细胞不断地提取有关其环境的信息，并修改其细胞和代谢程序，以应对当前的条件。对于单细胞生物，如芽殖酵母，酿酒酵母关于营养状况的许多信息都是由营养素本身携带的。根据碳、氮、硫和其他需求的类型和可用性，引出适当的代谢和细胞程序。首选碳源（如葡萄糖）的耗尽表明，许多基因需要被诱导改变为其他代谢状态，部分是通过葡萄糖抑制基因的去抑制，部分是由基因表达的环腺苷酸（cAMP）途径控制(18,30). 另一个与营养缺乏相关的决定是合成糖原和海藻糖等储存化合物，这是酵母的主要碳水化合物储备(15). 糖原是葡萄糖单元的分支聚合物，作为葡萄糖和能量的储备(47). 在生长在葡萄糖上的酵母中，糖原在对数期后期合成，当细胞进入固定期时开始利用(7,8,37). 然而，糖原储存可以保存到饥饿的晚期，并被认为在孢子形成过程中被利用(10). 在分裂细胞中，也有一些证据表明碳水化合物储备的积累与细胞周期之间的关系(52). 糖原和海藻糖在G中合成1在出芽阶段枯竭。
糖原生物合成的途径在酵母和哺乳动物之间是保守的，始于糖原原，这是一种自葡糖基化起始蛋白，形成寡糖引物，分别是糖原合成酶和分支酶伸长和分支的底物(7,42). 糖原合成酶是酵母和哺乳动物的重要控制位点。在酵母中，糖原合成酶由两个基因编码，GSY1型和GSY2型，其中Gsy2p占固定相中糖原合成酶活性的80%(13).GSY2型转录是由胁迫诱导的，如营养限制、高盐或热休克(13,43,46)Gsy2p酶也受共价磷酸化负调控(25). 第三种控制是通过变构活化，最重要的配体是Glc-6-P，其结合克服了磷酸化导致的失活(25,49). 这一特性导致使用无Glc-6-P时的活性比除以其存在时的活性比来作为酶磷酸化状态的动力学指标（−/+Glc-6-P活性比）。
根据序列相似性，Snf1p是哺乳动物AMP活化蛋白激酶最接近的酵母同源物(23)并且主要研究了其在葡萄糖抑制中的作用(5,18,23). 缺少细胞SNF1系列，葡萄糖抑制基因在缺乏葡萄糖的情况下不能被解除表达(5,6).SNF1系列也在糖原代谢中起作用，是糖原缺乏突变株的原始菌株之一(GLC公司突变体），glc2型，携带一个突变的等位基因SNF1系列(4). Hardy等人(24)表明受损的糖原积累snf1细胞与糖原合成酶的过度磷酸化相关，如低−/+Glc-6-P活性比率所证明的，而不是糖原合合成酶表达的控制。为了鉴定磷酸化糖原合成酶的蛋白激酶snf1因此，该菌株被用于筛选糖原缺陷的第二位点抑制物(26). 我们确定电话85、和snf1 pho85筛选出的两个突变体具有野生型糖原合成酶活性比率和正常糖原水平。电话85编码细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）催化亚单位，与其他CDK一样(1)，与名为Pcls的自行车合作伙伴共同行动，其中10人已知(40).电话85首次通过参与磷酸代谢而被鉴定，它与细胞周期蛋白Pho80p配对以磷酸化Pho4p转录因子(30年,56). 随后的工作表明，Pcl8p和Pcl10p将Pho85p与糖原合成酶失活联系起来(27). 因此，删除PCL8系列和PCL10系列野生型菌株导致糖原合成酶活性比率高和糖原过度积累(27). 同样，损失PCL8系列和第10页在中snf1菌株恢复了糖原合成酶的活性，但在代表本研究起点的意外结果中，没有恢复糖原积累(27). 因此，我们提出，一定有其他因素或过程受Snf1p控制，不能通过突变PCL8系列和PCL10系列(27).
