氧化还原信号诱导的可逆二硫键形成介导酵母Yap1p核输出信号的调控

质粒构建。

表中列出了本研究中用于表达Yap1p的质粒​表1。1所有使用的GFP-Yap1p表达质粒（pRS cp-GFP HA）均基于pRS cp-GFP HA YAP1构建(17). 为了构建pRS cp-GFP HA yap1 3Cys，如前所述，通过两步PCR程序引入C303T、C310T和C315T的突变(18). 使用pUC-YAP1-3进行PCR a(15)作为带有引物3Cys（+），5′-GTT TCG GAG TTT的模板自动控制T TCG AAA ATG AAC CAG GTA公司ACA公司GGA ACA AGG CAA自动控制T CCC ATT CCC AAG-3′和YAP1 C项，5′-GGCGAAAGGCGAAGCT-3′（取代核苷酸斜体化）。反应b使用引物YAP1–1042，5′-AGTGACGCTACTCC-3′和Cys303（−），5′-TTT CGA A进行燃气轮机AAA CTC CGA AAC TTG TTC 3′。对具有重叠序列的PCRs a和b的产物进行纯化，并进行无引物的第二次PCR。用酶消化得到的片段Nde公司我和英国标准时间XI并克隆到pUC-YAP1-3中，然后克隆到732-bp英国标准时间将所得质粒的XI-AflIII片段克隆到pRS cp-GFP HA YAP1中。为了生成细菌表达质粒pGEX-GFP-c-CRD生态RV汽车-门I片段包含GFP536型(27)和孟我-萨尔I片段包含c-CRD公司从pAS1-GFP-CRD中分离(19)在钝头之间结扎生态RI站点和萨尔pGEX-6P-2的I位点（Amersham Pharmacia）。为了构建pGEX-ΔGFP-c-CRDGFP公司pGEX-GFP-c-CRD的区域被钝端的自我训练删除巴姆HI和门I站点。为了构建pRS GFP-c-CRD，首先通过删除pRS cp-GFP HA YAP1生成pRS cp-HA B-SGFP公司和YAP1公司序列并插入ADH1（ADH1）如前所述的终止器(19). 该载体的血凝素（HA）标签区域的编码序列如下：截断组成CUP1大学启动子，5′-CTGCAG GAATTC CCCT GCC ATG TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGCTAA-3′(ADH1（ADH1）终止器。然后巴姆含有HI SalI片段GFP-c-CRD公司从pGEX-GFP-c-CRD中分离出来的巴姆HI和萨尔pRS cp-HA B-S.A的Ic-CRD公司突变片段[c-CRD^{（周转时间）}]其中所有半胱氨酸残基突变（C598T、C620A和C629T）被导入pRS GFP-c-CRD，如下所示：Nco公司我-萨尔I片段包含c-CRD公司^{（周转时间）}区域和a门我-英国标准普尔的HI片段GFP536型使用pRS cp-GFP HA yap1 cm46A5和GFP536型分别用于模板，如前所述(18)、和是在门我和萨尔pRS GFP-c-CRD的I位点。

共焦激光扫描显微镜和蛋白质印迹。

如前所述，进行共焦激光扫描显微镜和蛋白质印迹分析(18). 在三甘氨酸缓冲液中用SDS-PAGE分离酵母细胞裂解物(25)或通过SDS–16.5%Tris-Tricine PAGE(26)转移至聚二氟乙烯膜（Immobilon；Millipore），并使用抗HA大鼠单克隆抗体（高亲和力；Roche）或抗Trx2p兔抗体进行免疫印迹(13)与过氧化物酶偶联第二抗体（Dako）反应，并使用增强化学发光和增强化学发光超薄膜（Amersham Pharmacia）进行检测。

