生长因子通过影响葡萄糖代谢影响细胞生长和存活

细胞大小和细胞周期分析。

使用Coulter Z2颗粒分析仪获得细胞计数和细胞大小数据。通过在3.8 mM柠檬酸钠–0.125 mg RNase A/ml–0.01 mg碘化丙啶/ml中重新悬浮细胞颗粒，并使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）分析样品，获得乙醇固定细胞的细胞周期曲线。使用Flowjo DNA分析平台（Tree Star）测定细胞周期统计数据。为了测量溴脱氧尿苷（BrdU）掺入率，将细胞培养在添加10μM BrdU（Sigma）的培养基中。在不同的时间，细胞被固定在冰镇75%乙醇中。根据制造商的方案，用小鼠抗BrdU和山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗体（Pharmingen）对细胞进行染色。将样品洗涤并重新悬浮在含有10μg碘化丙啶/ml的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过流式细胞仪进行分析。为了测量细胞周期不同阶段的细胞大小，将细胞沉淀并重悬于含有10μg Hoechst 33342（Molecular Probes）/ml的PBS中。在37°C下孵育30分钟后，用LSR流式细胞仪（Becton Dickinson）分析细胞。G公司₁、S和G₂绘制闸门，并三次测定每个闸门内的平均前向散射。

耗氧量的测量。

用呼吸计测量细胞耗氧量，该呼吸计由一个水套式（37°C）厌氧室（2 ml体积）组成，该厌氧室配有一个极谱氧电极，如前所述(20). 电极在使用前立即用含有已知氧气张力的增湿气体混合物进行校准。呼吸计内的磁力搅拌器使细胞保持悬浮状态。呼吸计在功能上是密封的，因此随着细胞消耗溶解氧，混合物的氧张力随时间线性下降。需要时，羰基氰化物第页-将（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma）以5μM的浓度直接添加到呼吸计中的细胞中。

NADH的测量。

FL5.12细胞在存在或不存在IL-3的情况下培养12小时，在Krebs缓冲液（115 mM NaCl、2 mM KCl、25 mM NaHCO）中洗涤_三，1 mM氯化镁₂，2 mM氯化钙₂，0.25%牛血清白蛋白[pH7.4]；用5%CO平衡₂)，并再次悬浮在Krebs缓冲液中–10 mM葡萄糖。NADH荧光用荧光2分光光度计（Jobin-Yvon-Spex）测量，其激发波长为340±2.5 nm，检测波长为461±2.5 nm。在向比色皿中加入5μM FCCP前后测量400 s的荧光。鱼藤酮治疗逆转FCCP介导的NADH下降的能力证实了FCCP降低线粒体NADH的能力。

糖酵解测定。

通过监测5-^三H-葡萄糖至^三H（H）₂O、 如前所述(14). 简单地说，10⁶细胞在PBS中清洗一次，然后再悬浮在1ml Krebs缓冲液中，并在37°C下培养30分钟。然后将细胞制成颗粒，重新悬浮在含有葡萄糖的0.5 ml Krebs缓冲液中（如果未指定，则为10 mM），并加入5μCi的10μCi-^三H-葡萄糖。在37°C下培养1 h后，将三份50μl等分样品转移到含有50μl 0.2 N HCl的无盖PCR试管中，并将试管转移到含有0.5 ml h的闪烁瓶中₂O使小瓶中的水和PCR管中的内容物不允许混合。将小瓶密封，并允许扩散至少24小时。扩散和未扩散的量^三H通过闪烁计数测定。适当的^三仅含H-葡萄糖和^三H（H）₂仅包括O型控制，可计算^三H（H）₂如前所述，每个样品中的O以及糖酵解速率(1).

