Polycomb公司-组（Pc-G）基因是稳定抑制同源选择基因和其他发育调控基因所必需的，从而为分化程序提供“转录记忆”（参考文献综述25). 在果蝇属Pc-G基因，zeste增强剂[E（z）] (19,20)和额外的性梳(电子稳定控制系统) (12)是例外的，因为与其他基因相比，这两个基因在发育早期都是必需的果蝇属似乎具有后期功能的Pc-G基因。例如，E（z）参与一些早期作用片段gap基因的抑制(24,26).E（z）和电子稳定控制系统Pc-G基因在整个进化过程中是最保守的吗秀丽隐杆线虫基因组(17,21).E（z）在发育的前2小时快速核分裂期间，功能也会影响染色体的完整性(19). 此外，E（z）研究表明，空等位基因减少了多基因染色体中几个Pc-G蛋白的免疫染色，并导致染色质结构的普遍解聚(28)这反映在染色体断裂增加和有丝分裂指数低(11). 因此，E（z）似乎是一个多效性Pc-G基因，在表观遗传基因调控、染色体结构和生长控制方面具有功能。
哺乳动物的同源物E（z）已被分离和表征，并由小鼠中的两个基因座编码，鄂尔多斯1和鄂尔多斯2(增感剂同源物）(15,22). Ezh1和Ezh2蛋白与果蝇属E（Z）揭示了四个同源的保守区域，包括结构域I、结构域II和位于C末端SET结构域之前的富含半胱氨酸的氨基酸延伸(22). The primary difference between the鄂尔多斯基因座似乎位于它们的表达谱中鄂尔多斯2主要在胚胎发育期间表达，而鄂尔多斯1在成人组织中更为丰富(22).
遗传和生物化学证据果蝇属小鼠支持两种不同的Pc-G复合物的存在，而eed-Ezh2定义了一种复合物(33,37)和Pc-G蛋白如Bmi-1和Polycomb构成另一种(2).电子设备是小鼠的同源物果蝇属Pc-G基因电子稳定控制系统(32)并且是小鼠原肠胚形成所必需的(8). 相比之下，小鼠的基因靶向方法揭示了Bmi-1–Polycomb复合体成员的后期发育功能（参考文献综述36). 另一个Pc-G蛋白，YY1，通过与补体同源性鉴定(三)并随后被证明位于Bmi-1–Polycomb综合体内(10)并与eed互动(31). YY1在Pc-G蛋白中是独一无二的，因为它显示序列特异性DNA结合活性(三)，中断了年1导致围植入期死亡(7).
E（Z）是的原始成员果蝇属定义进化上保守的SET结构域的染色质调节因子（参考文献综述18). 哺乳动物SU（VAR）3-9同源物的SET结构域最近被证明具有固有的组蛋白甲基转移酶活性(29). 虽然E（Z）相关蛋白到目前为止还没有与组蛋白甲基转移酶活性相关，但组蛋白去乙酰化酶（HDACs）1和2存在于eed-Ezh2复合物中(35)这种复合物的转录抑制是通过组蛋白去乙酰化介导的(35). Ezh蛋白通过结构域II与eed相互作用(33,37)但不自行招募HDAC(35). E（Z）相关蛋白的SET结构域已被证明是哺乳动物Sbf-1的靶点(5)，一种SET结构域结合的反磷脂酶，为Ezh在增殖和分化控制中提供链接(5). 此外，Ezh2的结构域II与原癌基因的产物相互作用Vav值(14)这表明Ezh2也可能参与信号依赖性T细胞激活。潜在角色埃兹2在B细胞和T细胞的发育和增殖中，它在胸腺和发育中的免疫系统器官中的大量表达是补充(15,22).
