ACS纳米。作者手稿；PMC 2022年4月20日提供。
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尼姆斯：美国国立卫生研究院1794466
工程胞外囊泡对辐射引发的GBM免疫检查点的抑制作用
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田田
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129；南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166
梁如玉
南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166
古尔萨·埃雷尔·阿克巴巴
哈佛医学院马萨诸塞州总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗和分子成像科，美国马萨诸塞州波士顿02129；土耳其伊兹密尔卡蒂普塞莱比大学药学系药物生物技术系，伊兹密尔35620
洛伦佐·萨阿德
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129
皮埃尔·奥贝德
黎巴嫩的黎波里Deir El-Balamand巴拉曼德大学化学系
Jun Gao（高军）
南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166
E.安东尼奥·乔卡
美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院百翰女子医院神经外科，邮编：02115
斯莱德
美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院马萨诸塞总医院系统生物学中心，邮编：02129
Bakhos A.Tannous公司
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129
田田，美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129；南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，南京，江苏211166；
#（T.T.，R.L.）这些作者为这项工作做出了同等贡献。
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支持信息。
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摘要
缺乏安全有效的跨血脑屏障递送和深刻的免疫抑制微环境是胶质母细胞瘤（GBM）治疗的两个主要障碍。细胞外囊泡（EV）被用作GBM的治疗载体，但疗效有限。我们假设，通过（i）用脑肿瘤靶向的环状RGDyK肽（RGD-EV）修饰EV表面，以及（ii）使用突发辐射增强积聚，可以增强EV向GBM的传递。此外，EV被加载小干扰RNA（siRNA）以对抗程序性细胞死亡配体-1（PD-L1），用于免疫检查点阻断。我们表明，这种基于EV的策略显著提高了RGD-EV对小鼠GBM的靶向效率，而负载的siRNA逆转了肿瘤细胞上受辐射刺激的PD-L1表达，并招募肿瘤相关的髓细胞，提供了协同效应。联合治疗显著增加CD8+细胞毒性T细胞活性，阻止肿瘤生长，延长动物生存期。所选择的用于EVs分离的细胞源和所提出的功能化策略适用于大规模生产。这些结果为GBM免疫检查点治疗提供了一种基于EV的治疗策略，可以转化为临床应用。
关键词：胶质母细胞瘤，细胞外囊泡，免疫治疗，放射治疗，靶向给药
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见、最致命的肿瘤，在标准护理手术、化疗和放射治疗（RT）后，中位生存期不到15个月。1,2迄今为止，一些癌症类型对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）或程序性细胞死亡1（PD-L1）的免疫检查点阻断反应良好。三,4然而，这些治疗（nivolumab和ipilimumab）对GBM患者的疗效有限，可能是因为（i）血脑屏障（BBB）和/或血脑肿瘤屏障（BBTB），（ii）GBM的深层免疫抑制微环境，以及（iii）治疗窗口狭窄，不允许剂量增加，存在严重的安全问题。5,6因此，迫切需要开发跨越BBB/BBTB并以GBM为靶点的治疗药物来调节免疫微环境。