线粒体膜电位。

细胞在含有0.02 mM葡萄糖或缺乏IL-3的完全培养基中培养6 h。将最终浓度为200 nM的四甲基罗丹明乙酯（TMRE）添加到细胞中，并在37°C下再培养细胞30分钟。流式细胞术检测TMRE荧光。

细胞色素c（c）再分布和Bax活化。

使用抗细胞色素进行亚细胞分馏和蛋白质印迹c（c）单克隆抗体7H8.2C12（Pharmingen）和抗细胞色素氧化酶亚基IV单克隆抗体20E8-C12（Molecular Probes，俄勒冈州尤金市），如前所述(23). 通过向纯化的线粒体中加入2%3-[（3-氯氨基丙基）-二甲氨基]-1-丙磺酸酯（CHAPS），并用构象敏感抗体N20（Santa Cruz）从所得裂解物中免疫沉淀Bax，然后进行N20免疫印迹来评估Bax构象(10).

生长因子浓度较高的细胞在退出生长因子后更容易死亡。

有人提出生长因子通过抑制先天性细胞死亡程序来促进细胞存活(16). 这一观点表明，低水平生长因子培养的细胞中的凋亡程序应受到较少的抑制，使细胞对生长因子的撤回更敏感。然而，与生长因子水平较高的细胞相比，持续培养的低水平生长因子细胞对生长因子撤除后的死亡不太敏感（图。​（图4A）。4A） ●●●●。此外，生长因子浓度的急性变化会导致细胞死亡，即使当生长因子浓度逐渐降低时，剩余的生长因子足以维持细胞生长和存活（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这一结果表明，细胞对存在的生长因子数量的突然变化很敏感，而不仅仅是对可用生长因子的绝对浓度。

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图4

使用大量生长因子培养的细胞在退出生长因子后更容易发生细胞死亡。（A） 从生长因子中提取含有指定量IL-3的培养细胞，并使用流式细胞术通过碘化丙啶排除法测定细胞活力。显示了随时间推移提取生长因子后的平均存活率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 在补充了指定数量的IL-3（从：中提取）的培养基中生长的细胞被清洗，并直接切换到含有指定数量IL-3（到：）的培养液中（−IL-3表示没有IL-3）。显示生长因子限制48小时后的平均细胞存活率（和SEM）。

据报道，生长因子信号调节G细胞的生长和存活₀/G公司₁细胞周期的阶段，一旦超过G₁阶段，细胞进行一轮分裂，不再依赖生长因子的存在来维持生存，直到重新进入G₀/G公司₁(8,15). 这些概念表明，在暴露于较少生长因子的细胞中，撤回生长因子后的细胞死亡率可能较低，因为它们的循环速度较慢。然而，即使在生长因子浓度最低的培养基中，基本上所有细胞都在24小时内完成一个周期（图。​（图2C）。2C） ●●●●。此外，生长因子浓度最低的培养物的G细胞比例最高₀/G公司₁这表明细胞周期位置本身并不能决定细胞死亡的易感性（图。​（图2B）。2B） ●●●●。提取生长因子24小时后的细胞周期分析表明，>95%的细胞在G₀/G公司₁，与剥夺培养基中的起始生长因子浓度无关（数据未显示）。尽管有此发现，但在低浓度IL-3下生长的细胞在48小时及以后仍有显著百分比存活，而在高浓度IL-3条件下生长的电池则死亡。因此，在不同浓度的生长因子中培养的细胞之间细胞周期位置的差异不足以解释其在退出生长因子后对死亡的不同敏感性。

停药后糖酵解速度下降会影响线粒体。

线粒体生理学的改变被认为是生长因子退出后死亡的关键事件。提取生长因子12小时后的耗氧量测量表明耗氧量减少，表明电子传递减少（图。​（图5A）。5A） ●●●●。为了确定电子传输是否受到底物的限制，在存在原藻体FCCP的情况下测量了存在和不存在生长因子时的耗氧速率。FCCP作用于从ATP合成中解偶联电子传输，因此电子传输速率受到底物可用性的限制。提取生长因子后，FCCP存在下的耗氧量减少，表明提取生长因子之后线粒体在底物中的功能受到限制。耗氧量的降低并不是由于细胞色素的重新分布c（c），此时仍保留在线粒体内（图。​（图5B）。5B） ●●●●。

