跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞分子生命科学。2022年1月；79(1): 10.
2021年12月24日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/00018-021-04081-5
预防性维修识别码：PMC8709826号
PMID：34951664

肠上皮细胞中角蛋白8的靶向性缺失破坏组织完整性并易导致结肠肿瘤发生

卡尔·库斯塔夫·斯坦瓦尔，1 米娜·塔亚布，1 托夫·格伦罗斯，2,三 玛丽亚·A·伊洛梅基，1 凯霍·维里，4 凯伦·里奇，5 劳里·波拉，1和戴安娜·托伊沃拉（Diana M.Toivola）通讯作者1,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

角蛋白8（K8）是主要的肠上皮中间丝蛋白，可能对结肠上皮细胞的完整性起作用。在这里，我们使用了肠上皮细胞中缺乏K8的小鼠（漂浮的K8和Villin-Cre1000以及Villin-CreERt2时间)探讨肠上皮细胞K8在结肠细胞功能和病理中的细胞特异性作用。肠上皮K8缺失降低了K8伙伴蛋白，K18–K20，75–95%，其余角蛋白丝位于II型K7的结肠细胞顶端区域，减少了30%。2-脱氧-2-[18F] -体内荧光葡萄糖正电子发射断层成像确定了条件K8基因敲除的下消化道中的代谢表型。这些小鼠出现肠屏障泄漏、轻度腹泻和上皮损伤，尤其是近端结肠。小鼠表现出从肠细胞向杯状细胞的分化转移，隐窝变长，Ki67数量增加 + 结肠中的传递放大细胞。IL-22、STAT3和pRb通路中存在显著的增殖和再生信号，对炎症参数影响较小，但在衰老小鼠中炎症参数增加。重要的是，结肠细胞K8缺失导致对氮氧甲烷诱导的肿瘤发生的敏感性显著增加。总之，肠上皮K8在维持结肠上皮细胞完整性、调节增殖和抑制肿瘤方面发挥着重要作用。

图形摘要

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Figa_HTML.jpg

补充信息

在线版本包含可在10.1007/s00018-021-04081-5获得的补充材料。

关键词：绒毛核，增殖，结肠癌，肿瘤发生，杯状细胞，缺口，屏障

介绍

肠粘膜上皮细胞层的不断更新确保了肠腔和粘膜下层之间屏障的维持。屏障丧失会导致广泛的疾病，尤其是胃肠道下部的疾病，包括炎症性肠病（IBD），如结肠炎，这可能导致结直肠癌（CRC）[1]. 角蛋白是在所有上皮细胞中表达的机械性强的中间丝（IF）蛋白，由I型和II型角蛋白的专性异质聚合物组装而成。在肝和肠等简单型上皮细胞中，I型K18-K23和II型K7-K8简单上皮角蛋白（SEK）家族的主要成员以组织类型和分化特异性的方式表达[2]. 在小肠和大肠中，K8是主要且可能是最重要的II型角蛋白[2]而K19是其最丰富的I型伙伴，K18和K20含量较低[三]. 此外，在基础状态期间，小鼠结肠中表达少量II型K7[4]而在人类中，K7仅在一些人类大肠肿瘤中表达[2]. 此外，在肠道应激状态下，SEK蛋白水平是动态调节的[5]。

虽然已知IF和SEK变体会导致或易患80多种人类疾病[6，7]，即使在IBD患者中描述了少数病例，SEK变异与肠道疾病的相关性尚未建立[8，9]. 因此，角蛋白在多因素肠道疾病中的结肠细胞特异性作用尚不清楚。一些使用K8缺陷小鼠的研究表明，K8在所有K8表达细胞（这里称为K8–/–) [10，11]支持角蛋白在结肠中的作用；然而，结肠细胞K8的作用尚不清楚。全身K8–/–小鼠发生结肠疾病，表现为早发性结肠炎表型，伴有上皮细胞过度增殖、直肠脱垂以及肠屏障、分化、代谢和凋亡缺陷[11–17]. 此外，K8–/–对化学和基因诱导的CRC敏感[18]。

由于K8是所有简单上皮中主要的II型角蛋白，K8–/–小鼠还具有多种非肠道表型，包括高（50-95%）背景菌株依赖性胚胎致死率、雌性不育[10，11]、肝脏和β细胞功能缺陷[19–21]还有肝脏、胆囊[22]，胎盘[23]和甲状腺[24]缺陷。此外，老化K8–/–雄性小鼠产生抗线粒体血清自身抗体[25]强调全身K8的全身效应–/–.研究K8在肠上皮细胞中的集落细胞特异性作用，以及如果K8–/–结肠表型是由结肠细胞特异性角蛋白功能障碍引起的，我们在这里使用了cre-loxP系统（使用Villin-Core小鼠[26])建立绒毛表达肠上皮细胞K8缺乏的小鼠模型。我们在这里表明，这种条件性肠上皮特异性K8缺失可诱导结肠过度增殖、隐窝损伤、腹泻、上皮屏障渗漏以及对偶氮甲烷（AOM）诱导的肿瘤发生的高度敏感性。

结果

肠上皮特异性K8缺失伴随着其他主要结肠上皮角蛋白的下调

为了研究K8在结肠上皮细胞中的细胞特异性作用，我们使用loxP-Cre重组酶系统建立了组织特异性条件K8敲除小鼠模型（补充图1）。利用Villin-Core转基因小鼠，K8应该在K8的小肠和大肠的隐窝和绒毛中丢失flox/flox公司老鼠。为此，我们生成了两个模型。K8公司flox/flox公司; Villin-Cre1000（此处称为K8flox/flox公司; Villin-Core）是指在胚胎中开始K8缺失的小鼠，而K8flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间需要三苯氧胺给药的小鼠（给药25天后）诱导K8缺失[26]. 两种条件K8敲除模型均显示K8完全缺失（图1A、 B）当粗略分离的结肠上皮组织溶解时（图1A） 或全结肠组织（图1B） western印迹分析。此外，发现所有主要的结肠I型角蛋白K18、K19和K20都显著下调（图1A–D）。在两种K8条件敲除小鼠系中，只有K8的mRNA水平下降，而K18、K19或K20的mRNA没有下降（图1E、 F），表明K8缺失不影响K8伴侣的转录。有趣的是，K7蛋白水平仅略微降低(~ 30%）在K8中flox/flox公司; 绒毛状结肠和K8 mRNA水平轻度上调flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间（图1A、 E–F）。K8在回肠中也被删除，但在肝脏中没有删除（肝脏没有显示组织学异常），如预期（图1G–J；补充图2），证实K8的缺失忠实于表达绒毛蛋白的细胞。此外，K8的组织学flox/flox公司; 绒毛核心肾小管、子宫和胆囊上皮（表达少量绒毛蛋白）似乎正常（补充图2）[26，27]. K8公司flox/flox公司; Villin-Core雌性小鼠有生育能力，未发现胚胎死亡（补充表1）（当K8flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/flox公司繁殖，50%的后代基因型为K8flox/flox公司; 维尔林·科尔）。角蛋白免疫染色证实K8中K8完全丢失flox/flox公司; 绒毛-核心结肠上皮（补充图3A），整个隐窝的K7、K18和K19显著减少，结肠上皮细胞的顶部室中仍有染色（补充图AAB）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig1_HTML.jpg

