化。B） YWHAB和hTSPO的Co-IP重量或hTSPOA147吨用V5抗体和免疫印迹法检测myc。YWHAB未与V5共同纯化。

（PDF格式）

S1表

hTSPO免疫沉淀的Mascot LC-MS/MS结果重量，hTSPOA147吨以及通过V5抗体或对照IgG免疫沉淀的非转染（WT）线粒体。

基于1个或多个总光谱计数>2且蛋白错误发现率≤1%的独特肽，鉴定出647个独特蛋白。

（XLSX）

资金筹措表

这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会（拨款编号1136241、1132524、2001572）和澳大利亚研究委员会（DP210101957）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在手稿及其支持信息文件夹。

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决定书0

安贾尼·库马尔·蒂瓦里,学术编辑
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2021年7月27日

PONE-D-21-18913

人类易位蛋白及其A147T多态性变体之间线粒体蛋白相互作用的差异

PLOS ONE系列

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感谢您向PLOS ONE提交您的手稿。经过仔细考虑，我们认为它有优点，但不完全符合《第一次公共行动纲领》目前的出版标准。因此，我们邀请您提交手稿的修订版，以解决审查过程中提出的问题。

请在2021年9月10日11:59 PM之前提交修改后的手稿。如果您需要更多时间来完成修订，请回复此消息或联系期刊办公室gro.solp@enosolp公司。准备好提交修订版后，请登录https://www.editorialmanager.com/pone网站/并选择“需要修订的提交文件”文件夹以查找您的手稿文件。

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Anjani Kumar Tiwari博士。

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https://journals.plos.org/plosone/s/file？id=ba62/plosone_formatting_sample_title_authors_affliations.pdf

2.请更新您的提交以使用PLOS LaTeX模板。有关LaTeX提交要求的模板和更多信息，请访问http://journals.plos.org/plosone/s/latex.

3.我们注意到您在“资金信息”和“财务披露”部分中提供的拨款信息不匹配。 

当您重新提交时，请确保在“资助信息”部分中为您获得的研究奖励提供正确的资助编号。

4.感谢您在手稿的确认部分中陈述以下内容：

这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会的资助

13以及澳大利亚研究委员会向M.K.、Y.D.K.和L.M.I。。

我们注意到，您在确认部分中提供了当前未在您的资金报表中声明的其他信息。请注意，资金信息不应出现在您稿件的致谢部分或其他区域。我们将只发布在线提交表格的资金报表部分中的资金信息

请删除手稿中与资金相关的任何文本，并告知我们您希望如何更新您的资金报表。目前，您的资金报表如下：

资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

请在求职信中附上修改后的声明；我们将代表您更改在线提交表格。 

5.PLOS ONE现在要求作者提供原始的未裁剪和未调整的图像，这些图像是提交数据或支持信息文件中报告的所有斑点或凝胶结果的基础。该政策以及该杂志对印迹/凝胶报告和数字准备的其他要求在https://journals.plos.org/plosone/s/数字#loc-印迹和凝胶报告要求和https://journals.plos.org/plosone/s/数字#loc-从图像文件制备图形。当您提交修改后的手稿时，请确保您的数字完全符合这些指导原则，并为您提交的所有墨迹或凝胶数据提供原始基础图像。有关提供原始图像数据的说明，请参阅以下链接：https://journals.plos.org/plosone/s/数字#loc-原始图像-用于布lots和gels。 

  

在您的求职信中，请注意您的印迹/凝胶图像数据是在支持信息中还是发布在公共数据存储库中，如果相关，请提供存储库URL，并提供具体细节，说明哪些原始印迹/胶体图像（如果有）不可用。发送电子邮件至enosolp的gro.solp如果你有任何问题。

6.请在手稿末尾添加支持信息文件的标题，并相应地更新任何文本引用。有关更多信息，请参阅我们的支持信息指南：http://journals.plos.org/plosone/s/supporting-information。 