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图5

生长因子退出后，线粒体的底物可用性受到限制。（A） 测量在有（+IL-3）或无（−IL-3）IL-3的情况下培养12 h的细胞的耗氧量，并在（+FCCP）添加原核细胞FCCP前后测量耗氧量。FCCP破坏线粒体内膜上的质子梯度，使氧气消耗仅受底物可用性的限制。显示了在上述每个条件下的平均耗氧量（和平均值[SEM]的标准误差）。dPO公司₂/dt，氧张力的变化除以时间的变化。（B） 在缺乏IL-3的情况下培养12 h的细胞被分为线粒体（M）和细胞溶质（S）组分。对馏分进行细胞色素检测c（c）或细胞色素氧化酶IV作为细胞分级的对照。（C） 在添加FCCP前后，使用完整的细胞进行NADH荧光测量。绘制了添加FCCP前后平均稳态荧光值（和SEM）之间的差异。

与退出IL-3后线粒体底物的减少一致，在退出IL-3 12 h的细胞中测量细胞总NADH水平显示，其降低至正常水平的68%（数据未显示）。为了测量线粒体NADH氧化酶（复合物I）可用的NADH量，在添加FCCP前后测量细胞NADH水平。FCCP的加入使线粒体去极化，并允许复合物I氧化可用的NADH储存。在提取生长因子12小时后，FL5.12细胞含有IL-3生长细胞中复合物I可用的NADH的一半（图。​（图5C）。5C） ●●●●。综上所述，这些数据表明，在提取生长因子后，线粒体呼吸所需的底物受到限制。

糖酵解的最终产物提供呼吸所需的底物，使线粒体能够维持电子传递并维持体内平衡。由于生长因子利用率的降低导致糖酵解和细胞死亡动力学的差异（图。​（图3A三A和​和4A），4A） 在退出IL-3之前和之后，测定在IL-3浓度降低的情况下培养的细胞的糖酵解速率。为了避免因存在死细胞而导致的解释错误，在提取生长因子12小时后测量糖酵解，此时细胞表现出与亲代群体相似的克隆效率，即使是从高浓度IL-3中提取细胞(22). 在存在IL-3的情况下，随着IL-3的可用性下降，糖酵解率下降（图。​（图3A三A和​和6）。6). 退出IL-3后，尽管在剥夺IL-3之前观察到的初始糖酵解速率存在差异，但糖酵化速率下降到了相似的水平。因此，在提取生长因子后，在低浓度IL-3培养的细胞中，糖酵解的绝对变化较小。糖酵解速率变化中的这些差异让人想起了从生长因子中提取适应不同水平IL-3的细胞时观察到的细胞死亡率的差异（对比图。​图66和图。​图4）。4). 此外，这些数据表明，生长因子受体可能通过维持足够的糖酵解速率来防止线粒体内稳态的改变，从而阻止细胞死亡机制的激活。

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图6

糖酵解速率的变化幅度与细胞死亡率相关。在存在（+IL-3）或不存在（−IL-3）IL-3的情况下，将适应于在含有指示量的IL-3的培养基中生长的细胞培养12小时。显示了每个条件下的平均糖酵解速率（和平均值的标准误差）。还显示了IL-3退出后糖酵解（Δ）的变化。

不同生长因子促进细胞存活的能力与其促进葡萄糖利用的能力相关。

为了确定促进糖酵解的能力是否是生长因子依赖生存的一般特征，用FL5.12细胞检测了具有明确促生存特性的其他因子的功能。与IL-3依赖性信号一样，EpoR是造血生长因子的一个例子，其信号通路涉及Jak激酶介导的Stat蛋白活化(21,27). PDGF-R是受体酪氨酸激酶的一个例子，它通过磷脂酰肌醇3′-激酶/Akt途径传递生存信号(2,19). Epo和PDGF都不足以支持野生型FL5.12细胞的存活，因为这些细胞没有表达足够水平的EpoR或PDGF-R（数据未显示）。然而，当FL5.12细胞转染适当的受体并从IL-3中提取时，Epo和PDGF都能促进这些细胞的存活（图。​（图7A）。7A） ●●●●。