细胞外小泡（EV）包括外泌体、微泡或凋亡小体，已作为递送系统和再生无细胞效应器出现。7,8在过去几年中，许多研究描述了电动汽车成功交付药物和生物制品。事实上，电动汽车与其他运载方式相比具有一些优势，例如先天稳定性、低免疫原性和跨越生物屏障的固有能力。9已经做出了许多努力，为货物装载和目标交付量身定制电动汽车。例如，通过对供体细胞进行工程设计，使其表达融合到神经特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽的Lamp2b，从而产生脑靶向EV。10我们之前开发了一种快速有效的化学方法，将靶向肽偶联到EV表面。11我们使用了cyclo（精氨酸-赖氨酸-Asp-d日-Tyr-Lys）肽[c（RGDyK）]结合外泌体，通过靶向整合素向缺血性脑提供治疗药物α五β三反应性脑血管内皮细胞。11此外，前列腺患者的尿液外泌体被用于靶向和深入穿透前列腺肿瘤，为肿瘤靶向纳米载体提供了可靠的物质来源。12至于货物装载，流行的策略包括电穿孔、超声波和用疏水改性化合物孵育。13通过电穿孔将光敏剂加载到尿液外泌体中，将其导入癌细胞后，成功地实现了优异的光动力性能。14使用疏水性RNA分子可以提高RNA载入EVs的效率。15精氨酸-赖氨酸肽（RGD）是已知的结合整合素的配体α五β三在不同类型的肿瘤细胞及其血管上过度表达，包括GBM。事实上，整合素α五β三与正常大脑相比，在GBM中的表达是恭敬的。16环RGD修饰的纳米材料成功地向大脑和肿瘤提供了治疗药物。17,18
RT仍然是治疗GBM最重要的非手术治疗方法。我们和其他人已经表明，短爆发放射治疗可以促进GBM以肿瘤相关巨噬细胞（TAM）依赖的方式增强纳米颗粒的靶向递送。19–21此外，RT有可能改变免疫环境，并使免疫原性较差的肿瘤对免疫检查点的阻断敏感。22然而，肿瘤相关的髓样细胞（TAMC）主要被招募到GBM中，以响应RT，PD-L1表达增加，导致抗肿瘤免疫受损。23因此，我们假设突发辐射可以提高EV对脑肿瘤的靶向效率，而PD-L1抑制剂的联合使用可以增加GBM治疗的益处。
在这项研究中，我们开发了c（RGDyK）共轭EVs（RGD-EV），并将其加载到针对PD-L1的siRNA中。我们发现，短脉冲辐射显著提高了RGD-EV对脑肿瘤及其微环境的靶向效率，有效减弱了辐射诱导的TAMC和肿瘤细胞PD-L1表达。RT结合靶向EV免疫治疗导致CD8显著活化+细胞毒性T细胞，抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期。我们提供了一种靶向治疗性EV，用于以放射爆发为基础的GBM免疫检查点阻断。
结果
RGD-EV靶向输送用辐射引物GBM的短脉冲。
我们首先从ReNcell VM（ReN）细胞中分离出EVs，ReNcell VM是一种来源于人类胎儿大脑腹侧中脑区域的神经祖细胞系，在无血清培养基中培养3天(图S1). 这些EV富含Alix和TSG101标记(). 典型EV蛋白质产量为17–29μg/mL培养基，相当于3.7–6.4×109纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的每毫升颗粒数。我们偶联了脑肿瘤靶向配体c（RGDyK）肽，18使用我们之前描述过的快速简单的化学改性方法将其涂在EV表面().11简单地说，将二苄基环型（DBCO）基团引入EV表面，并使用无铜点击化学与叠氮功能肽反应，形成稳定的三唑键。为了追踪EV的生物分布，将Cy5.5叠氮化物偶联到其表面。NTA分析和透射电子显微镜（TEM）表明，RGD-EV在物理上与无功能EV相似，大多数粒径在100到250 nm之间，在形态上没有显著差异(,). 为了证实EV表面上存在肽，我们按照我们的方案将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的环肽c[RK（FITC-DyK]偶联到EV上。针对FITC的酶联免疫吸附试验（ELISA）表明，与非结合EV相比，c[RK（FITC）DyK]结合EV产生了显著更高的吸光度，而非标记c（RKDyK）肽预处理阻断了大多数信号(图S2A,B类). 此外，从稳定表达tdTomato融合棕榈酰化信号（palm-tdTomato）的ReN细胞中分离出EVs，该信号标记细胞膜和相应的EVs。24这些td番茄标记EV也与c[RK（FITC）DyK]结合。荧光显微镜显示与EV对应的小颗粒，其中来自c[RK（FITC）DyK]肽的FITC信号与tdTomato共定位(图S2C). 这些数据证明了肽在EV上的成功结合。此外，具有或不具有相同蛋白质量的不同肽结合物的EV之间的荧光强度（Cy5.5或tdTomato）没有显著差异，表明不同EV池之间的标记效率是一致的(图S3A,B类).
RGD-EV的修饰与表征。（A）ReN细胞及相应EV中Alix、TSG101的Western blot分析；EVs分离过程中通过超速离心获得的上清液用作阴性对照。（B） 示意图总结了通过两步反应将c（RGDyK）和Cy5.5荧光团共轭到EV胺基。未修改EV和RGD-EV的（C，D）NTA（C）和TEM成像（D）；比例尺，200 nm。
为了评估RGD-EV的靶向能力以及短爆发辐射是否能增强其在GBM中的摄取，我们使用了一个同基因小鼠模型，通过在左纹状体中植入稳定表达萤火虫萤光素酶（Fluc）和绿色荧光蛋白（GFP）的GL261细胞。植入后第7天通过Fluc生物发光成像监测肿瘤体积(图S4). 然后将小鼠随机分为两组，分别接受5Gy的突发RT或对照组。三天后，给小鼠静脉注射PBS或100μg Cy5.5标记的非靶向控制电动汽车或RGD-EV。给药EVs 24小时后，取下大脑并进行近红外荧光（NIRF）成像分析。有趣的是，接受RT的小鼠大脑中Cy5.5信号显著升高，表明RT的爆发增强了EV和RGD-EV的传递(–). 特别是，RGD-EV联合RT显示脑肿瘤对Cy5.5信号的最大摄取量，是单独EV的5.24倍(). 为了证实肿瘤对EVs的吸收，将td番茄标记的RGD-EV静脉注射给受上述辐射照射的荷瘤小鼠。脑切片的荧光显微镜显示，与对照组相比，经RT激发的GFP阳性肿瘤细胞和CD11b阳性细胞（如TAMC和小胶质细胞）中的tdTomato（因此EVs）增加(;图S5). 这些结果表明，RGD-EV在静脉注射后在GBM/微环境中积累，短爆发辐射增强了其肿瘤靶向效率。