其他编辑评论：

这是一次很好的尝试，可以看到相互作用，但结果并不乐观。需要进一步的支持数据。如果可能的话，作者可以提供其他研究的见解，并应添加此方向所需的详细未来研究。这将有助于那些试图在不同病理条件下对这种蛋白建立新见解的人。

请检查您的参考名单，以确保其完整和正确。如果你引用了已经被撤回的论文，请在手稿文本中包含这样做的理由，或者删除这些参考文献并用相关的当前参考文献替换它们。参考书目的任何更改都应在修改后的手稿附带的反驳信中提及。如果你需要引用一篇被撤回的文章，请在参考文献列表中注明该文章的被撤回状态，并包括引用和撤回通知的完整参考文献。

[注意：下面是HTML标记。请不要编辑。]

审核人意见：

审查人对问题的回应

对作者的评论

1.手稿在技术上是否合理，数据是否支持结论？

手稿必须用支持结论的数据描述一项技术上合理的科学研究。实验必须严格进行，有适当的控制、复制和样本量。必须根据所提供的数据得出适当的结论。

1号审核人：是

2号评审员：是

**********

2.是否进行了适当和严格的统计分析？

1号评审员：否

2号评审员：是

**********

3.作者是否充分利用了其手稿中发现的所有数据？

这个PLOS数据政策要求作者无限制地提供其手稿中描述的所有发现基础数据，极少例外（请参阅手稿PDF文件中的数据可用性声明）。这些数据应作为手稿或其支持信息的一部分提供，或存放在公共存储库中。例如，除了汇总统计数据外，还应提供均值、中位数和方差度量值背后的数据点。如果对公开共享数据（例如参与者隐私或使用第三方数据）有限制，则必须指定这些限制。

1号审核人：是

2号审核人：否

**********

4.手稿的呈现方式是否通俗易懂，是否用标准英语书写？

PLOSONE不会复制已接受的手稿，因此提交的文章中的语言必须清晰、正确和明确。任何印刷或语法错误都应在修订时更正，因此请注意此处的任何具体错误。

1号审核人：是

2号评审员：是

**********

5.对作者的评审意见

请使用提供的空白处解释您对上述问题的回答。您还可以为作者添加其他评论，包括对双重出版物、研究道德或出版物道德的担忧。（如果超过20000个字符，请将您的评论作为附件上传）

1号审稿人：题为“人类转运蛋白及其A147T多态性变体之间的线粒体蛋白相互作用差异”的论文手稿以适当的方式提交。然而，作者在重新提交之前应考虑以下更正：

1.第10页，L16将“cOmplete”替换为“cOmplete”

2.第10页，L17；第10页，L 22；第11页，L 6，将“）”替换为“）”

3.第11页，L 13替换“抑制剂”带有“抑制剂”

4.保持单位一致性，例如50 mM代替50 mM，4 oC代替4 oC，min代替Minutes，h代替hour，mL或mL，g代替gram，10 cm代替10cm，μl代替microll等

5.第12页，L 13-15，L16-18更正句子

6.第17页，L12-14，改写句子

7.第20页第8行，替换“实验”用“实验”

我发现实验是按计划进行的。从技术上讲，手稿不错。

评论员#2:Lars M Ittner和团队的一项有趣的研究工作。

这是第一次研究人类易位蛋白及其A147T多态性变体之间的相互作用。

总之，结果表明人类TSPO的6 A147T多态性变异体失去了一部分相互作用伙伴，但其中一个积极的方面似乎是

“TSPO与YWHAQ 7的相互作用可能有助于调节TSPO靶向线粒体膜，涉及8条凋亡信号通路”

作者是否通过其他证据进一步支持这一观点。

**********

6.公共科学图书馆的作者可以选择出版他们文章的同行评议历史(这意味着什么？). 如果发布，这将包括您的完整同行评审和任何附加文件。

如果您选择“否”，您的身份将保持匿名，但您的评论仍可能被公开。

你想在这次同行评审中公开你的身份吗？有关此选择的信息，包括同意撤回，请参阅我们的隐私政策.