蛋白质表达和分析。

表达重组c-CRD蛋白，呈指数增长大肠杆菌用0.5 mM异丙基β-d日-37°C下，吡喃半乳糖苷（IPTG）3小时。按照制造商（Amersham Pharmacia）的建议，在谷胱甘肽-Sepharose柱上结合PreSession蛋白酶纯化重组c-CRD蛋白。如前所述执行His-tagged Trx2p表达(13). 使用VIVA SPIN（VIVA Science）将纯化的重组蛋白脱盐至10 mM Tris-HCl（pH 7.4），然后存储在−80°C。出于技术原因，GFP-c-CRD(M（M）_第页，36000）用于质谱（MS），ΔGFP-c-CRD(M（M）_第页，14400），其中大部分GFP区域被删除，用于肽分析和硫氧还蛋白依赖性还原实验。

肽分析和质谱。

用1 mM H培养5毫克重组c-CRD（ΔGFP-c-CRD）₂O（运行）₂或2 mM二胺在30°C下20分钟，在37°C下用赖氨酰内肽酶（Sigma）消化2小时，然后用SDS–16.5%Tris-Tricine PAGE分离。如上文所述氧化和消化部分（2.8μg）重组c-CRD（GFP-c-CRD）融合蛋白，然后使用含有1%2,5-二羟基苯甲酸、0.1%5-甲氧基水杨酸、10%乙腈和0.1%三氟乙酸的基质溶液通过质谱（KOMPACT MALDI III plus；岛津/奎托斯）进行分析。

硫氧还蛋白还原氧化c-CRD和体外检测游离硫醇。

对试剂的所有缓冲液和水进行脱气，并在氮气下进行反应。蛋白质的数量通过280 nm处的吸光度进行估算（系数为1A类₂₈₀=1.429微克）。首先用凝血酶蛋白酶（Amersham Pharmacia）消化His-Trx2p以去除His标签，然后使用SMART系统在miniQ柱（Amersham Pharmacia/）上进一步纯化亲和纯化的重组c-CRD和His-Tr x2p。在室温下用5 mM二硫苏糖醇（DTT）处理峰值部分中的蛋白质（30μg）30分钟，并通过快速脱盐柱（Amersham Pharmacia）在10 mM Tris-HCl（pH 7.5）-1 mM EDTA（TE）中去除DTT。然后用二酰胺（2mM）或H处理6μg还原的重组c-CRD（ΔGFP-c-CRD）蛋白₂O（运行）₂（0.2 mM或1.0 mM）于50μl TE中在室温下放置30分钟，并通过快速脱盐柱纯化。将还原的Trx2p（0.25μg）与约等量（通过考马斯染色估计）的氧化重组c-CRD在8μl TE中在室温下反应30分钟。在TE中添加2.5μl 50 mM 4-乙酰氨基-4′-马来酰二苯乙烯-2,2′-二磺酸（AMS；分子探针）后，在30°C下进行进一步反应30 min，然后将SDS添加到0.5%的浓度，并在37°C下继续培养10 min。添加5μl 4×样品缓冲液（200 mM Tris-HCl，pH 6.8，8%SDS，40%甘油和0.4%溴酚蓝）后，对样品进行SDS–15%PAGE（12×12cm）。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。

通过IAA/AMS分析在体内检测二硫化物。

携带pRS GFP-c-CRD的菌株TW的酵母细胞在SD脱落Trp-Ura培养基中培养至指数期，并按指示施加氧化应激。为了在体内检测硫醇，在前面描述的方法的基础上，使用了碘乙酰胺（IAA）和AMS的组合(14). 在指定的时间，将IAA以最终浓度100 mM添加到培养物中。培养2分钟后，将细胞固定在10%冰上三氯乙酸中30分钟。然后用10%三氯乙酸清洗细胞五次，然后用TE（100:10）（100 mM Tris-HCl，pH 9.5和10 mM EDTA）清洗细胞。然后用含有10 mM DTT的TE（100:10）中的玻璃珠破坏细胞，并用0.5%SDS溶解。蛋白质浓度通过Bradford试验（Bio-Rad）测定。将30微克蛋白质放入10μl TE（100:10）–10 mM DTT中，在44°C下培养1小时，然后在30°C下与10μl 50 mM AMS（在TE中）培养30分钟，在37°C下培育15分钟。添加10μl 4×SDS样品缓冲液后，一半样品进行SDS–10%PAGE（12×8 cm或15×13 cm）检测HA-GFP-c-CRD，另一半用16.5%Tris-Tricine PAGE（12×8cm）检测硫氧还蛋白。为了分析分子间二硫键与其他分子发生分子量转移的可能性，在不使用DTT的情况下制备裂解液，并用SDS-10%PAGE进行分离。