酵母和哺乳动物细胞对营养饥饿的另一种反应是自噬的诱导(11,12,53). 自噬是一种细胞随机吞噬细胞质和细胞器形成自噬小体的过程，自噬体被输送到液泡（在酵母中）或溶菌体（在哺乳动物中）。在那里，自噬体被降解，以回收某些成分，如氨基酸，并在饥饿期间产生能量。通过不同的基因筛选，许多基因与这一过程有关(34). 首批发现的酵母自噬基因之一是APG1公司编码Ser/Thr蛋白激酶(57)，其激酶活性是其功能所必需的(39). 通过上位性，APG1公司被放置在另一个自噬基因的下游，亚太13国集团(17)，其序列与数据库中的任何内容都不匹配。在我们努力确定受Snf1p控制的影响糖原代谢的新因子的过程中，通过高拷贝抑制筛选和snf1 pc18 pcl10已识别主机APG1公司和亚太13国集团我们在这里描述了自噬过程如何与细胞维持糖原储存的能力相关，我们认为自噬是由Snf1p和Pho85p控制的。
材料和方法
菌株、培养基和遗传方法。
这个酿酒酵母表中列出了本研究中使用的菌株富培养基YPD含有1%（wt/vol）酵母提取物、2%（wt/vol）Bacto蛋白胨和2%（wt/vol）葡萄糖。合成完全培养基SD含有0.67%（wt/vol）酵母氮基、2%（wt/vol）葡萄糖和完全补充混合物（Bio 101，Inc）。合成选择性培养基由0.67%（wt/vol）酵母氮基、2%（wt/vol）指示碳源（SD中的葡萄糖）和指示的SD-Ura中缺乏适当氨基酸或尿嘧啶的完整补充混合物组成。为了分析平板上的糖原积累，将等分样品（5至10μl）点在平板上，并在通过将平板暴露于碘蒸汽检测糖原之前的指定时间内培养细胞。SD（−N）培养基含有2%（wt/vol）葡萄糖和0.17%（wt/vol）酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵。质粒保存在大肠杆菌DH5α。采用标准的酵母遗传分析和转化方法。
表1
| 应变一 | 基因型 | 来源 |
|---|
| EG328-1A型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 | K.Tatchell公司 |
| EG353-1C型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 snf1::乌拉3 | K.Tatchell公司 |
| TN125型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1声嘶嘶声3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ60 | Y.Ohsumi先生 |
| ZW102-1型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1声嘶嘶声3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ60磷85::乌拉3 | 本研究 |
| ZW115-1型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1声嘶嘶声3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ60磷85::色氨酸::乌拉3 | 本研究 |
| ZW101-3型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1个his3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ60 snf1::TRP1号机组 | 本研究 |
| ZW105-3型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1声嘶嘶声3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ7年4月60日::URA3公司 | 本研究 |
| ZW107-9型 | 材料一Ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ1声嘶嘶声3-Δ200列伊-Δ1页8::电话8Δ60 apg1::URA3公司 | 本研究 |
| ZW34-263型 | 材料一trp1 leu2 ura3-52 snf1::TRP1第8页::URA3 pcl10::URA3 gph1型::TRP1号机组 | 本研究 |
| ZW41-6型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 sga1::URA3公司 | 本研究 |
| ZW45-7型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 gph1::TRP1号机组 | 本研究 |
| ZW48-3型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 sga1::URA3 apg1::URA3公司 | 本研究 |
| ZW49-161型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 gph1::TRP1第1页::URA3公司 | 本研究 |
| ZW52-14型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 gph1::TRP1信号::URA3公司 | 本研究 |
| ZW74-2型 | 材料αtrp1亮2 ura3-52 apg7::URA3公司 | 本研究 |
| ZW75-3型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 aut2::URA3公司 | 本研究 |
| ZW76-2型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 prb1::URA3公司 | 本研究 |
| ZW77-4型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 pra1::URA3公司 | 本研究 |
| ZW83-1型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 apg17::URA3公司 | 本研究 |
| ZW84-4型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 cvt9基因::URA3公司 | 本研究 |
| ZWP1-5型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 apg1::URA3公司 | 本研究 |
| ZWP13-2型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 apg13::URA3公司 | 本研究 |
| ZWS2型 | 材料αtrp1 leu2 ura3-52 snf1基因::TRP1第8页::URA3 pcl10::URA3公司 | 本研究 |
基因破坏。
对于基因断裂，PCR方法(60)用于从包含45个核苷酸的引物中生成DNA片段，这些核苷酸来自感兴趣基因的侧翼序列，然后是21个核苷酸，这些核苷酸与跨越适当pRS质粒中所选标记基因的pBluescript序列相匹配(51). 这个URA3公司载体pRS306中的基因，TRP1号机组载体pRS304中的基因，以及LEU2级以pRS305中的基因作为PCR模板。PCR产物包含感兴趣基因的5′和3′序列，所选标记基因位于中间。然后用DNA片段转化酵母细胞，生成所需基因被破坏的菌株。对于每个中断，至少分析两个，通常是更多的独立突变体。
糖原缺乏表型多拷贝抑制物的筛选snf1 pcl8 pcl10细胞。
这个snf1 pc18 pcl10细胞（ZWS2）通过构建在2μm载体pYEP13中的酵母基因组文库进行转化，该载体取自美国型培养物收藏库。在30°C的SD-Leu板上生长3天后，大约105通过碘蒸气染色分析转化子的糖原积累。其中，104个候选转化体是基于碘的深色染色而选择的。从候选转化子中分离出质粒，并将其转化回ZWS2，以确认改变的糖原积累是质粒依赖性的。最终确认了46名积极候选人。从两端对候选质粒中的插入序列进行测序，以确定存在的基因组区域。对于DNA插入中含有多个基因的质粒，必要时亚克隆限制性片段，以确定相关基因。将与感兴趣基因相对应的DNA克隆到pYEP13或pRS425中，然后转化为snf1 pcl8 pcl10细胞证实该基因增加了糖原积累。
酶和其他分析。
为了测定酵母细胞提取物中的糖原合成酶和糖原磷酸化酶活性，培养物生长在150 ml指定培养基中，在30°C的500 ml烧瓶中，完全接触氧气。在指定的时间取出7 ml等分样品，在室温下1500×克在临床台式离心机中。分析之前，将细胞颗粒冷冻在干冰上，并储存在−80°C的温度下。将冷冻细胞在冰上解冻，然后再悬浮在400μl均质缓冲液中（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，5 mM二硫苏糖醇，50 mM NaF，1 mM-苯甲基磺酰氟，0.1 mMN个α-第页-对甲苯基-我-赖氨酸氯甲基酮、5 mM苯甲脒、0.25μg/ml亮肽和0.5μg/ml抑肽酶（pH 7.4））。如前所述，用玻璃珠打碎细胞(24).