1号审核人：是：Pooja Srivastava博士

2号审核人：否

[注意：如果审阅者的评论以附件文件的形式提交，它们将被附加到此电子邮件中，并可通过提交网站进行访问。请登录您的帐户，找到手稿记录，并检查操作链接“查看附件”。如果未显示此链接，则没有附件文件。]

在修改您的提交文件时，请将您的图形文件上传到飞行前分析和转换引擎（PACE）数字诊断工具https://pacev2.apexcovantage.com/.PACE有助于确保数据符合PLOS要求。要使用PACE，您必须首先注册为用户。注册是免费的。然后，登录并导航到UPLOAD选项卡，您将在其中找到有关如何使用该工具的详细说明。如果您在使用PACE时遇到任何问题，请发送电子邮件至PLOSgro.solp@serugif公司。请注意，支持信息文件不需要此步骤。

2022;17(5)：e0254296。
2022年5月6日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pone.0254296.r002

作者对决定书0的回应

版权和许可信息 PMC免责声明

2022年2月7日

对评审意见的点对点回应

我们感谢两位评审员的意见，他们的意见如下所示。我们希望您能找到手稿的修订版，以便在《公共科学图书馆·综合》上发表。

1号评论员：题为“人类易位蛋白及其A147T多态性变体之间的差异线粒体蛋白相互作用图谱”的论文手稿以适当的方式呈现。然而，作者在重新提交之前应考虑以下更正：

1.第10页，L16将“cOmplete”替换为“cOmplete”

2.第10页，L17；第10页，L 22；第11页，L 6，将“）”替换为“）”

3.第11页，L 13替换“抑制剂”带有“抑制剂”

4.保持单位的一致性，例如50 mM代替50 mM，4 oC代替4 oC，min代替min，h代替h，mL或mL，g代替gram，10 cm代替10cm，μl代替微升等

5.第12页，L 13-15，L16-18更正句子

6.第17页，L12-14，改写句子

7.第20页第8行，替换“实验”用“实验”

回复：我们感谢这位审稿人的详细评论，并做出了要求的更改。为了您的方便，所有更改都已在修订稿的标记版本中突出显示。

我发现实验是按计划进行的。从技术上讲，手稿不错。

回复：非常感谢。

评论员#2:Lars M Ittner和团队的一项有趣的研究工作。

这是第一次研究人类易位蛋白及其A147T多态性变体之间的相互作用。

总之，结果表明人类TSPO的6 A147T多态性变异体失去了一部分相互作用伙伴，但其中一个积极的方面似乎是

“TSPO与YWHAQ 7的相互作用可能有助于调节TSPO靶向线粒体膜，涉及8条凋亡信号通路”

作者是否通过其他证据进一步支持这一观点。

答复：我们仔细改写了这句话，以表明需要进一步调查以提供直接证据。现在它写道：“根据DAVID功能聚类富集分析，TSPO与YWHAQ相互作用的一个可能作用可能是调节TSPO靶向参与凋亡信号通路的线粒体膜。但未来的研究需要提供直接证据。”

附件

提交的文件名：PtP信函修订.pdf

2022;17(5)：e0254296。
2022年5月6日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pone.0254296.r003

决定书1

安贾尼·库马尔·蒂瓦里,学术编辑
版权和许可信息 PMC免责声明

2022年4月6日

人类易位蛋白及其A147T多态性变体之间线粒体蛋白相互作用的差异

PONE-D-21-18913R1

尊敬的作者

我们很高兴地通知您，您的手稿已被科学地判断为适合出版，一旦满足所有突出的技术要求，将被正式接受出版。

一周内，您将收到一封电子邮件，详细说明所需的修改。这些问题解决后，您将收到一封正式的接受函，您的手稿将被安排出版。

正式验收后不久将收到付款发票。为了确保有效的流程，请登录编辑经理http://www.editorialmanager.com/pone/，单击页面顶部的“更新我的信息”链接，并仔细检查您的用户信息是否是最新的。如果您有任何与账单相关的问题，请直接联系我们的作者账单部门gnillibrohtua的gro.solp.