赛斯⁵⁹⁸Yap1p对H的响应要求₂O（运行）₂.

为了研究每种半胱氨酸的重要性，我们研究了Yap1p c-CRD半胱氨酸残基上氨基酸取代对H的影响₂O（运行）₂-诱导的trx2-lacZ型报告基因激活和Yap1p的核定位。我们之前已经展示了Yap1p^c598吨，Yap1p^C620A型和Yap1p^C629T型能对二胺产生反应；也就是说，诱导了核定位和报告基因激活(18). 有趣的是，H₂O（运行）₂-当C598T取代（GFP-Yap1p^C598吨)，C629T替代（GFP-Yap1p^c629吨)或所有3个残基的替代物[GFP-Yap1p^{（周转时间）}]引入了，而H₂O（运行）₂仍能诱导GFP-Yap1p的活性^C620A型（图。​（图2A）。2A） ●●●●。与这些结果一致，H₂O（运行）₂-在氧化应激过程中（1至60分钟），诱导的核定位被C598T、C629T或3-残基取代抑制（数据未显示）。此外，更强的H₂O（运行）₂应力（2和3 mM）也未能诱导Yap1p的核定位^C598吨（未显示数据）。因此，我们接下来测试了氧化环境对硫氧还蛋白缺乏细胞的影响(trx1Δtrx2Δ). 正如之前在Yap1p中观察到的那样^重量(13)，Yap1p^C620A型和Yap1p^C629T型定位于细胞核。然而，Yap1p^C598吨和Yap1p^{（周转时间）}仍在细胞质中（图。​（图2B）。2B） ●●●●。有趣的是，H引起的氧化应激₂O（运行）₂（0.5和1.0mM）或二酰胺（1.5mM），Yap1p的核定位^C598吨诱导于trx1Δtrx2Δ细胞而不是Yap1p的细胞^{（周转时间）}（图。​（图2C）。2C） ●●●●。这些结果支持Cys的观点⁵⁹⁸Yap1p至H的最大灵敏度需要₂O（运行）₂.

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图2

c-CRD中半胱氨酸残基对H反应的要求₂O（运行）₂.（A）应变TW(yap1 trx2-lacZ)表达GFP融合Yap1p的细胞^重量，Yap1p^C598吨，Yap1p^C620A型，Yap1p^C629T型，或Yap1p^{（周转时间）}未治疗（−）或用H治疗₂O（运行）₂（0.5 mM）或二胺（1.5 mM）60分钟，报告基因(trx2-lacZ型)如前所述，通过β-半乳糖苷酶试验观察到活化(18). 指出了三份样品的平均值和标准误差。（B） 抑制Yap1p的构成核定位trx1Δtrx2Δ细胞通过C598T替代。这个trx1Δtrx2Δ表达GFP融合Yap1p的细胞^重量，Yap1p^C598吨，Yap1p^C620A型，Yap1p^C629T型，或Yap1p^{（周转时间）}共聚焦显微镜观察。（C） Yap1p的核定位^C598吨在里面trx1Δtrx2Δ用H处理的细胞₂O（运行）₂或二胺。表达GFP-Yap1p的细胞^C598吨在无应力（−）或0.5 mM H的应力下生长30分钟₂O（运行）₂，1.0 mM高₂O（运行）₂或2 mM二胺，并通过共焦显微镜进行检查。在面板B和C中，显示了荧光（上部行）和透射（下部行）图像。