糖原合成酶的测定采用Thomas等人的方法(55)如Hardy等人所述(24). 活性单位是指在标准分析条件下，每分钟催化1μmol葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到糖原的酶量。在存在7.2 mM Glc-6-P的情况下测量糖原合成酶的总活性。−/+Glc-6-P活性比定义为在没有Gl-6-P的情况下测得的活性除以存在时测得的活动。每次测量均为重复测定的平均值。
糖原磷酸化酶是按照糖原合成的方向用已发表的方法测定的(22,29)稍作修改。活性单位是指在标准分析条件下，每分钟催化1μmol葡萄糖从Glc-1-P转移到糖原的酶量。每次测量是重复分析的平均值。
碱性磷酸酶活性的测量（420 nm光密度变化[ΔOD420]每分钟每毫克蛋白质）(44). 为了测量在合成完整培养基中生长的细胞的提取物中的活性，按照糖原测量所述对细胞进行生长、收集和存储。为了测量饥饿时碱性磷酸酶活性的刺激，在YPD培养基至对数期（～1×10）中培养5 ml培养物7至2×107细胞/ml培养基），通过离心收集，并用消毒水冲洗两次。将细胞重新悬浮在5 ml SD（−N）培养基中，并在测定碱性磷酸酶活性之前持续培养4至5 h。
如Huang等人所述，在葡萄糖抑制和去抑制细胞中测量转化酶活性(26). 用Bradford法测量蛋白质浓度(三)以牛血清白蛋白为标准。
糖原、ATP和Glc-6-P的测定。
酵母细胞糖原含量的定量测定是通过修改已发表的方法进行的(45). 等分试样（～1×107将培养在YPD培养基中的细胞接种到40 ml合成完全培养基的液体培养物中（除非另有说明）。培养物在30°C下培养，在指定的时间，通过离心收集1 ml培养物。将细胞颗粒冷冻在干冰上并储存在−80°C。为了测量糖原，用200μl 20%（wt/vol）KOH重新悬浮冷冻样品，并在水浴中煮沸1小时，偶尔摇晃。将样品在冰上冷却2分钟，并添加200μl 4 M HCl。通过添加1ml冰镇95%（vol/vol）乙醇沉淀糖原。通过17500×离心收集颗粒克在室温下保持15分钟。用66%（vol/vol）乙醇进行两次洗涤后，将颗粒干燥，再悬浮在400μl 50 mM醋酸钠–5 mM CaCl中2（pH值5.0），并在56.5°C下用30μg淀粉葡萄糖苷酶和2μg淀粉酶消化12小时。然后按照前面所述测定释放的葡萄糖(24). 计算糖原浓度并将其归一化为细胞数。
为了测量ATP和Glc-6-P，酵母细胞在合成完全培养基中生长到指定阶段，并通过快速过滤收集。然后在液氮中快速冷冻细胞。如前所述进行Glc-6-P和ATP的测定(61).
结果
糖原缺乏表型多拷贝抑制物的筛选snf1 pcl8 pc110细胞。
删除电话85恢复了正常的糖原合成酶活性和糖原积累能力snf1突变体(27). 消除细胞周期蛋白Pc18p和Pcl10p，这两种蛋白被认为可以将Pho85p导向糖原合成酶的控制，导致野生型或snf1细胞，但糖原仍在snf1 pcl8 pcl10细胞有缺陷。这些结果表明，其他途径或过程SNF1系列，有助于糖原在酿酒酵母(27). 为了确定Snf1p的这些潜在下游效应器，我们寻找了Snf1p糖原缺乏表型的多拷贝抑制剂snf1 pcl8 pcl10细胞。在2μm载体pYEP13中构建的酵母基因组文库用于转化snf1 pcl8 pcl10根据菌落碘染色判断，按照材料和方法中的描述选择细胞和糖原储存增加的候选细胞。质粒的部分测序允许识别相关的基因组区域，在大多数情况下，独立选择的质粒之间的重叠确定了负责的基因。除了SNF1系列，一个预期在筛选中呈阳性的基因被鉴定了12次，发现其他6个基因在snf1 pcl8 pcl10电池（图。). 这些多拷贝抑制物还增加了snf1突变体，尽管程度较小（数据未显示）。最常恢复的基因是APG1公司，一种与自噬过程有关的蛋白激酶(39). 有趣的是，屏幕也显示亚太13国集团，另一个自噬基因，与APG1公司(17). 在筛选出的其他阳性反应中，Gac1p是1型蛋白磷酸酶Glc7p的靶向亚单位，负责糖原合成酶的去磷酸化，其与糖原合成的联系已得到很好的证实(16). 同样，PDE2型编码一种降解cAMP的磷酸二酯酶，已知cAMP减少会增加糖原储备(35,55年).RCK2号机组编码钙调素依赖性激酶样蛋白(41)其与糖原储存的联系尚未见报道，但与Hog1p途径有关(2). 最后一个阳性是基因，YGR161C型，功能未知。糖原储存和自噬之间的联系是新颖的，它连接了两个受营养状态密切调节的过程。本研究代表了我们对自噬在决定糖原储存中可能作用的更多理解。