如果您的机构设有新闻办公室，请通知他们您即将发表的论文，以帮助最大限度地发挥其影响力。如果他们将准备新闻材料，请尽快通知我们的新闻团队，最迟不迟于收到正式验收后48小时。你的手稿在出版之日东部时间下午2点之前将受到严格的新闻封锁。欲了解更多信息，请联系gro.solp@sserpeno公司.

谨致问候，

Anjani Kumar Tiwari博士。

学术编辑

PLOS ONE系列

其他编辑器注释（可选）：

这种形式的手稿可以出版。

审核人意见：

审查人对问题的回应

对作者的评论

2号评审员：所有意见均已解决

3号评审员：所有意见均已解决

**********

2.手稿在技术上是否合理，数据是否支持结论？

手稿必须用支持结论的数据描述一项技术上合理的科学研究。实验必须严格进行，有适当的控制、复制和样本量。必须根据所提供的数据得出适当的结论。

2号评审员：是

3号审核人：是

**********

3.统计分析是否得到了适当和严格的执行？

2号审核人：不适用

3号审核人：是

**********

4.作者是否已将手稿中发现的所有数据全部公开？

这个PLOS数据政策要求作者无限制地提供其手稿中描述的所有发现基础数据，极少例外（请参阅手稿PDF文件中的数据可用性声明）。这些数据应作为手稿或其支持信息的一部分提供，或存放在公共存储库中。例如，除了汇总统计数据外，还应提供均值、中位数和方差度量值背后的数据点。如果对公开共享数据（例如参与者隐私或使用第三方数据）有限制，则必须指定这些限制。

2号评审员：是

3号审核人：否

**********

5.手稿的呈现方式是否通俗易懂，是否用标准英语书写？

PLOSONE不会复制已接受的手稿，因此提交的文章中的语言必须清晰、正确和明确。任何印刷或语法错误都应在修订时更正，因此请注意此处的任何具体错误。

2号审核人：否

3号审核人：是

**********

6.给作者的审查意见

请使用提供的空白处解释您对上述问题的回答。您还可以为作者添加其他评论，包括对双重出版物、研究道德或出版物道德的担忧。（如果评论超过20000个字符，请将其作为附件上传）

2号评论员：我可以看到，几乎所有专家提出的问题都已在修订稿中得到了答复，因此我认为学术编辑可能会允许在PLOS ONE上发表

3号审稿人：之前审稿人提出的所有问题都已得到回复，因此可以考虑在PLOS One中发布。

**********

7.公共科学图书馆的作者可以选择出版他们文章的同行评议历史(这意味着什么？). 如果发布，这将包括您的完整同行评审和任何附加文件。

如果您选择“否”，您的身份将保持匿名，但您的评论仍可能被公开。

你想在这次同行评审中公开你的身份吗？有关此选择的信息，包括同意撤回，请参阅我们的隐私政策.

2号审核人：否

3号审核人：否

2022;17(5)：e0254296。
2022年5月6日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pone.0254296.r004

中标通知书

安贾尼·库马尔·蒂瓦里,学术编辑
版权和许可信息 PMC免责声明

2022年4月28日

部件-D-21-18913R1

人类易位蛋白与其线粒体蛋白相互作用的差异A147吨多态性变体

尊敬的Ittner博士：

我很高兴地通知你，你的手稿被认为适合在《公共科学图书馆·综合》上发表。祝贺 你！你的手稿现在交给了我们的生产部。

如果你的机构有新闻办公室，请让他们知道你即将发表的论文，以帮助最大限度地发挥其影响力。如果他们准备新闻材料，请在48小时内通知我们的新闻团队。你的手稿在出版之日东部时间下午2点之前将受到严格的新闻封锁。有关更多信息，请联系gro.solp@sserpeno公司.

如果我们能提供其他帮助，请发送电子邮件至enosolp的gro.solp.

感谢您向PLOS ONE提交您的工作并支持开放访问。

谨致问候，

《PLOS ONE》编辑部职员

代表

Anjani Kumar Tiwari博士

学术编辑

PLOS ONE系列

文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