一系列RT引物GBM增强靶向RGD-EV的摄取。（A）Cy5.5标记RGD-EV的荧光图像；比例尺，2μ（B，C）照射（或不照射）携带GBM的小鼠，3天后注射Cy5.5标记的对照EV或RGD-EV。EV给药后24小时小鼠大脑的代表性NIRF图像（覆盖有亮场）（B）。肿瘤区域荧光强度的定量（C）；数据表示为平均值±SEM(n个= 4); **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。（D） 照射GBM荷瘤小鼠并注射td番茄标记EVs或RGD-EV。EV给药后6h GBM（GFP）EVs（红色）的典型荧光图像；蓝色表示细胞核；比例尺，50μ米。
放射治疗上调GBM和微环境中的PD-L1。
辐射被广泛用于GBM治疗，通过DNA损伤诱导细胞凋亡。25许多报告支持辐射形成TAM和宿主免疫的能力，表明RT可以影响肿瘤和免疫细胞。26,27脑切片免疫荧光分析证实PD-L1在GBM/微环境中上调，以响应RT(). 然后，我们综合分析了GL261同基因小鼠模型中带有和不带有RT的GBM和肿瘤浸润免疫细胞。从每个大脑中提取细胞，并通过流式细胞术进行表型特征分析（选通示例如图S6和第7部分). RT诱导GBM细胞、TAMC（包括TAM和髓源性抑制细胞（MDSC））和小胶质细胞PD-L1表达显著增加，但肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中PD-L1的表达没有显著增加；,;图S8). 有趣的是，RT导致肿瘤细胞丰度降低，而TAMC和TIL的丰度分别显著升高4倍和3倍(–). 这些结果与之前的报告一致，报告显示免疫细胞主要被招募到GBM中，以应对辐射诱导的DNA损伤。27相比之下，有或无RT的小胶质细胞的丰度没有显著差异。综上所述，鉴于小胶质细胞丰度较低（<5%），肿瘤细胞和TAMC被强调为RT后PD-L1介导的免疫抑制的两个关键因素。
RT诱导GBM和免疫微环境中PD-L1的上调。（A） 放射和非放射肿瘤GL261脑肿瘤切片PD-L1（红色）和Hoechst细胞核（蓝色）染色后的荧光分析；比例尺，50μm.（B，C）流式细胞术分析RT（或对照）后GBM细胞和浸润免疫细胞（TAMC、TIL、小胶质细胞）中PD-L1的表达。PD-L1（B）和MFI（C）的代表性直方图。（D，E）根据GFP百分比确定的肿瘤细胞丰度量化+人口。（F） 不同免疫细胞（TIL、CD45）的门控策略高的CD11b型−; TAMC、CD45高的CD11b型+; 小胶质细胞，CD45整数CD11b型+)免疫细胞亚群的百分比。（G） 流式细胞术测定TAMC、TIL和小胶质细胞的相对细胞丰度。数据表示为平均值±SEM(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001由学生决定t吨-测试。
RGD-EV:siPDL1靶向并下调辐射引物GBM中PD-L1的表达。
为了抑制辐射诱导的PD-L1表达，采用RGD-EV作为载体，将针对PD-L1的siRNA（siPDL1）传递到GBM。如前所述，RGD-EV-与胆固醇修饰的siPDL1-孵育。15,28亲脂性siPDL1与RGD-EV自结合，通过超速离心去除游离siRNA(). 通过NTA和TEM分析，生成的RGD-EV:siPDL1显示在siPDL掺入后向稍大的囊泡转变(,)，与之前的报告一致。29为了评估siRNA-loaded RGD-EV的靶向能力，对荷瘤小鼠进行5-Gy RT治疗，3天后，静脉注射Cy5.5标记的RGD-EV:siPDL1，24小时后解剖大脑。NIRF成像显示，RGD-EV:siPDL2在照射的GBM中大量积聚，与未经辐射的小鼠的未经修饰的EV相比，该值大约高出5倍(,)同时，去除不同器官（肝、肺、肾、脾和心脏），并通过NIRF成像定量分析EVs的生物分布(图S9A,B类). EV主要积聚在肝脏，其次是肾脏和脾脏，而RGD-EV:siPDL1在受照大脑中的信号明显更强。上述结果表明，siRNA负载不会影响RGD-EV对GBM的靶向能力。为了用另一种实验证实生物分布结果，我们用高斯（Gaussia）荧光素酶（Gluc）通过稳定表达Gluc融合到供体ReN细胞中血小板衍生生长因子受体的跨膜结构域。30同样，相同蛋白量的Gluc-标记EV:siPDL1和RGD-EV:siPD L1之间的Gluc活性没有显著差异，表明不同EV池之间的标记一致(图S3C). 将这两个工程EV系统性注射到经5-Gy RT处理的荷瘤小鼠体内。20小时后，不同小鼠器官中的Gluc活性（通过PBS经心灌注收集）证实了Cy5.5标记的结果，表明RT增强了脑肿瘤中RGD-EV:siPDL1的摄取(图S9C).