糖原积累snf1 pcl8 pcl10具有多拷贝抑制质粒的细胞。菌株为EG328-1A（野生型[WT]）或ZWS2(snf1 pcl8 pcl10). 质粒为插入了指定基因的pRS425（载体）或pYEP13。在屏幕中，APG1公司被发现17次，亚太13国集团被发现1次，PDE2型被发现8次，RCK2号机组被发现3次，GAC1公司被发现2次，并且YGR161C型被发现2次。细胞在30°C的SD-Leu平板上生长2天，然后暴露于碘蒸气中2分钟以评估糖原积累，染色越深，糖原积累越大。
Apg1p是一种Ser/Thr激酶，从序列比对来看，它与Snf1p有着遥远的联系，因此这两种激酶在形式上可能具有一些重叠的功能，从而解释了在屏幕上对Apg1p的识别。因此，我们测试了APG1公司影响其他细胞特性snf1突变体，即不能在甘油等非发酵碳源上生长，以及编码转化酶的葡萄糖抑制基因的组成性表达。首先，存在携带APG1公司基因不能恢复甘油的生长snf1 pcl8 pcl10单元格（未显示数据）。其次，转化酶的组成型表达不受APG1公司来自多拷贝质粒（数据未显示）。此外，apg1型细胞通常具有可抑制的转化酶表达，可以在甘油上生长。因此，我们认为不太可能APG1公司被识别，因为它取代了SNF1系列功能。
的影响APG1公司和亚太13国集团糖原积累突变。
确认角色APG1公司和亚太13国集团在糖原积累方面，我们删除了APG1公司或亚太13国集团在EG328-1A中，应变用于我们的大部分工作apg1型和第13页空白突变体在YPD或合成完全培养基中的营养生长没有缺陷，但转移到饥饿培养基SD（−N）中3天后几乎没有活力（数据未显示）。同样，二倍体纯合子空株不能产孢（数据未显示）。空泡中未发现自噬体apg1型和第13页在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的存在下，将细胞转移到饥饿培养基SD（−N）中后的菌株（数据未显示）。这些发现都与之前对apg1型和第13页突变体(17,39,57).
中断的影响APG1公司通过测量在液体培养物中生长的细胞的糖原含量来分析糖原积累的影响（图。). 细胞在合成的完全培养基中生长，并在从指数晚期开始的指定时间采集样品。在野生型和apg1型当细胞达到指数晚期并达到类似的最大水平时，糖原开始积累和增加。在野生型细胞中，糖原水平在早期稳定期有可重复的下降，之后水平略有增加，直到在稳定期后期被利用（图。). 我们还分析了另一个菌株TN125(44)，用于自噬分析（见下文）。TN125最初来源于YPH499，具有类似的糖原积累模式，尽管达到最大糖原水平的时间更长（见下文）。在apg1型电池（图。)糖原最初正常积累，但在早期稳定期迅速耗尽，从未再合成。糖原的测定apg13型细胞给出了类似的结果（数据未显示）。因此apg1型突变体不是它合成糖原的能力，而是它在稳定期后期保持储存的能力。要检查apg1型在糖原分解期间，细胞并没有简单地消耗ATP，我们在生长24和48小时后测量了ATP和Glc-6-P的浓度，并在apg1型突变体与野生型细胞无法区分（数据未显示）。由于一些孵化时间较长，我们还检查了存活率，以确保测量结果不会仅仅受到细胞死亡的影响。在进行如图所示的实验5天后。和野生型和apg1型细胞的存活率为40%至50%（数据未显示）。这些结果清楚地表明APG1公司或亚太13国集团影响糖原储存在酿酒酵母中这些基因是长时间孵育期间维持糖原所必需的。
糖原积累apg1型细胞在合成完全培养基中长期培养。野生型（EG328-1A）和apg1型（ZWP1-5）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间，通过计数细胞数量来测量细胞浓度（□，野生型细胞；○,apg1型单元格）。取等分试样测定糖原含量（■，野生型细胞；●,apg1型单元格），如材料和方法中所述。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
损失全球生产总值1逆转糖原消耗apg1型细胞。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZWP1-2(apg1型[●]）ZW49-161(apg1 gph1[▴]）和ZW45-7(加仑每小时1[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
两者都有全球生产总值1和新加坡通用航空公司影响糖原降解。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分样品进行糖原测量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZW41-6(sga1号机组[▾]），ZW48-3(apg1 sga1[●]）和ZW48-3(gph1 sga1[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