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图7

外源性生长因子受体维持细胞活力的能力与其维持糖酵解的能力相关。（A） 从IL-3中提取转染EpoR（闭合方块）、PDGF-R（闭合菱形）或无（对照）（开放方块）的FL5.12细胞，并将其置于含有Epo（−IL-3/+Epo）、PDGF（–IL-3/+PDGF）或无外源性生长因子（−IL-3）的培养基中。显示了每个条件下随时间变化的平均细胞存活率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 用EpoR、PDGF-R或无任何转染的细胞（对照）在IL-3存在下培养或从IL-3中取出，并将其置于含有Epo（−IL-3/+Epo）、PDGF（−IL-3/+PDGF）或不含外源性生长因子（−IL-3）的培养基中12小时。显示了在每个细胞群体中测量的平均糖酵解速率（和SEM）。

为了确定Epo和PDGF是否有促进葡萄糖利用的作用，将用IL-3培养的细胞中的糖酵解速率与完全从生长因子中提取或仅用PDGF或Epo培养12小时的细胞中糖酵化速率进行比较。在没有生长因子的情况下，细胞糖酵分解速率急剧下降，与IL-3生长的细胞相比。当IL-3被抽出时，PDGF和Epo都促进了葡萄糖的持续利用（图。​（图7B）。7B） ●●●●。在IL-3退出后，PDGF是一种相对较差的细胞死亡抑制剂，支持糖酵解的速率远低于IL-3或Epo。相反，Epo支持的糖酵解水平仅略低于IL-3支持的水平，并且在促进细胞存活和增殖的能力方面与IL-3的作用类似。与IL-3停药一样，糖酵解的变化反映了细胞死亡率。这些数据表明，生长因子促进细胞存活能力的一个重要决定因素是其促进特定细胞类型葡萄糖利用的能力。

葡萄糖或生长因子的提取对糖酵解的限制会导致细胞死亡。

如果生长因子促进细胞存活的能力与其促进糖酵解的能力有关，那么在存在生长因子的情况下限制葡萄糖的利用应模拟生长因子的退出。限制葡萄糖利用的一种方法是限制培养基中可用的葡萄糖量。当培养基中的葡萄糖浓度降至0.1 mM以下时，糖酵解受到底物限制（图。​（图8A）。8A） ●●●●。通过葡萄糖剥夺限制高水平IL-3生长的FL5.12细胞的糖酵解速率会导致细胞在3天内死亡（图。​（图8B）。8B） ●●●●。细胞生长所用的IL-3浓度越高，细胞对葡萄糖限制的反应越快。这一结果表明，在营养限制条件下，高水平的生长因子可能会触发细胞死亡。此外，当在相同浓度的IL-3中连续培养的细胞被提取到不同量的葡萄糖中时，提取到最低浓度葡萄糖的细胞的死亡率高于提取到较高浓度葡萄糖的电池（数据未显示）。这些数据表明，在缺乏足够的外部葡萄糖的情况下，生长因子不能促进细胞存活，并支持以下假设，即细胞死亡率与生长因子或营养素撤除导致的糖酵解变化成正比。

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图8

生长因子较多的细胞在营养限制后更容易死亡。（A） 用0.35 ng IL-3/ml和11 mM葡萄糖清洗等量的细胞，并将其重新悬浮在含有不同量葡萄糖的缓冲液中。测定并显示了指示葡萄糖浓度下的平均糖酵解速率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 在含有相同量IL-3但仅含有0.05 mM葡萄糖的培养基中清洗并重新悬浮适于培养具有指定浓度IL-3的细胞。通过碘化丙啶排除和流式细胞术在葡萄糖停药后的指定时间测定细胞活力。显示了每个条件下随时间变化的平均细胞存活率（和SEM）。

M.G.V.H.和D.R.P.是这项工作的第一作者。

我们感谢Franz Matschinsky的宝贵讨论，感谢Habiba Najafi在糖酵解测定方面提供的技术援助，感谢Martin Carroll提供的生长因子受体结构。我们也感谢汤普森实验室的成员对手稿进行了有益的讨论和批判性阅读。

M.G.V.H.获得了芝加哥大学医学科学家培训计划和癌症研究基金会妇女委员会的部分支持。D.R.P.和J.C.R.得到了欧文顿免疫研究所的研究金支持。