体内c-CRD半胱氨酸残基氧化与诱导核定位的相关性。

接下来，我们使用IAA和硫醇反应探针AMS（分子量，536）在体内检测了c-CRD半胱氨酸的氧化状态，如材料和方法中所述。在本实验中，首先通过在培养物中直接添加IAA使游离硫醇（还原半胱氨酸）烷基化，以防止在制备酵母裂解物期间人工氧化，并通过AMS的分子量移位观察预先存在的二硫键。为了观察c-CRD中的小分子量变化，使用HA-GFP-c-CRD表达细胞。在对照实验中，当细胞未经IAA处理时，我们检测到一个较高分子量的条带；在这种情况下，所有半胱氨酸与AMS反应产生分子量偏移（图。​（图3A，三A、 车道1）。相反，3-半胱氨酸取代突变体c-CRD的迁移率^{（周转时间）}不受IAA治疗的影响（图。​（图3A，三A、 比较通道3和4），表明通道1和通道3受试者之间明显的分子量差异是由c-CRD中半胱氨酸硫醇的AMS修饰引起的。与c-CRD相比^{（周转时间）}c-CRD显示了更宽的频带（图。​（图3A，三A、 比较泳道2和3），表明c-CRD中的半胱氨酸在非应力正常条件下被部分氧化。

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图3

体内c-CRD氧化与Yap1p核定位的相关性。（A） c-CRD中的半胱氨酸残基在无应激条件下在体内减少。台湾(yap1)携带pRS HA GFP-c-CRD（通道1和2）或pRS HA-GFP-c-CRD的细胞^（TAT）（通道3和通道4）培养至指数期，并使用AMS（使用或不使用IAA预处理）分析游离和氧化硫醇，如材料和方法中所述。使用八厘米SDS-PAGE凝胶。（B） c-CRD中半胱氨酸残基对H的时间依赖性氧化₂O（运行）₂（0.5 mM）或直径（1.5 mM）。在施加氧化应激或无应激（−；车道1和7）后的指定时间（min），按照面板A所述对游离和氧化硫醇进行分析。使用了三十厘米的SDS-PAGE凝胶。箭头，AMS处理后还原（红色）和氧化（Ox）形式的迁移。（C） Yap1p对H的时间依赖性核累积₂O（运行）₂或二胺。台湾(亚1)携带pRS-HA-GFP-YAP1的细胞培养至指数期，收集并重新悬浮在含有0.5 mM H的培养基中₂O（运行）₂或1.5 mM直径。在氧化剂处理（−）之前和指示的处理时间（min）之后，通过共焦显微镜观察GFP荧光。氧化剂处理15分钟后，收集细胞，清洗，并将其重新悬浮在不含氧化剂的相同培养基中，5（w5）和10（w10）分钟后观察到GFP荧光。

然后，我们检测了体内氧化应激对c-CRD半胱氨酸残基氧化的影响。有趣的是，c-CRD中的半胱氨酸残基在H处理1分钟后被氧化₂O（运行）₂（图。​（图3B，三B、 比较车道1和2，+AMS）；然而，它在5分钟内减少，并在30分钟内保持减少（图。​（图3B，三B、 比较+AMS的车道2和3至5）。在二胺处理的情况下，c-CRD在1分钟时被氧化（图。​（图3B，三B、 +AMS的第8车道），并持续氧化30分钟（图。​（图3B，三B、 车道8至11）。H的分子量偏移₂O（运行）₂小于完全氧化对照组（图。​（图3B，三B、 比较+AMS的车道2和6）。然而，在用二胺处理30分钟后，一部分c-CRD迁移到完全氧化的位置（图。​（图3B，三B、 比较+AMS的通道8和6或12）。需要注意的是，在diamide处理1分钟的时间点出现的谱带明显丰度降低（图。​（图3B，三B、 8号车道；比较+AMS和−AMS）。我们推测，在游离巯基水平预计较高的样品中，如IAA未固定的对照样品（图。​（图3B，三B、 车道6和12）。