值得注意的是，液体培养细胞和固体平板培养细胞的糖原积累动力学不同。在平板上，糖原积累减少与APG1公司在合成完全培养基上，直到4-5天才能观察到缺失。然而，在液体合成完全培养基中，糖原积累减少的时间更早，消耗速度更快。达到固定相数小时后，几乎没有检测到糖原。
糖原磷酸化酶基因缺失，全球生产总值1，逆转糖原的快速消耗apg1型细胞。
对于任何代谢物，糖原的量不仅取决于其合成，还取决于其降解速度。糖原的α-1,4-糖苷键的裂解可以通过糖原磷酸化酶Gph1p催化的磷酸化来实现(29)或水解。酿酒酵母已知有三个编码水解糖化酶的基因，SGA1、STA1、和STA2公司. TheSTA公司基因是一种外酶，被认为与淀粉的营养利用有关(59)，而新加坡通用航空公司编码一种非常相似的酶，据报道为孢子形成特异性酶，与液泡相关(9,48). 缺乏全球生产总值1消除了糖原在早期稳定阶段的短暂下降，导致了过度的再合成阶段（图。). 最大糖原积累量约为野生型细胞的两倍，尽管5至6天后糖原的减少与野生型细胞中晚期糖原消耗相平行加仑每小时1该菌株仍保持显著较高的糖原水平。我们首先推断磷酸化酶在早期稳定期降低糖原水平，并进一步推断此时存在活性合成。在稳定阶段的后期，当糖原水平下降时，必须进行其他一些降解过程。
什么时候？全球生产总值1已在中删除apg1型突变株恢复了在固定相维持糖原的能力（图。). 糖原积累水平apg1 gph1然而，双突变体显著低于加仑每小时1他认为，Apg1p对这一阶段发生的糖原合成也有积极影响。我们测量了野生型和apg1型细胞在合成完全培养基中生长（数据未显示）。培养24小时或48小时后，酶活性没有差异。我们还测量了snf1 pcl8 pcl10细胞携带APG1公司或亚太13国集团由多拷贝质粒表达。同样，载体对照组和表达APG1公司或亚太13国集团（未显示数据）。我们推断Apg1p不会通过直接影响糖原合成酶或磷酸化酶来影响糖原水平，即使磷酸化酶的存在是糖原维持缺陷的必要条件apg1型细胞。
两者都有全球生产总值1和新加坡通用航空公司参与糖原降解。
消除由编码的其他糖原降解酶新加坡通用航空公司，具有更复杂的效果（图。). 糖原损失sga1号机组早期固定期的细胞基本上与野生型细胞相同。在稳定期很晚的时候（超过8天），糖原储存在sga1号机组突变体。这种效果在gph1 sga1双突变体，在那里既有早期糖原过度积累加仑每小时1应变（图。)糖原持续积累到稳定期。这些结果表明，降解酶Gph1p和Sga1p的作用是暂时分离的，如果Sga1p是液泡，则与物理上分离的糖原池相关联。删除新加坡通用航空公司在中apg1型菌株产生了一个双突变体，其糖原积累与apg1型变种人，辩称新加坡通用航空公司表型不需要apg1型菌株。
自噬影响糖原储存。
Apg1p是一种Ser/Thr蛋白激酶，通过酵母双杂交试验已报道与Apg13p直接相互作用(30亿,58). 因此，这些基因可以发挥一些调节作用，控制糖原代谢和自噬。或者，自噬过程本身可能是影响糖原储存的因素。因此，我们检查了其他自噬基因的缺失是否会导致糖原积累的类似缺陷，如apg1型或第13页细胞。在自噬基因中，我们选择了APG7公司和AUT2（自动变速器2）(32,36,54). Apg7p被认为是Apg12p和Apg5p结合的结合酶，两者都是自噬所必需的。Aut2p与微管相互作用，可能参与自噬小泡向液泡的传递。虽然它们的确切作用尚不清楚，但Apg7p和Aut2p是两种可能参与自噬体向液泡的启动和传递的蛋白质。我们还选择了两种蛋白酶，蛋白酶A(审慎监管局1)和蛋白酶B(项目风险评估1)被认为是液泡中的主蛋白酶，负责激活几种酶原(34). 我们建造了apg7、aut2、pra1、和prb1型我们菌株背景中的细胞和测得的糖原水平（图。). 这些突变体中糖原积累的时间过程与观察到的时间过程没有区别apg1型细胞和糖原在早期静止期迅速耗尽。
各种自噬基因破坏了细胞内糖原的积累。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZWP1-5(apg1型)和ZW74-2(apg7号机组)（○），ZW75-3(自动驾驶2[▾]），ZW76-2(prb1型[▴]）和ZW77-4(pra1型[⧫]). 其他突变细胞的糖原积累动力学与prb1型细胞。
许多最初与自噬有关的基因也参与了其他囊泡运输过程(34). 值得注意的是，与细胞溶质-囊泡靶向（Cvt途径）相关的基因有相当大的重叠。例如，APG1公司和亚太13国集团在这两个过程中都有牵连。最近亚太17国集团和CVT9型(30亿)已被确定分别与自噬和Cvt途径有关。因此，我们分析了相应的空突变菌株中的糖原积累（图。). 这个cvt9型细胞有正常的糖原积累，而apg17号机组细胞的行为与我们检测的其他自噬缺陷突变体相似。这一结果表明，在维持糖原储存方面，自噬而不是Cvt途径。我们还得出结论，影响糖原储存的是自噬过程本身，而不是与糖原储存相关的功能APG1公司和亚太13国集团.