RGD-EV:siPDL1靶向并下调用RT引物的GBM中的PD-L1。（A）RGD-EV的示意图，Cy5.5标记，并加载胆固醇修饰的siPDL1。RGD-EV:siPDL1的（B，C）NTA（B）和TEM成像（C）；比例尺，200 nm。以5-Gy RT为引物的（D-E）含微球的GL261肿瘤注射Cy5.5标记的EVs或RGD-EV:siPDL1，24小时后分析大脑中Cy5.5的水平。显示了具有代表性的脑部NIRF图像（D）和肿瘤区域荧光强度的量化（E）。数据表示为平均值±SEM(n个= 4); ***P（P）<0.001（按学生）t吨-测试。用RT和静脉注射PBS、携带siCtrl或siPDL1的靶向或非靶向EV对（F，G）GBM荷瘤小鼠进行预处理。48小时后，通过流式细胞术分析GBM细胞和TAMCs上PD-L1的表达，根据PD-L1百分比测定+种群（F）和PD-L1 MFI（G）。数据表示为平均值±SEM(n个= 6); **P（P）< 0.01, ****P（P）通过单因素方差分析，<0.0001。
为了研究RGD-EV传递的siPDL1对GBM的治疗作用，我们首先验证了不同EV处理后培养的GL261细胞中PD-L1的敲除(图S10). 通过将5-羧基荧光素（FAM）标记的siRNA（胆固醇修饰）加载到scr-EV或RGD-EV上并进行荧光评估，估算siRNA的剂量。使用自由FAM-siCtrl或FAM-siPDL1的荧光标准曲线，我们计算出100μg RGD-EV:siPDL1、scr EV:siPDL1或RGD-EV:siCtrl平均分别含有814、790或856pmol的siRNA，而在这些组之间没有观察到siRNA量的显著差异(图S11). 然后，在GL261同基因小鼠模型中评估不同的治疗方案。5-Gy RT后72小时，荷瘤小鼠静脉注射PBS或100μ克（单位：200μL PBS），即RGD-EV:siCtrl（携带目标EV的控制siRNA）、scr-EV:siPDL1（携带siPDL1的加扰c（RDGyK）结合的非目标EV）或RGD-EV：siPDL2（携带siPDL的目标EV。给药48小时后，对GBM组织进行解剖并用流式细胞仪进行分析。RGD-EV:siPDL1显著降低了肿瘤细胞和TAMC上PD-L1的水平，而RGD-EV:siCtrl或scr-EV:siPD L1组没有显示出具有统计意义的影响(,). 这些结果表明，RGD-EV:siPDL1下调以RT引物启动的GBM细胞和TAMC上的PD-L1，并且这种下调在很大程度上依赖于RGD-EV的靶向递送。
RGD-EV:siPDL1增加TIL CD8+辐射引发GBM中的细胞毒性T细胞。
由于PD-L1的关键功能是抑制T细胞活性并诱导免疫抑制，因此我们探讨了RGD-EV:siPDL1对CD8的影响+细胞毒性T细胞体内.用5-Gy（或未照射作为对照）局部照射含云母的GL261 GBM，3天后，静脉注射PBS（对照）或100μ克（单位：200μL PBS），RGD-EV:siCtrl、scr-EV:siPDL1或RGD-EV:siPDL1。根据中的方案重复RT和EV注射第21天，CD8的比例和增殖+通过流式细胞术评估肿瘤微环境中的T细胞（门控策略如图S12A). CD8的丰度+T细胞（CD45的百分比+CD3（CD3）+乘以CD8的百分比+子集）随RT增加，当RGD-EV:siPDL1与RT结合时达到最大值(). 同样，RT显著增加CD8的比率+/CD3（CD3）+当与scr-EV:siPDL1或RGD-EV:siPD L1结合时，其进一步放大(,). 值得注意的是，RT+RGD-EV:siPDL1导致CD8丰度更高+T细胞和CD8+/CD3（CD3）+与RT+scr-EV:siPDL1相比的比率，这可以归因于siPDL的靶向递送。此外，RGD-EV:siPDL1增强的CD8+T细胞增殖（Ki67+)而RT和RGD-EV:siPDL1的联合作用最强(,;图S12B). 此外，脑切片上的免疫染色显示CD8较高+RT后T细胞浸润到肿瘤中，RT+RGD-EV:siPDL1组的T细胞浸润量最高(). 总之，这些结果证实RGD-EV:siPDL1+RT显著增加CD8的数量+T细胞在GBM微环境中并促进其增殖。
RGD-EV:siPDL1增加TIL CD8+RT爆发后GBM微环境中的T细胞。（a）GBM小鼠RT和EV治疗的实验流程示意图。在第21天采集脑肿瘤样本。（B，C）CD8的代表斑马图+/CD3（CD3）+CD8上的比率（B）和Ki67染色+T细胞（C）。（D） CD8（CD8）+T细胞丰度测定为CD8的百分比+CD3-CD8图中的子集乘以CD45的百分比+CD3（CD3）+，归一化为PBS对照组。（E） CD8的量化+/CD3（CD3）+比率。（F） 增殖百分比的量化（Ki67+)CD8（CD8）+T细胞。（G） 脑肿瘤（GFP）切片上CD8（红色）和细胞核（蓝色）的免疫染色；比例尺，50μm.数据表示为平均值±SEM(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。
RGD-EV:siPDL1与RT协同促进抗肿瘤反应。
验证RGD-EV:siPDL1与RT结合是否能增强CD8的效应器功能+根据实验方案，对GBM荷瘤小鼠进行T细胞、RT和不同EV治疗方案第21天，从GBM微环境中提取浸润淋巴细胞，并在佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）和离子霉素的刺激下培养。流式细胞术分析表明，RGD-EV:siPDL1单独或RT（与PBS或RGD-EV:siCtrl）导致CD8的百分比增加+产生干扰素的T细胞-γ、TNF-α，和粒酶B，在用携带siPDL1的靶向或非靶向EV处理的组中进一步增加(,;图S13). 在所有方案中，RGD-EV:siPDL1联合RT诱导了最大数量的效应物CD8+T细胞。此外，RT+RGD-EV:siPDL1导致所有三个功能标记（IFN）的MFI在统计学上更高-γ、TNF-α，和CD8的颗粒酶B）+T细胞(,).