为了测试这一氧化过程是否与全长Yap1p的诱导核定位相关，我们观察了二胺诱导和H₂O（运行）₂-诱导GFP-Yap1p的核积累。如图所示。​图3C，三C、 用0.5 mM H处理细胞₂O（运行）₂，Yap1p的核积累在1分钟内开始（即，当c-CRD开始氧化时，见上文），其最大水平的积累在5分钟内完成。类似地，二酰胺诱导的Yap1p核定位在1分钟内开始（图。​（图3C）。三C） ●●●●。这些结果清楚地表明，氧化应激诱导的Yap1p核定位与c-CRD中半胱氨酸残基的诱导氧化相关。

接下来，我们研究了当细胞从应激中释放时Yap1p定位的恢复。用0.5 mM H处理后₂O（运行）₂或1.5 mM二胺15分钟后，将细胞清洗并在相同的培养基中无应激培养。积聚在细胞核中的大部分Yap1p在5分钟内扩散到细胞质，10分钟后重新定位完成（图。​（图3三C） ●●●●。

n-CRD中半胱氨酸残基对延长核定位的需求。

在H中₂O（运行）₂-诱导反应-体内氧化的c-CRD随后在孵育5分钟后降低，但Yap1p仍留在细胞核中（见上文）。因此，我们怀疑在HA-GFP-c-CRD蛋白的背景下缺乏n-CRD（图。​（图1A），1A） ，可能会影响响应。事实上，有人认为n-CRD可以指导Yap1p的核定位(6,7). 如图所示。​图4A，4A、 当n-CRD中的所有3个半胱氨酸残基（Cys³⁰³，塞浦路斯³¹⁰、和Cys³¹⁵)（图。​（图1A）1A） 突变为苏氨酸（GFP-Yap1p^3个月)，的trx-lacZ公司报告基因的激活度在二胺作用下略有下降；然而，它几乎完全被抑制以响应H₂O（运行）₂（图。​（图4A）。4A） ●●●●。接下来我们观察了H的时间依赖性₂O（运行）₂-诱导核定位（图。​（图4B）。4B） ●●●●。与Yap1p相同^重量，H₂O（运行）₂可以诱导Yap1p的核定位^3个星期然而，有趣的是，尽管H持续存在，但它在15分钟内扩散到细胞质₂O（运行）₂强调。相反，Yap1p的二胺诱导核定位^3个月与Yap1p相似^重量（图。​（图3C）。三C） ●●●●。也就是说，核定位在1分钟内被诱导并持续。此外，当细胞从应激中释放出来时，Yap1p^3个月在5分钟内扩散到细胞质中。此外，Yap1p^3个月于年定位于细胞核trx1Δtrx2Δ细胞（数据未显示），表明n-CRD中的半胱氨酸残基在本构氧化状态下不需要进行核定位。接下来，我们将讨论Cys的重要性⁶²⁰通过突变Yap1p中的残基^3个月突变体。如图所示。​图4C，4C、 Yap1p无核定位^3Cys，C620A响应H₂O（运行）₂在抑制氧化应激后60分钟内观察到Cys⁶²⁰是Yap1p背景下瞬态核定位所必需的^3个月（见上文）。有趣的是，Yap1p的核定位^3Cys，C620A在H后70分钟观察到₂O（运行）₂这表明Yap1p突变体对H的敏感性较低₂O（运行）₂.