糖原积累apg17号机组和cvt9型细胞。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZW83-1(apg17号机组[●]）和ZW84-4(cvt9型[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
自噬是在从指数增长到稳定阶段的过渡过程中诱导的。
我们已经证明，在稳定期进行自噬是糖原维持所必需的。自噬研究通常使用非常极端的实验条件，将指数增长的细胞转移到完全缺乏氮的饥饿培养基SD（−N）中(53,57). 在本研究中使用的条件下，在合成完全培养基中生长的细胞消耗营养的速度较慢，并逐渐过渡到延长的固定期，在此期间，在完全丧失生存能力之前，会发生显著的代谢重编程。因此，在我们的培养条件下，自噬是否是在指数增长后诱导的，这一问题是相关的。为了解决这个问题，我们测量了在合成培养基中生长的酵母细胞的自噬活性。为了监测自噬，我们使用了TN125菌株(44). 在这种菌株中，内源性电话8编码一种主要碱性磷酸酶的基因已被一种突变形式的基因所取代，电话8Δ60缺乏空泡靶向序列。此外电话8促进者被强者取代TDH3型发起人。截短的Pho8Δ60p蛋白只能通过自噬过程到达液泡。此外，只有在液泡中，Pho8p才能通过蛋白水解从非活性酶原转化为活性磷酸酶。因此，碱性磷酸酶活性的测量（其中Pho8Δ60主要负责）可以用作自噬活性的指标。
菌株TN125和TN125APG7公司在合成完全培养基中培养缺失的细胞，并从指数生长后期开始收集样品，以测量糖原和碱性磷酸酶（图。). 与EG328-1A菌株背景一样apg7型TN125突变并没有实质性影响糖原合成，但深刻影响了细胞在稳定期维持糖原储备的能力。这种行为在性质上与EG328-1A菌株相同，只是时间框架较慢，并且需要更多的时间才能完全丧失糖原apg7号机组具有TN125背景的突变体。当细胞离开指数期时，碱性磷酸酶活性增加了三到四倍，并在整个稳定期保持升高，这表明自噬是在这些条件下诱导的。相反，在apg7号机组细胞。携带apg1型此背景中的等位基因（数据未显示）。自噬增加可能是由于氮的限制，因为在早期静止期向细胞补充氮而不是碳，会导致细胞快速增殖（数据未显示）。与将生长在富培养基中的酵母细胞转移到饥饿培养基中引起的增加相比，TN125细胞中碱性磷酸酶活性的诱导相对较低。事实上，当稳定期细胞转移到饥饿培养基SD（−N）中时，碱性磷酸酶活性又增加了两到三倍（数据未显示）。尽管如此，这些结果清楚地表明，在标准实验室生长条件下，在酵母从指数生长到早期稳定阶段的过渡过程中，存在显著的自噬诱导。
进入稳定期后诱导自噬。野生型（TN125）和apg7号机组（ZW105-3）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。糖原含量（■，野生型菌株TN125●，apg7号机组)碱性磷酸酶活性（□，野生型菌株TN125；○,apg7号机组)按照方法和材料中的描述进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
SNF1系列和电话85调节自噬。
这个APG1公司和亚太13国集团基因是体内糖原积累减少的抑制物snf1和snf1 pcl8 pcl10细胞。那么，一个重要的问题是SNF1系列对自噬有任何影响。喜欢snf1细胞，自噬突变体对饥饿更敏感(57). 因此SNF1系列基因在TN125背景中被删除。TN125和相应的snf1突变体在YPD培养基中生长到中等指数生长期（～1×107至2×107细胞/ml培养基），收集并转移到饥饿SD（−N）培养基中诱导自噬。根据碱性磷酸酶活性的测量，TN125菌株中有强烈的自噬诱导，但这在很大程度上被阻断snf1电池（图。). 安apg7号机组作为对照，该菌株在饥饿时也表现出碱性磷酸酶诱导减少。这些结果表明SNF1系列是自噬的积极调节者。此外，碱性磷酸酶的诱导snf1与野生型细胞相比，进入固定相的细胞变钝（图。). 我们还测试了其他一些基因是否被鉴定为snf1 pcl8 pcl10通过删除RCK2号机组和YGR161C型在TN125背景中。碱性磷酸酶活性的诱导rck2型或ygr161c型在转移到饥饿培养基中时，空突变体与野生型细胞中的类似（数据未显示）。这些结果表明还有其他SNF1系列-影响糖原储存的介导机制。然而，最重要的结论是Snf1p蛋白激酶参与控制自噬，而自噬是另一个与营养调节相关的关键细胞过程。
的影响SNF1系列和电话85关于自噬。野生型（TN125），snf1（ZW101-3），第85页（ZW102-1），以及apg7号机组（ZW105-3）细胞在YPD中生长到对数期，然后转移到SD（−N）。继续培养4小时。然后采集细胞，并按照材料和方法中的描述测量碱性磷酸酶活性。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