肠上皮特异性K8缺失导致肠上皮局部角蛋白丢失。一个粗略分离的K8结肠上皮裂解物flox/flox公司（1-3车道），K8flox/flox公司; Villin-Core（4-6车道）和K8flox/–; Villin-Core（7–9车道）小鼠(n个 = 3） 对K8、K7、K18、K19和K20进行免疫印迹。B类未经处理的K8的总结肠裂解物flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间（1–3号通道）和三苯氧胺治疗（首次注射后25天）K8flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间（4-6车道）和K8flox/flox公司（7–8车道）老鼠(n个 = 3） 对K8、K7、K18、K19和K20进行免疫印迹。Hsc70被用作两种药物的负荷控制一个和B类.C类，D类对A和B中的免疫印迹进行定量并将其标准化为Hsc70。结果代表平均值(n个 = 3） 蛋白质含量 ± K8之间存在显著差异的SDflox/flox公司和K8flox/flox公司; 绒毛鼠(C类)以及未经治疗和三苯氧胺治疗的K8flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间老鼠(D类)，单个值显示为点。E类，F类mRNA水平Krt8（Krt8），Krt7(E类和F类)和Krt18（Krt18），氪19，Krt20和Krt23(E类)用qRT-PCR分析肠特异性K8基因敲除小鼠的总结肠裂解物。将结果归一化为Actb公司和18S核糖体RNA表达和盒(E类)从25个百分位延伸到75个百分位数，线条代表中间表达值，胡须代表最小值和最大值，单个小鼠的值显示为圆点(n个 = 6） ，同时(F类)显示平均值(n个 = 3） 折叠变化 ± SD和单个值显示为点。G公司，H（H）回肠和我，J型对肠道特异性K8敲除小鼠的肝总裂解物进行K8免疫印迹，并将Hsc70用作负荷对照。通过单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey多重比较测试（除年外）确定统计显著性F类按学生的T型测试，如所示*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001和****P（P） < 0.0001

肠道特异性K8敲除导致肠道通透性增加、腹泻、结肠上皮损伤和肠腔长度增加

而K8flox/flox公司; Villin-Core或K8flox/–; 与K8相比，Villin-Core年轻成年小鼠的体重或结肠长度没有差异flox/flox公司对照小鼠（图2A、 B）、K8flox/flox公司; 与K8和K8相比，Villin-Core大便稠度明显变软flox/flox公司和K8弗洛克斯/–; 绒毛鼠（图2C） 表示轻度腹泻。组织学分析显示K8结肠近端和远端的隐窝长度平均增加1.5–2倍flox/flox公司; Villin-Core小鼠，而K8中一个等位基因缺失flox/–; Villin-Core不影响K8蛋白水平（图1C、 D）、隐窝长度或粪便稠度（图2C、 D、G）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig2_HTML.jpg

肠上皮特异性K8敲除小鼠会发生结肠上皮损伤、屏障丧失和腹泻。K8公司flox/flox公司，K8flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/–; 分析Villin-Core小鼠的体重(一个)，冒号长度(B类)，大便松动(C类)、远端和近端结肠隐窝长度(D类)、远端和近端无隐匿区域(E类)和结肠屏障通透性（对于K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; 绒毛鼠）(F类).n个 = 9-20只3-8个月大的老鼠，圆点表示单个老鼠和盒子B类，C类，F类从25个百分位延伸到75个百分位数，直线代表中值，胡须代表最小值和最大值。G公司K8结肠远端和近端的代表性HE染色flox/flox公司，K8flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/–; 绒毛鼠。比例尺100µm。P（P）这些值代表基因型之间的差异，通过单因素方差分析和事后Tukey多重比较测试确定，除了F类通过Kolmogorov–Smirnov试验确定。n个.秒. = 不重要*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

在K8中观察到广泛的结肠上皮损伤flox/flox公司; Villin-Core小鼠，主要位于近端结肠，损伤测量为%无隐匿区域，平均占20%，高达总上皮的40%（图2E、 G）。K8系列flox/–; Villin-Core小鼠表现出无隐窝丢失（图2E、 G）。类似地，K8在成人K8结肠中的敲除flox/flox公司; Villin CreER公司t2时间首次注射三苯氧胺25天后，小鼠的结肠呈现乳白色外观，没有明显的粪便颗粒（补充图4A），结肠隐窝长度和上皮糜烂程度与K8相似flox/flox公司; 绒毛鼠。在对照K8中，三苯氧胺治疗未引起隐窝长度变化或结肠上皮细胞丢失flox/flox公司和Villin-CreERt2时间小鼠（补充图4B-D）。条件结肠和K8结肠远端和近端表型的比较–/–在一组年龄匹配小鼠的基因敲除模型中，模型和结肠段的隐窝长度都有相似的增加，其中K8的平均隐窝长度最长–/–（补充图4 E–F）。在所有模型中都可以看到隐窝丢失表型，但在条件K8敲除模型中更为明显（补充图4G-H）。K8-缺乏诱导的隐窝损伤表明结肠屏障功能被破坏，事实上，口服灌胃后6 h测定的荧光素-异硫氰酸盐结合葡聚糖（FITC-葡聚糖FD4）体内通透性试验显示K8的通透性增加flox/flox公司; Villin-Core小鼠与K8小鼠的比较flox/flox公司鼠标（图2F） ●●●●。

肠上皮特异性K8缺乏促进年龄依赖性炎症反应

结肠炎通常与白细胞浸润有关，因此炎症反应增加[28]. 自K8起flox/flox公司; Villin-Core小鼠出现与结肠炎相似的轻度腹泻、结肠上皮损伤和屏障阻断，我们接下来对这些小鼠的炎症介质和免疫细胞水平进行了表征。在3至8个月大的K8中未观察到主要的全身炎症flox/flox公司; 作为循环炎症介质的Villin-Core小鼠，趋化因子配体2（CCL-2）、TNF、干扰素（IFN）γ、IL-6、IL-5和IL-18接近基础水平，只有IL-1β与K8相比有统计学意义，但仍适度增加flox/flox公司（补充图5A）。此外，K8患者的IL-22血清水平平均略高flox/flox公司; Villin-Core与K8对比flox/flox公司，但未达到统计显著性(P（P） = 0.099），而IL-25低于检测限（3.8 pg/ml）。相比之下，K8–/–与K8相比，小鼠血清中IL-1β、TNFα、IL-6、IL-5、IL-22水平升高，IL-18水平降低+/+小鼠（补充图5D）。K8的局部结肠炎症没有明显增加flox/flox公司; 由于巨噬细胞和T细胞生成物质（如CCL-2、IL-1β、IL-4和IL-6）的mRNA水平在总结肠裂解物中不受影响，因此也可以发现绒毛状细胞小鼠（补充图5B）。K8中IL-18 mRNA的合成flox/flox公司; 绒毛-Cre结肠略有减少，表明T细胞和抗原呈递细胞的数量或活性没有显著增加（补充图5B）。组织学分析显示粘膜肌层内无大量单核细胞或中性粒细胞流动，这一发现得到了支持（图2G） ●●●●。尽管平均水平稍高，但髓过氧化物酶（MPO）mRNA水平（补充图5B）或MPO在统计学上没有显著增加+ 细胞（补充图5C），支持结肠中性粒细胞数量接近K8的基础水平flox/flox公司; 绒毛鼠。

然而，在10至15个月大的K8中flox/flox公司; 与年龄匹配的K8小鼠相比，Villin-Core小鼠结肠炎症表型变得更为显著flox/flox公司体重大致相同的小鼠（图三A） ●●●●。这被视为 ~ 结肠缩短15%，结肠内淋巴细胞聚集物数量增加三倍（图三B、 D、E）。有趣的是，较老的K8flox/flox公司; 与年龄匹配的K8小鼠相比，Villin-Core小鼠的窝长仅略有增加flox/flox公司（图三C） 但仍显示隐窝和上皮糜烂（图三F） ●●●●。两个控制K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; 绒毛样衰老小鼠的某些循环细胞因子上调，尤其是IL-22、IL-25和TNFα（图三G） 与3-8个月大的小鼠相比（参见补充图5A）；然而，由于K8年龄段个体差异较大，基因型之间没有差异flox/flox公司; 除IL-18外，Villin-Core小鼠在10至15个月大的K8中IL-18水平较低flox/flox公司; Villin-Core与对照组比较（图三G） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig3_HTML.jpg