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图4

Yap1p n-CRD中半胱氨酸残基对H后延长核定位的需求₂O（运行）₂治疗，但不使用二胺治疗。（A） 报告基因(trx2-lacZ型)Yap1p激活^3个月如图图例所示。​图2。2（B）GFP-Yap1的时间依赖性定位^3个月.菌株TW(yap1)表达GFP-Yap1^3个月用0.5 mM H处理₂O（运行）₂或1.5 mM二胺，并且在氧化剂处理（−）之前和指示的处理时间（min）观察到GFP荧光，如图图例所示。​图3。三按照图例至图所示进行了二胺处理和应力释放。​图3。三（C）GFP-Yap1p的时间依赖性定位^3Cys，C620A响应0.5 mM H₂O（运行）₂如上所述进行观察。

氧化应激反应中硫氧还蛋白和谷胱甘肽的细胞氧化还原状态。

c-CRD中半胱氨酸残基氧化的一种可能机制是间接的：氧化剂改变细胞氧化还原状态可能会触发c-CRD内二硫键的形成。硫氧还蛋白是抑制Yap1p核定位的关键因素(13); 此外，最近有研究表明，Yap1p在硫氧还蛋白还原酶缺乏的突变体中被组成性激活(变压器1) (4; S.Izawa和Y.Inoue，未发表的观察）。在这种突变体中，大多数Trx将以氧化形式存在。因此，我们推测H的添加₂O（运行）₂或者二酰胺可能首先导致Trx的氧化，然后导致c-CRD中形成二硫键。因此，我们评估了硫氧还蛋白的硫二硫比率（氧化还原状态）是如何受到H诱导的氧化应激的影响的₂O（运行）₂或二胺。图。​图3B三在SDS-PAGE中分离B，并用抗Trx2p抗体进行Western blot，该抗体可识别Trx1p和Trx2p(13). 如图所示。​图5A，5A、 添加H后硫氧还蛋白保持还原1分钟₂O（运行）₂（图。​（图5A，5A、 车道1和2）。氧化硫氧还蛋白在5分钟时出现，30分钟后增加到总量的一半左右（图。​（图5A，5A、 车道3至5）。值得注意的是，当硫氧还蛋白开始被氧化时（5分钟），在1分钟时间点被氧化的c-CRD正在减少（对比图。​图3B，三B、 +AMS的车道3，以及图。​图5A，5A、 车道3）。相反，1.5 mM的二胺不会影响硫氧还蛋白的氧化还原状态（图。​（图3B，三B、 车道7至11）。这些数据清楚地表明，当c-CRD被H氧化时₂O（运行）₂而二酰胺，硫氧还蛋白仍被还原。

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图5

硫氧还蛋白和谷胱甘肽的氧化还原状态。（A） 硫氧还蛋白对H的时间依赖性氧化检测₂O（运行）₂（0.5 mM）或直径（1.5 mM）。在图的实验中，分析了相同的酵母裂解液中的游离硫醇和氧化硫醇。​图3B三B通过SDS–16.5%Tris-Tricine PAGE分离(26)，并且硫氧还蛋白（Trx1p和Trx2p）通过使用如材料和方法中所述的抗Trx2p抗体的蛋白质印迹分析来检测。如图图例所示，准备完全氧化位置的控件。​图3。三箭头表示氧化（Ox）和还原（红色）c-CRD的相应位置。中间带的位置可能对应于Trx，其中1个半胱氨酸与1个AMS反应。酵母Trx蛋白的活性中心只有2个半胱氨酸残基，它们以氧化形式形成二硫键。因此，至少中间带不太可能是氧化形式。（B到D）氧化应激反应中的谷胱甘肽氧化还原状态。在TY菌株中观察到GSH和GSSG(YAP1公司)添加0.5 mM H后0、3、7、12、22、42、62和92 min₂O（运行）₂（B） 以及材料和方法中所述的1.5或0.5 mM直径（C）。谷胱甘肽的氧化还原状态表示为GSH的比率²至GSSG。（D） 应变TY(YAP1公司)用1.5mM二酰胺处理在SD脱落培养基中培养的12分钟，用0.85%NaCl洗涤，并重悬于相同的培养基中。在氧化应激释放后3、7和12分钟，观察到GSH和GSSG。箭头表示氧化应激释放的时间。