的影响SNF1系列和电话85进入稳定期后的自噬。（A） 野生型（TN125）和snf1（ZW101-3）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。碱性磷酸酶活性（■，野生型菌株TN125●，snf1)，按照材料和方法进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。（B） 野生型（TN125），第85页（ZW102-1），以及pho85 apg1（ZW115-1）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。碱性磷酸酶活性（■，野生型菌株；⧫，第85页; □,pho85 apg1)按照材料和方法进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
自失去电话85抑制糖原缺陷snf1细胞，测试是否电话85对自噬有任何影响。通过使用TN125菌株电话85删除后，饥饿诱导的自噬在第85页根据标准试验（图。). 然而，与野生型细胞相比，碱性磷酸酶活性的诱导作用被夸大了，当细胞培养物进入稳定期时，其活性升高了三倍（图。). 无论是诱导的基础水平、未诱导水平还是诱导的时间都不会因最大活性水平和持续时间而发生很大变化。用一个pho85 apg1双突变体碱性磷酸酶诱导降低到自噬缺陷菌株的受损水平，表明APG1公司是上位的第85页与自噬有关的突变。这些结果表明，Pho85p对自噬起负控制作用，可能通过Apg1发挥作用。
糖原储存受损snf1突变体涉及合成和维持。
由于自噬突变体中糖原储存受损与不能维持糖原有关，我们更详细地研究了自噬突变株中糖原积累的时间过程snf1突变菌株（图。). 我们之前认为snf1突变体仅通过过度磷酸化和糖原合成酶失活积累糖原。糖原合成在snf1细胞，但产生的任何糖原都迅速丢失，28小时后完全消失PCL8系列和PCL10系列在中snf1菌株恢复了接近野生型水平的糖原初始合成，这与我们的观察一致，即该菌株中的糖原合成酶被激活，其−/+Glc-6-P活性比率正常(27). 然而，该菌株无法保留糖原，在这方面，这三个突变体的行为与自噬突变体完全相同。正如自噬突变体一样，糖原积累的减少通过缺失全球生产总值1（图。). 因此snf1 pcl8 pcl10菌株积累糖原不是由于合成缺陷，而是由于不能维持糖原，很可能是因为自噬缺陷。
糖原积累snf1、snf1 pc18 pcl10、和snf1 pcl8 pcl10 gph1细胞。细胞在YPD中培养过夜，然后稀释1/200到合成完全培养基中。在指定的时间采集样品，并按照材料和方法中的说明测量糖原含量。使用以下菌株：EG353-1C(snf1[■]），ZWS2(snf1 pcl8 pcl10[●]）和ZW34-263(snf1 pcl8 pcl10 gph1[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
讨论
目前的研究揭示了自噬过程和糖原代谢之间的意外联系，也揭示了新的自噬控制。一种是由Snf1p介导的正调控，Snf1p是哺乳动物AMP活化蛋白激酶最接近的酵母同源物。第二种是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Pho85p的负调控。对氮、碳或硫的剥夺会刺激自噬，自噬为细胞循环其胞浆和细胞器提供了一种机制(33,34). 我们的研究表明，自噬活性是在从对数期到稳定期的转变过程中诱导的，这与细胞适应改变的营养环境相一致。
SNF1系列它在葡萄糖抑制和糖原积累中的作用早已为人所知，因此将其与另一种与营养控制相关的反应联系起来可能并不奇怪。关于糖原积累缺陷，我们最初认为snf1突变体在糖原合成方面存在缺陷snf1 pcl8 pcl10突变体具有相似的表型(27). 换句话说，我们认为三重突变体对生物合成途径有一些未经认可的损伤。然而，从目前的研究中，我们认识到糖原的初始合成snf1 pcl8 pcl10细胞基本正常，与高活性糖原合成酶一致。这些细胞的缺陷是不能维持糖原储存。这个snf1细胞在糖原合成和保存其产生的少量糖原的能力方面都存在缺陷。最可能的解释是自噬受损与snf1突变。由于我们的基因筛查没有发现其他自噬基因，很可能是SNF1系列通过控制自噬APG1公司和亚太13国集团其本身具有一定的调节功能。在机械方面，SNF1系列将位于的上游APG1公司和亚太13国集团，由于多副本APG1公司和亚太13国集团稳定期糖原积累增加snf1 pcl8 pcl10和snf1EG328-1A背景中的电池（图。). 请注意SNF1系列可能会对糖原储存的维持施加其他控制，因为基因筛查中确定的两个基因缺失，RCK2号机组和YGR161C型，不影响自噬。事实上第85页无效突变使糖原储存恢复到snf1细胞表明电话85可能通过不同于Pcl8p和Pcl10p的细胞周期蛋白对糖原代谢的维持期进行负调控。确实，删除电话85产生一株自噬活性在正常时间被诱导，但被夸大且持续存在的菌株。在更标准的自噬测定中，转移到饥饿培养基中，碱性磷酸酶的诱导仅略高于野生型对照的水平，这与这种导致自噬活性最高水平的极端条件一致。在更缓慢地过渡到固定相时第85页突变体表现得好像对饥饿信号更敏感。我们推断，由Pho85p和非Pcl8p或Pcl10p的细胞周期蛋白组成的蛋白激酶通常在进入固定相时对自噬起负控制作用。此外APG1公司是上位的电话85突变，表明Pho85p可能通过Apg1p发挥作用。有趣的是，这意味着在SNF1系列和电话85在自噬的控制中，已发现糖原积累的控制。