K8丢失诱导的炎症表型在250天以上的小鼠中更为明显。K8公司flox/flox公司和K8flox/flox公司; 对250天龄以上的Villin-Core雄性和雌性小鼠的体重进行分析，点表示单个小鼠(一个)，冒号长度(B类)，平均地穴长度(C类)结肠纵行切口淋巴细胞聚集的数量(D类)和淋巴聚集物的平均面积(E类).F类老K8的代表性结肠切片flox/flox公司; Villin-Core小鼠，黑色箭头显示淋巴聚集，绿色箭头显示上皮细胞侵蚀。比例尺200µm。G公司血清细胞因子IFNχ、IL-1β、TNFα、IL-5、IL-6、IL-25、CCL-2 IL-22和IL-18的循环浓度 > 使用Luminex免疫分析法测量250天龄小鼠。方框从第25个百分位延伸至第75个百分位数，线条表示中间表达值，胡须表示最小值和最大值，单个小鼠值表示为点。P（P）值和星号(*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01）表示统计差异，使用Student’st吨测试。n个 = 3–5

2-脱氧-2-[18F] 氟葡萄糖位置发射断层成像检测K8肠道下部代谢活动增加flox/flox公司; 绒毛鼠

为了分析炎症状态下结肠中增加的代谢活性，K8flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/flox公司给小鼠注射2-脱氧-2-[18F] 氟葡萄糖([18F] FDG）。体内正电子发射断层扫描（PET）分析显示[18F] K8中的FDG累积flox/flox公司; Villin-Core与K8对比flox/flox公司冒号（图4A、 B）。这个18PET成像后体外收集的不同器官中的F-放射性测量证实K8的放射性增加了三倍flox/flox公司; Villin-Core结肠与K8的比较flox/flox公司回肠中的摄取量略有下降。其他被研究的器官在这两种基因型中的吸收量相当（图4B） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig4_HTML.jpg

K8公司flox/flox公司; Villin-Core小鼠的下消化道代谢活性增加，使用[18F] FDG-PET体内和体外成像。K8公司flox/flox公司和K8flox/flox公司; 给Villin-Core小鼠（7-8个月大）注射[18F] 尾静脉FDG，1小时后成像。一个 18在活体外的血液、血浆、红细胞、结肠、盲肠、回肠、空肠、十二指肠、胃和肝脏以及活体内的肾脏和大脑中测量了F-放射性。在K8的结肠和回肠中观察到显著的放射性flox/flox公司; Villin-Core小鼠与K8小鼠的比较flox/flox公司老鼠。横条代表平均SUV ± SD和单个小鼠的值显示为点。B类有代表性的图像显示，肠道下部的代谢活动增加，箭头突出显示结肠组织的活动增加。SUV是标准摄取值。P（P）值代表基因型之间的差异，使用Student’st吨测试***P（P） < 0.001之间。n个 = 三

肠K8缺失导致结肠细胞分化改变和增殖增加

接下来，我们分析了肠道特异性K8缺失是否影响结肠细胞分化和增殖水平。根据周期性酸性Schiff（PAS）染色定量结肠杯状细胞（图5成年小鼠的A–C）表明，K8中每个窝的PAS阳性细胞数量增加flox/flox公司; Villin-Core结肠。当杯状细胞的数量标准化为隐窝长度时，远端结肠的每毫米密度显著高于近端结肠（图5C） ●●●●。杯状细胞蛋白粘蛋白2（Muc2）的增加支持了K8杯状细胞的总体数量增加flox/flox公司; Villin-Cre小鼠（图5楼). K8组绒毛蛋白水平下降flox/flox公司; Villin-Core小鼠，表明肠细胞减少（图5F） 以及结肠细胞K8依赖性的细胞命运转移。已经证明K8与Notch1相互作用并影响其活性，从而将结肠分化从肠细胞转变为杯状细胞17接下来，我们分析了条件K8敲除模型中的全长Notch1（FLN）和Notch1胞内结构域（NICD）蛋白水平。三苯氧胺处理的K8中FLN而非NICD蛋白水平降低flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间小鼠（补充图6C、D）。此外，K8中的FLN免疫染色flox/flox公司和K8flox/flox公司; 在K8中，绒毛-核心近端和远端结肠的荧光强度降低flox/flox公司; 绒毛鼠（补充图6E）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig5_HTML.jpg

结肠局部角蛋白缺乏伴有细胞增殖增加和杯状细胞增多。一个代表性远端和近端K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; PAS染色的Villin-Core结肠图像。比例尺=50µm。 B类每个地穴的杯状细胞数量和C类PAS染色的K8结肠远端和近端的每毫米隐窝flox/flox公司，K8flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/–; 绒毛鼠(n个 = 3).D类，E类代表性Ki67标准K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; Villin-Core结肠图像和每毫米Ki67阳性有丝分裂体的差异2基因型之间(n个 = 6） 。箭头表示C中有丝分裂体；方框从25%延伸至75%，线条代表中位值和胡须最小值和最大值D类.比例尺=µm。F类粗略分离的K8结肠上皮裂解物flox/flox公司（1-3车道），K8flox/flox公司; Villin-Core（4-6车道）和K8flox/–; Villin-Cre（泳道7-9）小鼠(n个 = 3） 对Muc2、Villin、p-pRb、pRb，p-STAT3、STAT3，IL22BP和K8进行免疫印迹。Hsc70被用作负荷控制。G公司IL-22BP、p-STAT3和p-pRb免疫印迹被定量并标准化为Hsc70（IL-22BP）、STAT3（p-STAT3）或pRb（p-pRb）。方框从第25个百分位延伸至第75个百分位数，线条表示中间表达值，胡须表示最小值和最大值，单个小鼠值表示为点。P（P）值代表基因型之间的差异，通过单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey多重比较测试确定*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

分析K8flox/flox公司; 绒毛囊长度增加是由于过度增殖所致，我们分析了Ki67的数量+ 结肠隐窝内有丝分裂体（图5D、 E）。Ki67的除数+ K8细胞显著增加flox/flox公司; 绒毛-核心小鼠上皮，但不在K8中flox/−; Villin-Core（图5D、 E），表明在该模型中，两个结肠细胞K8等位基因的丢失是诱导上皮细胞过度增殖所必需的。为了研究K8依赖性上皮细胞增殖背后的信号转导，通过分析STAT3（酪氨酸705）的磷酸化以及上游IL-22BP蛋白（一种限制IL-22信号转导的IL-22结合蛋白）的水平来评估STAT3通路的活性，进一步增加肠上皮STAT3的活化[29]从而增加了扩散。结肠IL-22BP水平显著降低，p-STAT3水平（图5F、 G）及其STAT3靶基因S100A11（附图6A）在K8中增加flox/flox公司; 绒毛-核心上皮，但不在K8中flox/−; 与K8相比，Villin-Coreflox/flox公司控制。在他莫昔芬治疗的K8出现K8缺失25天后，发现类似的IL-22BP丢失和STAT3激活flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间小鼠（补充图6C、D）。接下来，我们分析了核视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的磷酸化状态，pRb是细胞周期的中心负调控因子，其在丝氨酸807/811的磷酸化抑制pRb活性，从而促进细胞周期进展。事实上，在K8中p-pRb水平增加flox/flox公司; Villin-Core结肠，而K8flox/−; Villin-Core小鼠的平均水平较高，没有显著改变（图5F、 G）。pRb靶基因mRNA水平的增加可以观察到pRb通路的激活Mybl2公司单位：K8flox/flox公司; Villin-Cre小鼠结肠组织（补充图6B）.总之，肠上皮细胞K8缺失刺激结肠中的增殖途径。