接下来，我们讨论了c-CRD氧化是否会对H引起的氧化应激作出反应的问题₂O（运行）₂或二胺通过谷胱甘肽氧化还原状态的改变发生。研究表明，用0.2 mM h处理1h后，还原型与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比率不受影响₂O（运行）₂(12). 我们测试了突然氧化应激对谷胱甘肽氧化还原状态的影响。如图所示。​图5B，5B、 GSH²/添加0.5 mM H后，GSSG比率在3到22分钟内没有变化₂O（运行）₂（图。​（图5B），5B） 表明谷胱甘肽氧化还原状态的改变不太可能是H₂O（运行）₂-c-CRD的诱导氧化。相反，二胺确实影响谷胱甘肽的氧化还原状态：在用1.5 mM二胺处理的7分钟内，谷胱甘苷²/在正常情况下，GSSG比率下降至比率的三分之一（图。​（图5C）。5C） ●●●●。当使用较低浓度的二铵（0.5 mM）时，斜率减小（图。​（图5C）。5C） ●●●●。接下来我们测量了谷胱甘肽²/压力恢复期间的GSSG比率。加入二酰胺12分钟后，将细胞洗涤并重悬于缺乏二酰胺和GSH的相同培养基中²/观察GSSG比率。如图所示。​图5D，5D、 我们没有看到谷胱甘肽的增加²/恢复后20分钟内的GSSG比率（图。​（图5D）。5D） ●●●●。如上所述，Yap1p核定位在应力释放后5至10分钟内降低。因此，c-CRD的氧化还原传感不太可能是由二酰胺影响的谷胱甘肽氧化还原状态的变化介导的。

Yap1p作为H的可能传感器₂O（运行）₂和diamide。

我们的结果表明，H₂O（运行）₂虽然细胞对不同氧化剂的反应存在明显差异，但二胺影响细胞的氧化还原状态。H的实施₂O（运行）₂增加氧化硫氧还蛋白的量，但不影响谷胱甘肽（GSH）的氧化还原状态²/GSSG）。硫氧还蛋白的氧化很可能与H的还原相耦合₂O（运行）₂通过硫氧还蛋白过氧化物酶（Tsa1p）(5,24). 然而，与此相反，二胺具有明显相反的效果。也就是说，二胺降低谷胱甘肽²/GSSG比率对硫氧还蛋白无影响。二酰胺能在几秒钟内穿透细胞膜，并在几分钟内在细胞内发生反应(16). 因此，可以进行直接氧化以降低细胞内的GSH水平。出乎意料的是，二胺并不影响硫氧还蛋白的氧化还原状态。GSH和硫氧还蛋白氧化还原缓冲系统显然作为细胞防御系统来应对氧化应激，但它们的氧化还原状态并不是Yap1p激活的直接原因。Yap1p的核积累及其c-CRD的氧化在第一分钟内开始发生，而硫氧还蛋白和谷胱甘肽的氧化还原状态当时没有受到影响。此外，即使谷胱甘肽²/GSSG保持不变。因此，我们推测c-CRD可以直接从氧化剂接收（感测）氧化还原信号，导致Yap1p的核定位和特定基因的激活，以应对氧化还原状态的变化以及由此产生的损伤。