RGD-EV:siPDL1与RT协同促进CD8+GBM中的T细胞效应器功能。用RT和/或不同EV配方处理GBM荷瘤小鼠，从GBM微环境中提取浸润淋巴细胞，并在PMA和离子霉素的刺激下培养。（A） 描绘干扰素的典型斑马图-γ、TNF-α和TIL CD8上Granzyme B的表达+GBM中的T细胞。（B）TIL CD8的定量+由干扰素百分比确定的T细胞效应器功能-γ+、TNF-α+和Granzyme B+人口及其MFI。数据表示为平均值±SEM(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。
最后，我们评估了使用RGD-EV:siPDL1作为RT爆发的联合治疗策略的潜力。根据以下示意图，使用PBS、RGD-EV-siPDL1、RT或RT与不同EV配方的组合治疗GBM小鼠。通过Fluc生物发光成像监测肿瘤随时间的生长(,). 与PBS组相比，RGD-EV:siPDL1单独对肿瘤生长有轻微但不显著的影响。RT单独或与RGD-EV:siCtrl或scr-EV:siPDL1联合使用产生中度抗肿瘤作用。重要的是，接受RT加RGD-EV:siPDL1的小鼠对肿瘤生长的影响最为显著。此外，众所周知，GL261是一种侵袭性小鼠神经胶质瘤模型，其中位生存期较短，为22.5天(). RGD-EV:siPDL1单药治疗仅显示边际疗效（中位生存24天）。RT单独或与RGD-EV:siCtrl联合使用对小鼠存活率有显著影响（平均存活时间约为30天）。RT+scr-EV:siPDL1显示出更强的效果，中位生存期为34天。值得注意的是，RT和RGD-EV:siPDL1的联合使用最有效地将中位生存期延长至47天，20%的小鼠存活超过60天。总之，这些数据证实RGD-EV:siPDL1可以与RT协同促进抗肿瘤反应，抑制肿瘤生长，提高动物存活率。
RGD-EV:siPDL1与RT协同增强GBM的免疫检查点阻断。用RT（或无辐射作为对照）刺激GBM荷瘤小鼠，72小时后，静脉注射PBS或不同EV（RGD-EV:siPDL2，RGD-EV-siCtrl，scr-EV-siPDL1）。（A） 各组代表性小鼠的Fluc生物发光成像随时间变化。（B） 用平均值±SEM表示的数据量化肿瘤相关Fluc辐射强度**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，通过单向方差分析。（C） Kaplan–Meier生存曲线如图所示(n个= 10). *P（P）< 0.05, ****P（P）通过Mantel–Cox（对数秩）检验，<0.0001。
讨论
尽管针对GBM开发了不同的治疗方法，但由于缺乏能够跨越BBB/BBTB并将治疗药物传递到肿瘤和/或微环境的安全有效的药物传递系统（DDS），因此在临床上使用这些方法的可能性有限。31电动汽车最近被证明是一种安全高效的DDS。7这些天然DDS是较成熟的合成DDS的诱人替代品，可避免毒性和快速清除，并具有穿过BBB的固有能力。9,32树突状细胞或间充质干细胞等原代细胞通常用于生产EV；10,33然而，高昂的成本阻碍了它们的临床转化，因为大规模EV分离需要细胞补充（原代细胞的扩展能力有限）和验证。34在这项研究中，我们选择了ReN细胞，这是一种人类神经祖细胞系，即使在长时间传代（>45代）后仍保持正常的二倍体核型，35–37作为电动汽车的强劲来源。我们之前的研究表明，ReNcell衍生EV成功地传递到缺血的大脑，在使用这些EV的小鼠中未观察到明显的肝毒性或组织损伤。38第二，电动汽车用c（RGDyK）进行装饰，以提高整个BBTB的GBM目标。众所周知，高水平的整合素α五β三与RGD肽结合，在肿瘤中的活性内皮细胞上过度表达，但在静止的内皮细胞上不过度表达。17,39此外，环RGD肽如c（RGDyK）对整合素具有较高的亲和力和选择性α五β三线性RGD肽。39因此，我们使用了一种化学策略来结合EV，而不是流行的细胞工程方法，这种方法不能在EV膜上显示环状肽。此外，基于生物有机无铜点击化学的化学策略简单、快速、可扩展。第三，siPDL1被加载到RGD-EV中。电穿孔是将RNA加载到EV中最常用的策略之一，但它可以导致siRNA的聚集和沉淀。40另一种基于声波和渗透剂培养的RNA加载方法可以使EV变形并破坏EV完整性。41在这里，我们使用快速疏水缔合物将胆固醇共轭的siPDL1加载到RGD-EV中。通过NTA和TEM分析，c（RGDyK）共轭后形状和尺寸分布保持不变，siPDL1负载表明EV的完整性不受影响。此外，RGD-EV:siPDL1的靶向性也得到了证实，这表明胆固醇修饰的siPDL1并不影响RGD-EV对GBM的嗜性。
免疫检查点分子的治疗性抑制引发肿瘤免疫反应，并提高几种类型癌症的长期生存率。42,43遗憾的是，迄今为止，检测点抑制剂对GBM的疗效甚微，这不仅是因为缺乏DDS，而且还因为存在深刻的免疫抑制微环境和狭窄的治疗窗口。44我们的数据显示，RGD-EV:siPDL1单独治疗并没有显著增加CD8+T细胞丰度和CD8+/CD3（CD3）+比率，并促进CD8的效应物生成+T细胞仅在很小的程度上。这些现象可能是由低免疫原性或“冷”GBM微环境引起的。45RT通过增强正常抑制的肿瘤相关抗原的表达，增加MHC-1和促炎细胞因子的表达，促进树突状细胞成熟和CD8，从而对抗免疫抑制性GBM微环境+T细胞招募。46然而，RT也主要通过释放IFN增强肿瘤细胞和微环境上PD-L1的表达-γ来自TIL。干扰素调节因子1（IRF1）是诱导PD-L1应答干扰素的核心因子-γ.47重要的是，IRF1与JAK-STAT-IRF1信号通路中PD-L1启动子的结合通过IFN介导PD-L1表达增强-γ.48,49因此，放射和检查点抑制治疗相结合有望逆转这种效应。50此外，传递siRNAs来阻断负责肿瘤增殖或免疫抑制的基因是一种有希望的癌症治疗策略。CD8（CD8）+PD-1/PD-L1阻断通过CD28共刺激信号增强T细胞增殖。51我们假设siPDL1可以恢复先前存在的CD8+PD-1信号抑制T细胞激活。在这里，我们使用RGD-EV将siPDL1传递到GBM，并显示RT诱导的PD-L1被逆转，而使用突发RT和基于RGD-EV-的检查点抑制的联合治疗显著增加CD8+T细胞数量和细胞毒性。