局部角蛋白失调对结肠癌的发生敏感

自K8以来flox/flox公司; Villin-Core小鼠结肠隐窝长度和结肠细胞增殖显著增加，而年轻成年小鼠炎症介质的增加几乎可以忽略不计，我们评估这些变化是否仍足以影响结肠肿瘤的易感性。在未经治疗的K8中未观察到肉眼或组织学上的肠道肿瘤flox/flox公司; Villin-Core小鼠，尽管这些小鼠偶尔会出现类似于K8的直肠脱垂–/–小鼠（补充表1）。然而，AOM给药（给5个月大的小鼠10 mg/kg AOM，每周一次，持续4周，图6A） 强烈促进K8致癌flox/flox公司; 绒毛鼠（图6)首次AOM给药20周后，远端结肠平均有15个肿瘤（图6B） ，而K8flox/flox公司小鼠没有出现任何可见的肿瘤。大多数K8flox/flox公司; 绒毛癌体积范围为0.1 mm三大于10 mm三（图6C） 组织学分析显示肿瘤的上皮起源（图6E） ●●●●。AOM治疗K8的肿瘤进展flox/flox公司; Villin-Core小鼠，但不是K8小鼠flox/flox公司小鼠从第13周开始体重减轻，到第16周后直肠出血（图6A） ●●●●。经AOM处理的K8flox/flox公司; Villin-Core小鼠的循环细胞因子水平也发生了显著变化，因为与AOM处理的K8相比，IL-6、IL-22和TNFα更高flox/flox公司鼠标（图6F） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为18_2021_4081_Fig6_HTML.jpg

肠道特异性K8缺失使小鼠对化学诱导的远端结肠肿瘤发生敏感。K8公司flox/flox公司和K8flox/flox公司; Villin-Cre小鼠腹膜内注射10mg/kg AOM，每周一次，持续4周（图中箭头一个)20周后死亡。一个K8公司flox/flox公司和K8flox/flox公司; AOM治疗期间绒毛-核心体重变化显示为平均值 ± SD和#表示K8患者出现软便和便血flox/flox公司; 绒毛鼠。B类每个基因型四只小鼠结肠肿瘤的平均数量，其中方框从第25个百分位延伸到第75个百分位数，线条代表中间表达值，胡须代表最小值和最大值，个别值用点表示。C类K8的编号flox/flox公司; Villin-Core小鼠肿瘤和大小（体积计算并显示为对数刻度mm三).D类来自K8的AOM治疗后远端结肠的代表性图像flox/flox公司和K8flox/flox公司; 图中显示了Villin-Core。E类HE染色的结肠图像显示肿瘤的上皮起源，箭头表示肿瘤区域。比例尺100μm。F类在K8中测量IL-6、IL-18、IL-22和TNFα的血清浓度flox/flox公司和K8flox/flox公司; 绒毛鼠。错误条表示SD，单个鼠标用点表示。P（P）值和星号(*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01）表示使用Student’st吨测试。n个 = 4–5

讨论

在本研究中，我们证明了主要结肠细胞中间丝K8对体内结肠健康的重要性，利用从肠上皮细胞中删除主要结肠上皮II型角蛋白K8的小鼠模型。K8公司flox/flox公司; Villin-Core小鼠和K8flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间在成年小鼠中，三苯氧胺诱导25天后的小鼠没有表达肠上皮细胞K8，而其他主要的K8 I型伴侣K18、K19和K20几乎完全减少，与K8中所显示的情况类似–/–鼠标[10，11，15]. 与全K8相比，条件K8基因敲除的结肠中II型K7蛋白水平下降更为温和–/–老鼠。与之前发现的K7局限于小鼠隐窝的中部和下部相比[4，30]，本研究表明K7在正常小鼠结肠的整个隐窝中表达。在K8中flox/flox公司; Villin-Core小鼠，剩余的K7定位于顶端细胞膜上的K18和K19，表明减少的II型K7支持当K8缺失时I型角蛋白的残留存在。这些残留的角蛋白可能对维持结肠角蛋白突出的顶端膜上生存所必需的细胞完整性至关重要[31]。

使用此处开发的角蛋白缺乏的肠上皮特异性K8敲除模型，我们报告说，仅在这些细胞中K8的缺失会导致主要的结肠疾病表型，包括：（i）结肠上皮部分缺失，（ii）肠屏障受损和腹泻，（iii）代谢活性增加和（iv）一种温和的结肠炎症，在衰老小鼠中更为明显。在细胞水平上，肠特异性K8缺失导致（v）结肠细胞分化向杯状细胞命运的转移，这与Notch1降低有关；（vi）增殖和再生能力增强，表现为隐窝变长，偶尔脱垂，细胞增殖信号增强，以及（vii）对化学诱导的结直肠癌的敏感性急剧增加。由于K8也在小鼠的肝脏和子宫中表达[三]，此外，母K8flox/flox公司; 与K8相比，Villin-Core小鼠可生育，未观察到胚胎致死–/–老鼠[10，11]. 这些发现证实了结肠K8flox/flox公司; 绒毛-Cre表型仅由肠上皮细胞角蛋白诱导。由于结肠过度增殖[11]，单元格命运开关[17]和肿瘤发生易感性[18]在完整的K8中描述–/–与此处描述的肠上皮特异性K8小鼠非常相似（补充表1和表2中列出了结肠疾病和分子表型的比较），当前的研究强烈强调了结肠上皮角蛋白对结肠健康和体内平衡的重要性。

K8之间的一个显著差异flox/flox公司; 维尔林·科尔和K8–/–小鼠模型为免疫细胞活性。K8公司flox/flox公司; Villin-Core只有轻微的全身或局部免疫反应，循环IL-1β和IL-22略有增加，结肠中表达MPO的中性粒细胞数量没有改变。尽管有明显的上皮损伤，结肠粘膜中免疫细胞数量和基因表达的变化仍低得惊人，而K8–/–小鼠淋巴细胞和中性粒细胞浸润[13，15]. 相比之下，较老的K8flox/flox公司; 与年龄匹配的对照组和年轻K8小鼠相比，Villin-Core小鼠的结肠炎表型更加明显，结肠缩短，结肠中淋巴细胞聚集物数量增加flox/flox公司; 绒毛鼠。尽管如此，这些变化并没有引起活跃的Th2型炎症[13]如未改变的循环IL-5和IL-25浓度所示。K8公司flox/flox公司; Villin-Cre至少活了15个月，没有任何其他早衰迹象。

衰老本身也可以调节上皮角蛋白水平[5]但其对免疫细胞的影响尚未得到很好的研究。一些循环细胞因子如TNFα和IL-25的增龄增加可能与巨噬细胞和T细胞以及结肠微生物群中的亚群变化的增龄变化有关[32–34]. 重要的是，可以假设K8中更强大和早期的炎症反应–/–小鼠结肠[13]至少部分反映在其他角蛋白缺乏的简单上皮器官衰竭，如肝脏中描述的主要组织脆性[35，36]. K8系列–/–小鼠不仅出现了大肠杆菌样表型，而且还出现了变化，例如葡萄糖代谢、胰岛素分泌和肝脏脆性，从而模糊了结肠表型的成因[19，20]. 我们也不能排除不同背景小鼠菌株在K8中的作用–/–（FVB/n）和肠道特异性K8基因敲除模型（C57Bl6），因为已知菌株之间存在免疫学差异[37]是将炎症表型与K8-全敲除模型进行比较的研究的局限性。K8–/–小鼠以前被列为IBD小鼠模型[38]尽管有轻微的炎症介质表型，K8flox/flox公司; Villin-Core小鼠也与IBD有显著的相似性，包括上皮损伤、隐窝形态计量学变化、过度增殖和屏障性能下降。