c-CRD中氧化剂特异性二硫键的形成。

使用两种不同的氧化剂H研究了c-CRD的二硫键形成过程₂O（运行）_2,和二酰胺，这两种药物显然都是Yap1p核定位及其转录活性的良好诱导剂（图。​（图2A2A和​和3C）三C）(6,18). 与我们之前的结果一致，Gal4db-GFP-c-CRD可以对二胺产生反应，c-CRD中的半胱氨酸残基负责二胺的反应。n-CRD中的半胱氨酸残基似乎对诱导Yap1p对二胺的核定位没有必要（图。​（图4）。4). c-CRD中有3个半胱氨酸残基（图。​（图1），1)以及c-CRD突变体（Yap1p）的核定位^C598吨，Yap1p^C620A型，或Yap1p^C629T型)对二胺的反应表明Cys之间的二硫键⁵⁹⁸和Cys⁶²⁰，塞浦路斯⁶²⁰和Cys⁶²⁹、和Cys⁵⁹⁸和Cys⁶²⁹可能发生。这种二硫键抑制体内c-CRD与Crm1p的相互作用。值得注意的是，Yap1p诱导的报告β-半乳糖苷酶活性水平^3个星期约为Yap1p的一半（图。​（图4A），4A） ，这表明n-CRD中的半胱氨酸残基可能在Yap1p暴露于氧化剂期间的构成性核定位中起作用，或者n-CRD半胱氨酸残留物可能需要达到最大转录水平。

H氧化过程₂O（运行）₂看起来更复杂。我们的结果表明Cys⁵⁹⁸和Cys⁶²⁹对H的反应至关重要₂O（运行）₂此外，只有Yap1p^C598吨（在Yap1p的半胱氨酸突变体中）在硫氧还蛋白缺乏的氧化状态下不受影响。因此，Cys⁵⁹⁸在c-CRD中似乎是传感H的最关键残留物₂O（运行）₂此外，这些结果表明，c-CRD中半胱氨酸的氧化足以抑制Crm1p相互作用。此外，Cys之间的二硫键⁵⁹⁸和Cys⁶²⁰体外特异性诱导表明，这种二硫键可能是Yap1p的初始氧化。然而，H₂O（运行）₂-Yap1p的诱导核定位^3个月10分钟后减少，未从氧化剂处理中释放，15分钟后蛋白质最终变成细胞质（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这与GFP-c-CRD融合时体内c-CRD快速减少的结果一致（图。​（图3B）。三B） ●●●●。这些结果表明，为了延长核定位时间，需要额外的调控模式。快速诱导的二硫键可能导致n-CRD和Cys中半胱氨酸残基之间随后形成二硫键⁶²⁹或Cys⁵⁹⁸（图。​（图7）。7). 尽管Cys⁶²⁰显然对快速应对H至关重要₂O（运行）₂上下文中的Yap1p^3Cys，C620A（图。​（图4C），4C） ，诱导Yap1p的核定位^C620A型虽然报告者β-半乳糖苷酶活性水平降低（图。​（图2A）。2A） ●●●●。因此，另一种可能性是，n-CRD和c-CRD之间的直接二硫键在H₂O（运行）₂Cys之间可能的二硫键³⁰³和Cys⁵⁹⁸在SDS-PAGE上显示更快的迁移率，似乎不足以抑制Yap1p-Crm1p相互作用(7)这表明反应需要多次氧化事件。Yap1p的更精确分析^重量需要使用质谱来了解Yap1p所有6个半胱氨酸残基的相互作用。

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图7

Yap1p CRD氧化还原调节模型。H（H）₂O（运行）₂或二酰胺诱导二硫键的形成，导致c-CRD-Crm1p相互作用的解离，从而导致Yap1p的核积累。核定位Yap1p导致靶基因的转录激活，例如TRX2型，编码硫氧还蛋白(17,21);TRR1号机组，编码硫氧还蛋白还原酶(21);GSH1型，编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(31); 和GLR1级，编码谷胱甘肽还原酶(9,23). 表达增加GSH1型和GLR1级将提高GSH水平，同时增加TRX2型和TRR1号机组将升高还原硫氧还蛋白（Trx^红色)级别。硫氧还蛋白可以还原Yap1p二硫键。

我们感谢Gigi Storz（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）在编写手稿时提供的宝贵建议和指导。我们感谢Masato Kobori和Ryuta Mizutani（东京大学药物科学研究生院）为MALDI-TOF（MS）提供技术援助，感谢IMSUT人类基因组中心提供计算机系统和互联网服务，感谢Gigi Storz和Orna Carmel-Harel交换未公开信息。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究资助（C）的支持。