我们小组和其他人以前的研究表明，TAM作为纳米药物仓库，局部短脉冲辐射相对于肿瘤细胞增加TAM，从而引发肿瘤以增强纳米治疗药物的分布。20,21在这里，我们扩展了这些一般性观察结果，并表明EVs传递到GBM时也出现了类似的现象。NIRF和生物发光EV-tracking分析均表明，RGD-EVs在受照大脑中的信号明显强于未受照大脑的非靶向EVs；然而，在两个追踪系统之间观察到一些生物分布的变化，这可以通过与荧光成像相关的组织中光子的吸收和散射来解释。这种变化与之前的报告一致，这些报告表明EV分布具有不同方法的异质性。52重要的是，将基于电动汽车的靶向递送系统与辐射爆发相结合，可有效激活CD8+荷GBM小鼠的T细胞和生存益处。这些数据有力地支持了我们基于RGD-EV的策略可以用作一种联合治疗，以协同RT突发（类似于立体定向放射外科）。考虑到电动汽车的纳米尺寸，它们可以穿越血脑屏障（BBB）。53,54从供体细胞遗传来的表面蛋白有助于EV穿透BBB并进入脑实质。41,55EV的高密度和较小的亚群可以通过细胞转染突破血脑屏障。56此外，与较大的EV相比，小EV优先被细胞内化。57因此，对电动汽车异质性的进一步剖析将改进电动汽车交付系统。我们的GBM治疗策略的一个优点是在BBB/BBTB中高效地传递siPDL1，尤其是在放射引发的肿瘤中。根据以前的报告，以抗体为基础的药物的脑给药与~0.1%的给药率相关。58,59我们将RT爆发与工程EV结合的策略实现了对GBM的显著靶向性。另一个优点是基于RGD-EV的免疫治疗与RT的协同抗肿瘤作用。到目前为止，一半以上的癌症患者在某些时候接受RT治疗。电动汽车已成为学术研究之外的输送系统，进入制药公司的管道。因此，可以预期快速转化为临床实践。
结论
总之，我们通过用c（RGDyK）肽修饰GBM的表面，开发了一种跨血脑屏障/BBTB的GBM靶向EV递送系统，并表明短爆发RT可以启动GBM和微环境，以增强靶向EV的递送。RGD-EV传递siRNA可逆转辐射诱导的PD-L1表达并激活抗肿瘤免疫。这些结果提供了一种基于EV的治疗方法，用于以放射爆发（类似于立体定向放射外科）为基础的GBM免疫检查点阻断。我们认为，ReN细胞作为EV源、EV结合方法和siRNA加载策略适合大规模生产功能化EV，这将允许这些技术在不同领域的临床应用。
方法/实验
细胞培养。
人类神经祖细胞系ReN细胞（Millipore，U.S.A.）在含有2%B27（Life Technologies）、bFGF（10 ng/mL；Abm，Canada）和EGF（20 ng/mL，Abm）的DMEM/F12培养基中在5%CO下培养237°C时。GL261小鼠胶质瘤细胞系保存在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12中，在CO中2孵化器。为了用tdTomato或Gluc标记EVs，用慢病毒载体转导ReN细胞以稳定表达palm-tdTomato或者Gluc-TM，后者标记细胞膜，从而标记EV膜，如我们所述。24,30对于生物发光和荧光成像研究，GL261细胞通过携带Fluc和GFP表达盒的慢病毒载体稳定转导。
EV分离和siRNA掺入。
每1.5–2.0×106收集上清液之前，将ReN细胞在100 mm培养皿中培养72 h。EV隔离是基于我们之前的研究进行的。24简而言之，将无细胞条件培养基在300g下离心10分钟，1200g下离心20分钟，1000g下离心30分钟，以去除细胞和碎片。随后，将上清液在140000下超速离心克使用L-80XP超级离心机（Beckman Coulter，U.S.a.）在SW32Ti型转子中在4°C下保持90分钟。重新悬浮颗粒，并在140 000下超速离心克用0.22倍的浓度重新悬浮EV颗粒90分钟μm-过滤PBS并使用BCA蛋白质分析试剂盒进行分析（美国皮尔斯）。使用抗Alix和抗TSG101抗体（英国Abcam）通过Western blotting分析EV标记。
中国基因制药公司合成了siPDL1和siCtrl，用2′Ome修饰，并在3′末端与胆固醇偶联。序列如下：对于siPDL1:5′-AGACGUAAGCAGUGUUGAAdTdT-3′；对于siCtrl:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′。siRNA按照之前的协议加载到电动汽车中。28胆固醇结合的siPDL1或siCtrl（1 nmol）与EV、RGD-EV或scr-EV（100μg） 在PBS中，通过疏水相互作用将siRNAs插入EV膜中，方法是在37°C下培养1小时。对于每个独立实验，将相同类型的EV汇集在一起。在用PBS清洗并在140 000g下离心90分钟后，改性EV在使用前重新悬浮并储存在−80°C下。为了估计纳入EV的siRNAs的程度，合成了FAM标记和胆固醇偶联的siPDL1或siCtrl（GenePharma），并将其载入EV。然后是1μg EV被0.5%Triton X-100溶解（100μL PBS）以确保荧光未被熄灭，并进行荧光分析。使用游离FAM标记的siPDL1或siCtrl（20–140 nM）的标准曲线计算每个EV样品中的siRNAs浓度。