我们在此报告，肠上皮特异性K8-缺陷小鼠对AOM诱导的结直肠癌显著高度敏感。根据这些数据，我们可以得出结论，K8中描述的致瘤表型–/–不是由于AOM代谢的肝脏中缺少K8引起的[18]. 这也支持结肠上皮中角蛋白的数量与结肠炎易感性呈负相关[30]和炎症诱导的结直肠癌[39]. 角蛋白缺乏小鼠对结肠肿瘤发生的敏感性可能与此处所述结肠上皮中观察到的过度增殖和增殖细胞信号有关。结肠细胞K8的缺失降低了IL-22BP蛋白水平并激活了STAT3，与K8早期的观察结果类似–/–结肠[18]. IL-22BP，也称为IL-22RA2，是一种可溶性高亲和力IL-22受体，由包括结肠上皮细胞在内的不同细胞类型产生[40，41]其关键作用之一是中和过度的IL-22信号[29]. 在这里，角蛋白丢失后IL-22通路的激活伴随着组织水平IL-22合成的显著增加和循环浓度的轻微升高，尽管仅在AOM治疗的小鼠中显著。IL-22由各种免疫细胞产生[42]它在结肠中具有多种保护和有害作用。IL-22激活上皮细胞STAT3信号通路[43]通过上调其靶基因也可以看出这一点。STAT3是已知的转录因子之一，调节细胞增殖、组织再生和存活，但也参与IBD和CRC的发病机制[44，45]从而将角蛋白功能障碍与肿瘤发生联系起来。最近关于IBD中IL-22信号调节的研究集中于产生IL-22BP的各种免疫细胞亚群的作用[46，47]. 然而，IL-22BP与肠上皮K8的密切关系[18]免疫细胞中不表达的IL-22BP，促使人们考虑上皮细胞产生的IL-22 BP是否比先前假设的对结肠内环境稳定具有更重要的作用。一个有趣的发现是，IL-18在年轻人的肠上皮特异性K8-缺陷结肠组织中，在老龄小鼠的全身水平上下调，而在K8-缺乏AOM治疗的小鼠中平均下调。IL-18水平下调可能表明炎症小体活性降低[48]可能有助于K8对肿瘤的敏感性和适度的炎症反应flox/flox公司; 绒毛鼠。为此，我们之前已经证明K8与炎症小体复合，因此可以调节炎症小体的活性[18]. 我们的结果也强调了结肠组织在IL-18生成中的作用[49]。

重要的是，我们的数据显示，进一步将角蛋白与结肠增殖联系在一起，K8促进细胞周期抑制剂pRb的活性，当结肠细胞K8被删除时，pRb磷酸化增加，促进细胞周期进展，如靶基因合成所示。细胞质角蛋白如何影响pRb磷酸化以特异性调节细胞周期尚不清楚；然而，它可能涉及结肠细胞角蛋白与核膜和膜相关蛋白的相互作用[50]，已知其反过来调节pRb活性[51，52]. 值得注意的是，角蛋白可以通过14-3-3（一种主要的细胞周期调节因子）影响增殖。事实上，已经证明K18可以通过与14-3-3的相互作用和结合而起到有丝分裂的驱动作用[53]. [18F] FDG-PET显像显示K8的代谢活性增加flox/flox公司; Villin-Cre小鼠结肠，可能是由过度增殖的上皮细胞和免疫细胞活性的低水平增加诱导的，从而表明角蛋白缺乏如何调节代谢，这也是先前提出的[16，54]. 条件和完全K8基因敲除小鼠的肠上皮K8缺乏不仅导致分裂细胞增加，而且导致细胞分化程序以Notch依赖性的方式向杯状细胞转移[17]. 有趣的是，肠类器官中IL-22的增加可抑制Notch信号传导，导致跨扩增细胞区分裂扩大和杯状细胞增生[55]这表明IL-22对上皮细胞增殖和分化具有集落细胞固有效应，并支持K8在这一途径中发挥更直接的作用，而不能排除其他参与途径。综合考虑结肠局部角蛋白缺乏刺激IL-22活性和IL-22BP下调，从而促进增殖和生存信号传导，从而对致癌敏感。值得注意的是，白细胞的主要参与并不是这个过程的必要条件。

总之，我们表明结肠细胞角蛋白丝在维持上皮屏障完整性、调节结肠细胞周期和再生信号通路、维持平衡细胞增殖和随后的肠上皮更新方面可能具有机械、细胞自主功能。平衡增殖能力时，结肠细胞K8可直接或间接抑制结直肠癌的发生。未来的研究也应该受益于这里开发的肥沃和非致命的K8flox/flox公司; 大肠疾病相关药物研究的Villin-Core模型。

材料和方法

实验动物

转基因K8flox/flox公司C57BL/6背景下的动物由Ozgene（美国马萨诸塞州剑桥市）（补充图1）通过侧翼外显子3与loxP位点以及新霉素选择片段与C57BL/6胚胎干细胞中FRT位点产生。然后使用flp重组酶去除新霉素片段，使loxP位点保持完整的侧翼外显子3（K8flox/flox公司). 然后生成肠上皮特异性K8敲除小鼠，K8flox/flox公司用Villin-Cre1000或Villin-CreER培育小鼠t2时间C57BL/6背景的小鼠[26]. 有条件的小鼠通过繁殖K8来维持flox/flox公司K8小鼠flox/−; Villin-Core或K8flox/flox公司; Villin-Core或通过繁殖K8flox/flox公司带K8flox/flox公司; 维尔林·克莱尔t2时间使用PuReTaq Ready-To-Go（RTG）PCR Beads（英国GE Healthcare）和引物5′-GCGTGTTGGGATTAGATTAG-3′和5′-CCTCCACATGTTTTATCC-3′（用于flox转基因）和5′-GCCGATCCTATTTCCATGA-3′和5’-TCGGAGCAACGTGATGATG-3′（用于Cre转基因）对小鼠进行基因分型。根据小鼠的结肠表型，将其分为两个年龄组，此处称为3-8月龄成年小鼠和10-14月龄老年小鼠，如图图例所示。年龄和性别匹配的成人全身K8−/−小鼠及其野生型同胞（FVB/n背景）[11]也进行了研究。

小鼠被安置在图尔库大学中央动物实验室，并根据芬兰南部省政府批准的动物许可证（3956/04.10.07/2016和ESAVI/16359/2019）进行治疗。用一氧化碳对小鼠实施安乐死2吸入，然后心内穿刺采血。切除结肠并测量长度。组织要么快速冷冻并储存在液氮中，固定在4%PFA中，然后进行石蜡包埋，要么包埋在最佳切割温度复合物（OCT）中（Sakura Finetek，荷兰），并保持在−80°C。收集近端结肠（PC）和远端结肠（DC）进行蛋白质和RNA分析、组织学和免疫组织化学。粗略分离的结肠上皮（如前所述[16])收集回肠和肝脏进行蛋白质分析。

三苯氧胺诱导小鼠K8缺失

通过将30 mg他莫昔芬溶解在0.2 ml EtOH中，并用玉米油（Sigma-Aldrich，CA，USA）进一步稀释至1.8 ml，以达到15 mg/ml的浓度，制备他莫昔酚（Sigma-Aldrich，CA，US）溶液。制备含EtOH和玉米油的溶媒溶液。3-5个月大的成人K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; 维尔林-科雷-埃尔t2时间小鼠每天腹腔注射1.5毫克他莫昔芬或溶媒溶液，连续5天。第一次注射后25天处死小鼠。

氮氧甲烷诱发结肠癌变

对于AOM诱导的CRC模型，5个月大的K8flox/flox公司和K8flox/flox公司; 每周向Villin-Core小鼠腹腔注射10 mg/kg剂量的AOM（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）0.9%氯化钠溶液，持续4周，并在首次给药AOM后20周处死。每周监测小鼠健康状况和体重的变化。杀死后，肉眼观察结肠肿瘤的数量，确定为球形肿瘤及其体积(V（V）)假设为球形，使用公式进行量化V（V） = 4/3 × π × 第页三，并进行组织学处理。