糖原代谢和自噬之间的可能关系。描述了糖原的合成和可能的命运，实心箭头表示代谢相互转化，开放箭头表示物理易位，虚线表示调控联系。糖原是通过调节糖原合成酶（Gsy1,2p）和其他生物合成酶在对数后期合成的。在培养物饱和时，糖原的利用伴随着磷酸化酶（Gph1p）的激活，随后是一个合成和降解同时发生的再积累阶段。在同一时期，饥饿信号也会导致自噬增加，这至少对糖原水平有两种影响。首先，它通过细胞成分的再循环产生小分子，如氨基酸，这些小分子可以作为能量来源和/或合成中间体返回细胞液。通过一种未知的机制，自噬对糖原合成起着积极的控制作用。第二个潜在后果是糖原在Gph1p无法到达的液泡中被隔离，在固定相很晚的时候被液泡葡萄糖苷酶（Sga1p）降解。在没有自噬的情况下，这两个过程都不起作用。在早期到中期的稳定阶段，糖原被磷酸化酶降解，不再储存在液泡中，这两种情况都会导致总糖原水平的维持降低。
本研究还关注长期液体培养过程中糖原代谢的时间和空间方面。长期以来，人们一直认为糖原和酵母的其他主要储存碳水化合物海藻糖是在对数后期积累的(15,37). 进入固定相后，在24到48小时之间，糖原会部分消耗（图。)可能与葡萄糖消耗和其他营养素限制所必需的代谢重编程相一致。糖原磷酸化酶是活性的，正是在这一时期，自噬缺陷突变体迅速耗尽其糖原储备。在野生型细胞中，有一个重新合成和维持糖原储存长达5至6天的阶段。糖原磷酸化酶在这段时间内仍然活跃，降解和合成很可能同时发生，因为磷酸化酶的损失会导致糖原的过度积累。在5到6天后，无论是野生型还是具有全球生产总值1删除，表明磷酸化酶不是唯一负责糖原降解的酶。糖原分解这一阶段的主要候选者是液泡葡萄糖苷酶Sga1p，因为新加坡通用航空公司在野生型中，更显著的是在加仑每小时1突变体，在后期稳定期保护糖原水平。那个新加坡通用航空公司基因可以发挥重要作用，这表明它可能不是严格意义上的孢子形成特异性基因(9)但只是在相对饥饿的条件下激活，如在后期的稳定阶段。与此建议一致，表达式分析也表明新加坡通用航空公司氮饥饿诱导转录(19).
自噬与糖原储存有关的机制尚不完全清楚。我们没有发现Apg1p对糖原合成酶或磷酸化酶活性有任何直接影响的证据。在没有自噬的情况下，细胞被剥夺了回收胞质物质以提供单体构建块（如游离氨基酸）和代谢能量来源的正常机制。在这些条件下，糖原耗竭的目的论原理是提供缺失的中间代谢物和能量。然而，也有迹象表明，糖原合成在自噬缺陷突变体中受到影响。例如，apg1 gph1突变株在早期至中期稳定期的糖原积累低于加仑每小时1细胞，表明糖原合成减少。此外，雷帕霉素治疗导致自噬，导致对数生长细胞中糖原积累的能力被阻断apg1型突变体（Z.Wang和P.J.Roach，未发表的观察结果），表明自噬和糖原合成之间存在联系。自噬如何影响糖原的合成和降解？一种可能性是通过与不同中间代谢物通量相关的代谢物水平的变化（图。). 糖原代谢的关键代谢产物是Glc-6-P，它是糖原合成酶的有效激活剂(25,28,50)磷酸化酶抑制剂(14,38). 然而，在临界时间、早期稳定期对Glc-6-P水平的测量表明野生型细胞和apg1型突变体。然而，其他重要的代谢物或信号也可能控制糖原代谢。我们的结果还使我们假设存在空间上不同的糖原库，这可能会影响糖原的总体积累（图。). 由于自噬是随机的，糖原应该像其他细胞成分一样传递到液泡。由于电子显微镜在液泡中检测到糖原，这一假设得到了实验支持(53). 在哺乳动物肝细胞中，约10%的糖原存在于溶酶体中(20,21). 因此，自噬缺陷的细胞将无法将糖原输送到液泡。尽管液泡是一种富含水解活性和降解活性的细胞器，但它还是一些化合物（如氨基酸、某些离子和多磷酸盐）的贮存器(31). 也许细胞溶质中合成的糖原的一部分实际上是打算储存在液泡中并加以保护的，直到在饥饿的后期才有降解的迹象，例如在孢子形成中。在没有自噬的情况下，没有一种糖原会受到细胞质中磷酸化酶的保护，同时合成受损和能量需求增加，糖原也会被降解。该模型的一个吸引人的特点是，它可以解释在没有改变糖原合成酶和磷酸化酶活性的情况下对糖原合成和降解的影响。在液泡内，糖原在静止期很晚的时候会由液泡酶Sga1p介导降解。从本质上讲，该模型表明，前面提到的Gph1p和Sga1p降解糖原的时间分离也涉及到空间分离，存在两个糖原池，一个是细胞溶质，一个为液泡。这一模式虽然远未得到证实，但确实可以作为指导未来工作的框架。