TEM和NTA。
EV样品用戊二醛固定，落在碳涂层铜网格上，用1%磷钨酸染色，并使用Tecnai G2透射电子显微镜（FEI，美国）进行分析。使用NanoSight NS300系统（英国马尔文仪器公司）执行NTA，以跟踪PBS中EV的布朗运动，并使用斯托克斯-爱因斯坦方程计算尺寸分布。
配体与EV的结合。
根据我们之前的研究，11二苯并环辛砜-N个-羟基琥珀酰亚胺酯（3 nmol；DBCO-sulfo-NHS；Sigma，美国）与EV（500μg） 室温下在PBS中放置4小时，然后用100-kDa超滤管（Millipore）过滤，以去除未结合的DBCO-硫-NHS。DBCO结合EV（DBCO-EV）已准备好通过无铜点击化学与含叠氮分子结合。由SciLight Biotechnology Co.（中国）合成了带有叠氮基团的c（RGDyK）和扰民c（RDGyK）肽。接下来，将每个肽（0.3 nmol）与DBCO-EV（500μg） 在PBS中，随后添加Cy5.5叠氮化物（0.3 nmol；Lumiprobe，美国）用于成像研究。允许反应在4°C的旋转混合器上培养12小时。为了去除未结合的配体，在PBS中通过140 000 g离心清洗EV 90分钟。将改性EV重新悬浮在PBS。对于每个独立实验，将相同类型的EV混合在一起。然后是10μg EV用0.5%Triton X-100溶解（100μL PBS），以确保荧光未被熄灭，并进行荧光分析。
为了证实EVs上的肽缀合，在第一个赖氨酸上合成了具有或不具有FITC的c（RKDyK），在最后一个赖氨酸上合成了叠氮基（NJPeptide Co.，China）。使用与RGD-EV相同的方法将c[RK（FITC）DyK]偶联到EV上，并通过ELISA（FITC]）进行分析。ELISA板（美国Biolegend）涂有CD63抗体（0.5μg/口井；Cosmo Bio，日本）在4°C下过夜。用4%BSA（200μ五十） 在室温下保持1小时。EV样品（10μ克/100μ将L PBS）添加到每个孔中并培养2 h。然后添加FITC抗体（1:200；Life Technologies）并培养1 h，清洗平板，并添加辣根过氧化物酶偶联二级抗体1 h。用四甲基联苯胺（Life Technolies）开发平板，并用0.5N h停止2所以4。通过BioTek平板读取器分析450 nm处的吸光度。
同基因胶质瘤模型。
所有动物实验均按照机构指南进行，并得到马萨诸塞州总医院和南京医科大学动物护理和使用委员会的批准。为了建立原位胶质母细胞瘤异种移植模型，用3%异氟烷麻醉C57BL/6小鼠，立体定向注射1×105PBS中的GL261-Fluc-GFP细胞（2μ五十） 使用30号注射器（美国汉密尔顿701RN型）和以下坐标：外侧2.0 mm，前角0.5 mm，距颅面2.5 mm。
生物发光和NIRF成像。
Xenogen IVIS光谱成像系统（美国PerkinElmer）用于生物发光和NIRF成像。小鼠腹腔注射D-荧光素（100μ克/克体重），然后转移到成像室。注射荧光素后10分钟进行成像。使用Living Image软件（PerkinElmer）量化信号强度。对于生物分布研究，Cy5.5标记EV或RGD-EV（100μg） PBS中（200μ五十） RT（5-Gy）后72小时通过尾静脉给药，并注射PBS作为对照。20小时后，将小鼠麻醉并处死。解剖大脑、心脏、肺、肝、脾和肾，并将其固定在4%多聚甲醛中。使用IVIS系统和活体图像软件捕获解剖器官中的Cy5.5荧光信号，以区分与Cy5.5相关的荧光信号和自发荧光信号。
免疫荧光染色和共焦成像。
为了研究脑内EV的细胞定位，用tdTomato标记的EV、scr-EV或RGD-EV（100μg） ●●●●。6小时后，用PBS（25 mL）灌注小鼠，然后用4%的多聚甲醛（25 mL）灌注。大脑被切除，40人冷冻切片μm切片，用0.3%Triton X-100处理，用3%BSA封闭，然后在4°C下用抗PD-L1、抗CD8或抗CD11b（Abcam）染色过夜。然后用PBST（含0.1%Triton X-100的PBS）清洗样品，并在室温下用Alexa 594或Alexa 647-共轭二级抗体（生命科技）孵育。用PBST清洗后，用Hoechst 33342和ProLong防褪色试剂（生命科技）对样品进行染色，并使用FV-1200共焦显微镜对组织切片进行成像（日本奥林巴斯）。图像通过ImageJ软件（NIH）进行处理和分析。所有成像和处理设置保持不变。EV阳性（tdTomato标记）肿瘤细胞（GFP）和CD11b的百分比+每个独立实验从六个随机成像场计算细胞数，并取平均值。
在体内治疗性EVs结合放射治疗的分析。
将10万个GL261-Fluc-GFP细胞立体定向注射到C57BL/6小鼠纹状体。在植入后第7天和第14天，使用生物X射线辐射器（RadSource，美国）将小鼠暴露在单剂量的5-Gy辐射下，在除头部外的身体周围使用铅屏蔽。给小鼠静脉注射PBS或不同的EV制剂（100μ200克所有配方μL PBS）。未经辐射和PBS处理的小鼠作为对照。每周进行一次生物发光成像以监测肿瘤生长，并记录生存率。
流式细胞术分析。