疾病活动分析

K8患者的疾病活动以粪便稠度和直肠出血为衡量指标flox/flox公司; 绒毛样小鼠，三苯氧胺诱导的K8flox/flox公司; 维尔林-科雷-埃尔t2时间小鼠和AOM处理的小鼠与之前描述的小鼠相似[30]. 大便稠度得分为1 = 正常；2 = 成形但柔软；三 = 稍松；4 = 液体的或不能排泄的。出血评分为0 = 无；1 = 粪便中有少量血液；2 = 整个颗粒中发现的血液；三 = 肛门处凝血；4 = 新出血。

FITC–右旋糖酐FD4体内渗透性测定

采用异硫氰酸荧光素结合葡聚糖（4 kDa；FITC–葡聚糖，FD4，TdB Consultancy AB，Uppsala，Sweden）通过口服60 mg/kg体重的FD4来评估成年小鼠的肠道通透性(n个 = K8为4flox/flox公司K8为6flox/flox公司; Villin-Core）禁食8小时。给药6 h后处死小鼠，通过心脏穿刺采集血液，并离心血液样本（1500 rpm，10 min）以收集血清。将血液和血清样品置于暗处。使用Victor2平板读数器（PerkinElmer Inc.，Finland，Turku）在激发493nm和发射520nm下，从PBS中以1:5稀释的血清中测量FD4值。根据标准曲线计算FD4浓度。

组织学评价和免疫组织化学

用4%PFA（pH 7.4）固定经径向切割的结肠样品、肝脏、胆囊、肾脏和子宫样品，并将其嵌入石蜡中，然后切割成4µm厚的切片，进行苏木精和伊红（HE）染色和周期性酸性希夫（PAS）染色（图尔库疾病建模中心组织学服务单位）。从每只小鼠结肠近端和远端的10个HE染色的隐窝中量化平均隐窝长度。无隐窝区表示结肠粘膜部分上皮明显侵蚀，无隐窝结构，根据粘膜肌层计算，占结肠总周长的无隐窝%。在20个随机选择的PAS染色的矢状方向隐窝中计算每个结肠隐窝的杯状细胞数。通过将每个地穴的杯状细胞数除以每个地穴从上到下的总长度来测量杯状细胞密度。

用Leica CM3050S或CM1950 Research Cryostat（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）将OCT包埋样品切割成6μm的切片，并用−20°C丙酮固定10分钟，然后按照前面所述进行染色[56]. 使用补充表1中列出的抗体进行切片的免疫荧光染色，并使用核标记DRAQ5（Cell Signaling，MA，USA）或DAPI（Invitrogen，CA，USA）进行复染。Ki67（SolA15）是使用DAB结合二级抗体和苏木精作为副染色进行检测的（Turku疾病建模中心组织学服务单位）。使用蔡司LSM780和徕卡TCS SP5（德国韦兹拉）共焦显微镜（德国耶拿）以及Pannoramic 1000和Pannoramic-MIDI幻灯片扫描仪（匈牙利布达佩斯3DHISTECH）拍摄图像。通过计数每毫米结肠上皮中Ki67阳性有丝分裂体的数量来测量分裂上皮细胞的密度2使用CaseViewer数字显微镜应用程序（3DHISTECH）对相应的上皮区域进行检查。使用QuPath v0.2.3程序计算MPO阳性细胞[57]. 简单地说，内部区域（粘膜肌层腔）是手动选择的。使用细胞检测工具根据细胞核染色和大小鉴定细胞，并根据AF568（MPO的第二抗体）的细胞强度确定MPO阳性，使用预先确定的截止值排除可能的背景(n个 = 6，男女人数相等）。在纵向切割的HE染色全结肠样本中计算结肠中淋巴细胞聚集物的数量及其面积。

SDS-page和western blot

在0.187 M Tris–HCl、pH 6.8、3%十二烷基硫酸钠、5 mM EDTA、1 × 完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（瑞士罗氏）和1 mM苯甲基磺酰氟冰。随后使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（美国马萨诸塞州Wlatham的Thermo Fisher Scientific公司）测量蛋白质浓度。样品用3稀释至5µg蛋白质/10µl × Laemmli样品缓冲液（30%甘油，3%十二烷基硫酸钠，0.1875 M Tris–HCl，pH 6.8，0.015%溴酚蓝和3%β-巯基乙醇），并在6–15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上与iBright™预染色蛋白阶梯（Thermo Fisher Scientific，Wlatham，MA，USA）或Precision Plus蛋白质双色标准（Bio-Rad，CA，USA。将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，并通过western blotting进行分析（一级和二级抗体列在补充表3和4中），如前所述，使用ImageJ软件（美国马里兰州国立卫生研究院）对蛋白质带进行量化[58]并标准化为加载控件。

基因表达分析

使用NucleoSpin®RNA试剂盒（德国马切里-内格尔）从总结肠裂解液中分离出RNA，并在1%琼脂糖凝胶上分析RNA质量。使用cDNA合成试剂盒（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）将RNA样本反向转录成cDNA。使用QuantStudio™3实时PCR系统（美国加利福尼亚州Applied Biosystems™）、Taqman基因表达分析或设计的引物以及SensiFAST SYBR Hi-ROX Kit（美国俄亥俄州辛辛那提市Meridian Bioscience）扩增感兴趣的基因（补充表5和6）。将基因表达归一化为β-肌动蛋白和核糖体S18，并根据δ-δ-Ct法分析基因型之间的差异。

细胞因子蛋白测量

根据制造商的说明，使用Procartaplex多重分析法（ThermoFisher Scientific，Vienna，Austria）分析血清中循环IL-1β、IL-5、IL-6、IL-18、IL-22、IL-25、CCL2、干扰素γ（IFNγ）和TNFα的浓度。血清样本离心（9600×克，10分钟），然后使用Luminex 200系统（Luminex Corporation，Austin，TX，USA）测量细胞因子浓度，并根据分析试剂盒中的蛋白质标准进行量化。

体内正电子发射断层成像

K8公司flox/flox公司; Villin-Core和K8flox/flox公司用2.5%异氟烷麻醉平均体重分别为26.1g和33.3g的对照小鼠（成年7-8月龄雌性），并用加热垫保持体温。在使用计算机断层成像模式（X-Cube，Molecubes，Gent，Belgium）进行衰减校正的透射扫描后，以三维列表模式（β-Cube；Molecubes，Gent，Belgium）采集正电子发射断层成像（PET）扫描。向小鼠注射8.5（7.8–9.2）MBq[18F] FDG注入尾静脉（Turku PET中心，芬兰Turku）。采集20分钟长的静态扫描，并使用OSEM二维迭代算法进行重建。扫描后，处死小鼠，通过心脏穿刺采集血样，取出组织并称重。对样品进行测量18γ计数器中的F-放射性（2480 WIZARD2，PerkinElmer，Turku，Finland）。对测量的放射性进行衰变和背景校正，并表示为标准吸收值（SUV）。

统计分析

未配对后确定两组之间的统计学显著性t吨测试*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001. 在两组以上的比较中，使用了单向方差分析和Tukey的post-hoc或Kolmogorov–Smirnov检验。Prism和Adobe Illustrator用于生成图形。

补充信息

以下是电子补充材料的链接。

致谢

这项工作由芬兰科学院315139/332582（DMT）和#310011（KV）资助，Sigrid Juselius基金会，AU AU细胞力学研究卓越中心，EuroCellNet COST Action（CA15214）（DMT；Medicinska Understerödsföreningen Liv och Hälsa基金会（DMT；CGAS）；由奥非大学的Turku分子生物科学博士项目、瑞典文化基金会、Victoriastiftelsen、Agneta和Carl-Erik Olin基金会以及K.Albin Johansson基金会（CGAS）提供。我们感谢Toivola实验室的所有其他成员，特别是Jimmy Fagersund、Akmal Nipu和Frank Weckström对实验室的支持。成像是在细胞成像和细胞计量中心、图尔库大学图尔库生物科学中心、奥博阿卡德米大学和芬兰生物中心进行的，组织学样品制备是在芬兰图尔库大学图尔库疾病建模中心组织学服务部进行的。

缩写

AOM公司氮氧甲烷
CCL-2型趋化因子（C–C基序）配体2
CRC公司大肠癌
直流远端结肠
FDG公司氟葡萄糖
高等教育苏木精和曙红
中型散货箱炎症性肠病
如果中间灯丝
干扰素γγ干扰素
K角蛋白
多功能操作髓过氧化物酶
FLN公司全长槽口1
新生儿重症监护室Notch1细胞内结构域
十月最佳切削温度复合
对磷酸化
PAS公司周期酸Schiff
个人计算机近端结肠
聚酯正电子发射断层成像
卢比视网膜母细胞瘤蛋白
瑞典克朗单纯上皮角蛋白
运动型多用途汽车标准化摄取值
维尔林·科尔Villin-Cre1000型

作者贡献

所有作者，尤其是C-GAS、MT、LP和DMT，都对研究概念和设计做出了贡献。材料准备、数据收集和分析由C-GAS、MT、TJG、MAI、LP和DMT执行。手稿的初稿由C-GAS、LP和MT撰写，所有作者都对手稿的前几个版本发表了评论。所有作者阅读并批准了最终手稿。

基金

阿布·阿卡德米大学（Abo）提供的开放获取资金。

数据可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

代码可用性

不适用。

声明

利益冲突

作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。

道德认可

小鼠被安置在图尔库大学中央动物实验室，并根据芬兰南部省政府批准的动物许可证（3956/04.10.07/2016和ESAVI/16359/2019）进行治疗。

同意参与

不适用。

出版同意书

不适用。

脚注

出版说明

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

工具书类

1Groschwitz KR，Hogan SP。肠屏障功能：分子调控和疾病发病机制。过敏临床免疫学杂志。2009;124：3–22.doi:10.1016/j.jaci.2009.05.038.肠道。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
2Polari L，Alam CM，Nyström JH，等。结肠中的角蛋白中间丝：上皮内稳态的卫士。国际生物化学与细胞生物学杂志。2020年；129：105878.doi:10.1016/j.biocel.2020.105878。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
三。Moll R、Franke WW、Schiller DL等。人类细胞角蛋白目录：正常上皮、肿瘤和培养细胞的表达模式。单元格。1982;31:11–24. doi:10.1016/0092-8674（82）90400-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
4周强，Toivola DM，Feng N，等。角蛋白20有助于维持肠上皮的中间丝组织。分子生物学细胞。2003;14:2959–2971. doi:10.1091/mbc。E03号机组。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
5Helenius TO、Antman CA、Asghar MN等。角蛋白在肠道疾病相关应激反应中发生改变。细胞。2016;5：1-19.doi:10.3390/cells5030035。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
6Omary MB，Ku NO，Strnad P，Hanada S.致力于揭示人类疾病中简单上皮角蛋白的复杂性。临床投资杂志。2009;119:1794–1805. doi:10.1172/JCI37762。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
7Toivola DM、Boor P、Alam C、Strand P.角蛋白在健康和疾病中的作用。当前操作细胞生物学。2015;32:73–81. doi:10.1016/j.ceb.2014.12.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
8Owens DW、Wilson NJ、Hill AJM等。在炎症性肠病患者中观察到干扰纤维组装的人类角蛋白8突变。细胞科学杂志。2004;117：1989年至1999年。doi:10.1242/jcs.01043。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
9陶国忠，斯特纳德·P，周强，等。炎症性肠病角蛋白多肽8和19变异体的分析。临床胃肠肝素。2007;5:857–864. doi:10.1016/j.cgh.2007.02.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
10Baribault H、Price J、Miyai K、Oshima RG。缺乏角蛋白8的小鼠的中期致死率。基因开发。1993;7:1191–1202. doi:10.11101/gad.7.7a.1191。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
11Baribault H，Penner J，Iozzo RV，Wilson-Heiner M.角蛋白8-缺乏FVB/N小鼠的结肠增生和炎症。基因开发。1994;8:2964–2973. doi:10.101/gad.8.24.2964。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
12Toivola DM、Krishnan S、Binder HJ等。角蛋白通过蛋白质靶向错误调节结肠细胞电解质转运。细胞生物学杂志。2004;164:911–921. doi:10.1083/jcb.200308103。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
13Habtezion A、Toivola DM、Butcher EC、Omary MB。角蛋白-8缺乏小鼠发生慢性自发性Th2结肠炎，可接受抗生素治疗。细胞科学杂志。2005;118:1971–1980. doi:10.1242/jcs.02316。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
14Wang L，Srinivasan S，Theiss AL，等。白介素-6诱导肠上皮细胞角蛋白表达：角蛋白-8在白介素-6-诱导屏障功能改变中的潜在作用。生物化学杂志。2007;282:8219–8227. doi:10.1074/jbc。M604068200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
15Asghar MN、Emani R、Alam C等。小鼠结肠炎中活性氧和氮物种的体内成像。炎症性肠病。2014;20:1435–1447. doi:10.1097/Mib.0000000000118。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
16Helenius TO、Misiorek JO、Nyström JH等。角蛋白8缺失下调结肠细胞HMGCS2并调节结肠酮生成和能量代谢。分子生物学细胞。2015;26:2298–2310. doi:10.1091/mbc。E14-02-0736。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
17Lähdeniemi IAK、Misiorek JO、Antila CJM等。角蛋白通过Notch1信号通路调节结肠上皮细胞分化。细胞死亡不同。2017;24:984–996. doi:10.1038/cdd.2017.28。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
18Misiorek JO、Lähdeniemi IA、Nyström JH等。角蛋白8-缺失诱导的结肠炎易诱发小鼠结直肠癌，由炎症小体和IL-22途径加强。致癌。2016;37:777–786. doi:10.1093/carcin/bgw063。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
19Mathew J、Loranger A、Gilbert S等。角蛋白8/18通过对己糖激酶状态和胰岛素信号的差异调节，调节正常肝细胞和癌肝细胞的葡萄糖代谢。实验细胞研究。2013;319:474–486. doi:10.1016/j.yexcr.2012.11.011。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
20Alam CM、Silvander JSG、Daniel EN等。角蛋白8调节b细胞应激反应和正常血糖。细胞科学杂志。2013;126:5635–5644. doi:10.1242/jcs.132795。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
21Silvander JSG、Kvarnström SM、Kumari-Ilieva A等。角质蛋白调节β细胞线粒体形态、运动和体内平衡。美国财务会计准则委员会J。2017;31:4578–4587. doi:10.1096/fj.201700095R。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
22Tao GZ，Toivola DM，Zhong B，等。角蛋白-8缺失小鼠对结石性饮食诱导的损伤具有不同的胆囊和肝脏敏感性。细胞科学杂志。2003;116：4629–4638。doi:10.1242/jcs.00782。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
23Jaquemar D、Kupriyanov S、Wankell M等。角蛋白8对胎盘屏障功能的保护。细胞生物学杂志。2003;161：749–756。doi:10.1083/jcb.200210004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
24Odaka C、Loranger A、Takizawa K等。角蛋白8是维持胸腺上皮结构所必需的。《公共科学图书馆·综合》。2013年doi:10.1371/journal.pone.0075101。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
25Toivola DM、Habtezion A、Misiorek JO等。角蛋白8或18的缺乏促进衰老雄性小鼠抗线粒体自身抗体的形成。美国财务会计准则委员会J。2015;29:5081–5089. doi:10.1096/fj.14-269795。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
26El Marjou F、Janssen KP、Chang BHJ等。肠道上皮中组织特异性和诱导性Cre介导的重组。起源。2004;39:186–193. doi:10.1002/gene.20042。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
27Freeman T、Dixon A、Campbell E等人（1998），小鼠基因的表达图谱。In:MGI直接提交数据。可在http://www.informations.jax.org/reference/J:46439