从大脑中采集肿瘤，切成小块，在37°C下用Hank的平衡盐溶液（HBSS；2 mL）消化，补充胶原酶IV（1.5 mg/mL；Life Technologies）和DNase I（200 U/mL；Yeasen Biotechnology，China），每10分钟移液一次样品。单细胞悬浮液是通过使用70μm细胞过滤器（BD Biosciences，美国）。然后将细胞重新悬浮在30%Percoll（Sigma-Aldrich）中以去除髓磷脂。在室温下用红细胞裂解缓冲液（1.5 mL；Biolegend）裂解红细胞2 min。为了进行细胞因子分析，在添加Brefeldin A（5μg/mL；生物传奇）和莫能菌素（2μM；生物传奇）。PMA（0.25μM；西格玛）和离子霉素（1μg/mL；将Sigma）添加到培养基中以刺激淋巴细胞5 h。用细胞染色缓冲液（Biolegend）清洗细胞并计数。106细胞染色缓冲液中的细胞（100μL） 用TruStainFcX PLUS（0.25μ克；Biolegend）在冰上停留10分钟。然后在冰上用针对不同表面抗原的抗体对细胞染色60分钟。使用LIVE/Dead固定紫死细胞染色试剂盒（Life Technologies）排除死细胞。对于细胞内染色，细胞被Foxp3/转录因子染色缓冲液组（Life Technologies）固定并渗透，然后在渗透缓冲液（Life Technologies）中在冰上染色60分钟以检测细胞内蛋白。用渗透缓冲液清洗后，用FACSVerse流式细胞仪（BD Biosciences）分析细胞。每组收集3000个细胞用于分析CD8中的细胞因子+T细胞，而每个组的10000个细胞用于所有其他分析。以下抗体购自Biolegend：抗CD45 PE/Cy7、抗CD11b APC、抗CD3 APC、抗CD8 PerCP/Cy5.5、抗PD-L1 PE、抗IFN-γPE，抗肿瘤坏死因子-αPE、抗颗粒酶B PE、抗Ly6G APC/Cy7和抗Ly6C BV510。抗Ki67 PE来自Life Technologies。
葡萄糖活性测定。
样品制备和Gluc活性测量的方案已经过描述。30简单地说，用PBS经心灌注后从小鼠体内获取器官。然后将100 mg的每个器官均质化，20μL的器官裂解物用PBS稀释，并分三份电镀到白色96孔发光计板中。Gluc活性由GloMax光度计（Promega）测量，自动注射50μL为50 ng/mL的柯仑特拉嗪（Nanolight，U.S.A.），随后进行10 S的光计数。每个器官的总RLU（相对发光单位）计算如下，并调整为基线信号：（RLU/20μ五十） ×（500μL裂解缓冲液/100 mg器官）×（器官重量，mg）。
统计分析。
数据表示为至少四个独立实验的平均值±SEM(n个值包含在每个地物图例中）。从每个独立实验中收集三个技术复制品，以说明样品中的可变性。使用GraphPad Prism软件（美国GraphPad-Sofware）完成统计分析。两组之间的比较由Student’st吨-测试。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验确定多组间的显著性。A类P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。使用Kaplan–Meier曲线和log-rank（Mantel–Cox）检验分析生存率。
致谢
这项工作得到了NIH/NCI P01CA069246（给B.a.T.、E.a.C.和R.W.）、NIH/NINDS R21NS111922（给B.a.T.）和国家自然科学基金会81972364（给T.T.）的资助。我们感谢Semer Maksoud博士（MGH）对手稿的批判性阅读。
参与者信息
田田，美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129；南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166。
梁汝瑜，南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166。
古尔萨·埃雷尔·阿克巴巴，美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129；土耳其伊兹密尔·卡蒂普·塞莱比大学药学系药物生物技术系，伊兹密尔35620。
洛伦佐·萨阿德，美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129。
皮埃尔·奥贝德，黎巴嫩的黎波里Deir El-Balamand巴拉曼德大学化学系。
高军，南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室神经生物学系，江苏南京，211166。
E.安东尼奥·乔卡，美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院百翰女子医院神经外科，邮编：02115。
拉尔夫·魏斯勒，系统生物学中心，马萨诸塞州总医院，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞州02129，美国。
Bakhos A.Tannous，美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经肿瘤科神经内科实验治疗学和分子成像室，邮编：02129。
参考文献
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