28Bain CC，Mowat AM。巨噬细胞在肠道内稳态和炎症中的作用。免疫学评论。2014;260:102–117. doi:10.1111/imr.12192。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
29Huber S、Gagliani N、Zenewicz LA等。IL-22BP受炎症小体调节，并调节肠道肿瘤发生。自然。2012;491:259–263. doi:10.1038/nature11535。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
30Asghar MN、Silvander JSG、Helenius TO等。角蛋白的数量对结肠上皮的应激保护至关重要。《公共科学图书馆·综合》。2015;10：e0127436.doi:10.1371/journal.pone.0127436。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
31Schwarz N，Windoffer R，Magin TM，Leube RE。活小鼠胚胎角蛋白网络形成、周转和重组的解剖。科学代表。2015;5：1-8.数字对象标识代码：10.1038/srep09007。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
32Kim SJ、Kim SE、Kim AR等。饮食脂肪摄入和年龄调节C57BL/6J小鼠肠道微生物群的组成和结肠炎症。BMC微生物。2019;19：1-11.数字对象标识代码：10.1186/s12866-019-1557-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
33Becker L、Nguyen L、Gill J等。巨噬细胞极化的年龄依赖性变化导致肠道神经系统炎症介导的退化。内脏。2018;67:827–836. doi:10.1136/gutjnl-2016-312940。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
34Chen H，Eling N，Martinez-Jimenez CP，等。衰老过程中淋巴结γδT细胞池内IL-7依赖性成分变化导致抗肿瘤反应失衡。EMBO代表。2019;20：1–17.doi:10.15252/embr.201847379。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
35Ku NO，Strnad P，Zhong BH，等。角蛋白让肝脏存活：突变易导致肝病，交联产生Mallory-Denk体。肝病学。2007;46:1639–1649. doi:10.1002/hep.21976。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
36Yi H，Na H，Sujin Y，等。角蛋白在消化系统中的作用：转基因小鼠模型的经验教训。组织化学细胞生物学。2018;150:351–359. doi:10.1007/s00418-018-1695-4。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
37Kim D-H、Gutierrez-Aguilar R、Kim H-J等。与饮食抵抗FVB小鼠相比，年轻的饮食敏感C57小鼠脂肪组织缺氧以及血管生成和炎症能力增加。国际J Obes（伦敦）2013;37：853–860。doi:10.1038/ijo.2012.141。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
38Erben U、Loddenkemper C、Spieckermann S等。炎症性肠病（IBD）小鼠模型中肠道炎症的组织形态学及其与男性IBD的相关性。国际临床实验病理学杂志。2016;9:408–442. [谷歌学者]
39Liu C，Liu ED，Meng YX，等。角蛋白8可降低结肠通透性，维持肠道微生物群的动态平衡，防止结肠炎和结肠炎相关肿瘤的发生。Oncotarget公司。2017;8:96774–96790. doi:10.18632/目标18241。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
40Xu W，Presnell SR，Parrish-Novak J等。可溶性II类细胞因子受体IL-22RA2是一种天然存在的IL-22拮抗剂。美国国家科学院院刊。2001;98:9511–9516. doi:10.1073/pnas.171303198。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
41Nagalakshmi ML、Rascle A、Zurawski S等。白细胞介素-22通过结肠上皮细胞激活STAT3并诱导IL-10。国际免疫药理学。2004;4:679–691. doi:10.1016/j.intimp.2004.01.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
42Mizoguchi A、Yano A、Himuro H等。IL-22级联在IBD中的临床重要性。胃肠病学杂志。2018;53:465–474. doi:10.1007/s00535-017-1401-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
43Lejeune D、Dumoutier L、Constantinescu S等。白细胞介素-22（IL-22）激活大鼠肝癌细胞系中的JAK/STAT、ERK、JNK和p38 MAP激酶途径：与IL-10共享且不同的途径。生物化学杂志。2002;277:33676–33682. doi:10.1074/jbc。M204204200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
44Durant L、Watford WT、Ramos HL等。转录因子STAT3的不同靶点有助于T细胞致病性和稳态。免疫。2010;32:605–615. doi:10.1016/j.immuni.2010.05.003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
45王毅，沈毅，王仕，等。STAT3在人类癌症和免疫系统之间的串扰中的作用。癌症快报。2018;415:117–128. doi:10.1016/j.canlet.2017.12.003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
46Kempski J、Giannou AD、Riecken K等。IL22BP介导淋巴毒素对小鼠和人类大肠肿瘤的抗肿瘤作用。胃肠病学。2020年；159：1417-1430.e3。doi:10.1053/j.gastro.2020.06.033。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
47Pelczar P、Witkowski M、Perez LG等。T细胞衍生IL-22BP在炎症性肠病中的致病作用。科学。2016;354:358–362. doi:10.1126/science.aah5903。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
48Dinarello CA、Novick D、Kim S、Kaplanski G.白细胞介素-18和IL-18结合蛋白。前免疫。2013;4：1-10。doi:10.3389/fimmu.2013.00289。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
49Williams MA、O'Callaghan A、Corr SC.炎症性肠病病因和微生物相互作用中的IL-33和IL-18。前免疫。2019;10：1-6.数字对象标识代码：10.3389/fimmu.2019.01091。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
50Stenvall C-GA、Nyström JH、Butler Hallissey C等。角蛋白与核纤层结合，调节结肠上皮细胞的增殖。BioRxiv细胞生物学。2020年doi:10.1101/2020.06.22.164467。[交叉参考][谷歌学者]
51Markiewicz E、Dechat T、Foisner R等。层蛋白A/C结合蛋白LAP2α是视网膜母细胞瘤蛋白核锚定所必需的。分子生物学细胞。2002;13:4401–4413. doi:10.1091/mbc。E02。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
52Willis ND、Cox TR、Rahman-Casañs SF等。Lamin A/C是结直肠癌的风险生物标志物。《公共科学图书馆·综合》。2008;三：e2988.doi:10.1371/journal.pone.0002988。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
53Margolis SS、Perry JA、Forester CM等。PP2A/B56δ磷酸酶在调节Cdc25释放14-3-3以控制有丝分裂中的作用。单元格。2006;127:759–773. doi:10.1016/j.cell.2006.10.035。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
54Khan AQ、Bury JP、Brown SR等。结肠癌中角蛋白8的表达与低粪便丁酸水平相关。BMC胃肠道。2011年doi:10.1186/1471-230X-11-2。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
55Zha JM，Li HS，Lin Q，等。白细胞介素22通过抑制Wnt和notch信号传导，扩张传递放大细胞，同时耗尽Lgr5+干细胞。Cmgh（立方厘米）。2019;7:255–274. doi:10.1016/j.jcmgh.2018.09.006。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
56Ku NO，Toivola DM，Zhou Q，等。细胞和组织中简单上皮角蛋白的研究。方法细胞生物学。2004;78:489–517. doi:10.1016/S0091-679X（04）78017-6。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
57Bankhead P、Loughrey MB、Fernández JA等。QuPath：数字病理图像分析的开源软件。科学代表。2017;7：1–7.数字对象标识代码：10.1038/s41598-017-17204-5。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
58Schneider CA、Rasband WS、Eliceiri KW。NIH Image to ImageJ：25年的图像分析。自然方法。2012;9：671–675。doi:10.1038/nmeth.2089。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自细胞和分子生命科学：CMLS由以下人员提供施普林格