有强有力的证据链接鄂尔多斯2真核基因沉默的保守机制(22)以及可能的角色鄂尔多斯2在小鼠发育、生长控制和B细胞和T细胞增殖中，我们决定解决鄂尔多斯2通过生成鄂尔多斯2小鼠生殖系的无突变。
材料和方法
的产生和基因分型鄂尔多斯2突变小鼠。
鄂尔多斯2小鼠6号染色体的图谱(23). 的部分基因组克隆鄂尔多斯2(23)用于生成短（1.4 kb）和长（4.2 kb）同源臂，以生成Ezh2的前200个氨基酸与经核定位信号修饰的β-半乳糖苷酶（LacZ）的帧内融合。这个白喉毒素A(数据传输协议)使用MCI启动子控制的基因（由加利福尼亚州圣地亚哥的T.Kallunki和M.Karin提供）来选择靶向结构的随机整合，并插入同源长臂的3′。一种pGNA衍生物靶向结构，包括新霉素阳性选择基因和两个多聚腺苷化位点（见图。A） 用线性化不是I和电穿孔成不依赖饲料的CCE和依赖饲料的胚胎第14.1天（E14.1）胚胎干细胞。
靶向性和基因分型鄂尔多斯2-缺陷小鼠。（A） 的图解表示鄂尔多斯2基因组位点、替换载体和靶向鄂尔多斯2等位基因。外显子由黑匣子表示，数字表示各个外显子的起始氨基酸位置(23). 图中还显示了诊断生态RI限制位点和用于Southern blot分析的内部探针，以及用于PCR基因分型的引物对（箭头）。pA表示多腺苷酸化信号。（B） Southern印迹分析生态从杂合（het）杂交后代中分离出的RI限制性DNA。wt，野生型。（C） 杂合杂交胚胎基因组DNA的PCR分型。（D） 第7.5天野生型和鄂尔多斯2用一个鄂尔多斯2-特异性反义探针。
将ES细胞置于G418选择下，利用短臂外引物（Ezh2 PCR1，5′-GTTCTGGATCAGTGGATGGCACA；Ezh2 PCR 2n，5′-GTTGCCATGAGTGGCACC）和短臂内引物的套式反应筛选同源重组lacZ公司基因（lacZ PCR1，5′-AACCCCGTCGGATTCTCCGTGGGAAC；lacZ PCR2，5′-CTCCAGGAGATCGCACTCCAGCAC）。通过Southern blot分析证实靶向性生态RI用360-bp内部探针消化ES细胞DNA，该探针由引物Ezh2探针4f（5′-TCTGTTATGGGCATGTGC）和Ezh2探测器4r（5′-ATCTGGAATAGTGAGGC）产生。该探针检测到野生型等位基因中的3.4kb片段和目标等位基因的1.7kb片段（见图。A和B）。
E14.1靶向ES细胞用于产生嵌合小鼠。杂合小鼠进行杂交以获得鄂尔多斯2-缺陷胚胎，使用以下引物通过PCR进行基因分型：g33（5′-GTGTGATAGGCCTTCAC）和lacZ PCR1（如上）从目标等位基因中扩增580-bp片段，Ezh2 900r（5′-CAGCACCTGGGAGCCTG）和g3（5′-GAGGTTTGTCCTATGC）从野生型等位基因扩增240-bp片段（见图。A和C）。
胚胎学和组织学技术。
如其他地方所述，进行了基本的胚胎学和组织学方法(16). 在特定时间将怀孕的小鼠性交后处死，分离蜕膜，解剖胚胎。
全量RNA原位杂交分析。
一块275磅重的碎片EZH2型cDNA(22)编码330到455个氨基酸，被克隆到pGEM-3Zf载体（Promega）中，以获得正反义核糖探针。这个人类EZH2型探针包含11个与小鼠相应部分的碱基对错配（95%相同）埃兹2基因，可用于检测鄂尔多斯2抄本。如其他地方所述，对胚胎进行了全套RNA原位杂交(4).
囊胚生长和ES细胞衍生。
囊胚生长和胚胎干细胞衍生程序如别处所述进行(1).
RT-PCR检测埃兹1和埃兹2抄本。
以糖原为载体，从卵母细胞池、受精卵母细胞、桑椹胚和囊胚中制备总RNA。用随机六聚体（G.Schaffner，IMP）对上述RNA制剂和1μG总脾脏RNA进行逆转录（RT）鄂尔多斯1（E1f，5′-TGAAAATCTGAGTATGCGGC；E1r，5′-AGATACCTGGCTGTCGAAC）或鄂尔多斯2在随后的PCR中使用（E2f，5′-GCCAGAGAAAATCTG；E2r，5′-TGTGCTGGGAAATCAAGTCA）生成236-bp的产物，用于鄂尔多斯1和270-bp的产品鄂尔多斯2.鼠标Gapdh公司(30)引物（G1，5′-CGGAGTCAACGGATTGGTCAT；G2，5’-AGCTCTCCATGGTGAAGAC）用于控制反转录RNA的质量和数量。
结果
针对鄂尔多斯2轨迹。
传统的靶向方法用于灭活鄂尔多斯2小鼠6号染色体上的基因座(23). 这个鄂尔多斯2该基因被ES细胞中的同源重组破坏，用一个lacZ公司基因和a新基因（图。A） ●●●●。该靶向策略将Ezh2的前200个氨基酸与LacZ进行帧内融合。域I，eed交互区(33,37)，存在于融合蛋白中，但结构域II和C末端SET结构域在靶向时不会表达（图。D） ●●●●。Ezh2-LacZ融合蛋白不能作为鄂尔多斯2表达，因为它没有保留β-半乳糖苷酶活性（数据未显示）。饲料依赖性ES细胞的同源重组频率为11%。注射三个独立靶向克隆产生了来自两个克隆的几个高嵌合体。来源于一个靶向克隆的嵌合体使突变通过生殖系。生态杂合小鼠的RI限制性DNA从野生型位点产生3.4kb片段，从靶向等位基因产生1.7kb诊断片段（图。B） ●●●●。纯合子突变鄂尔多斯2基因导致早期胚胎死亡（见下文）。为了基因型埃兹2突变胚胎，开发了一种基于PCR的方法来检测野生型和突变等位基因。各引物对的位置如图所示。A.PCR扩增产生240 bp的内源性等位基因片段和580 bp的靶向等位基因片断（图。C） ●●●●。为了证明功能丧失等位基因的产生，对野生型和鄂尔多斯2-第7.5天胚胎缺陷，使用鄂尔多斯2-特异性反义探针；鄂尔多斯2在突变胚胎中未检测到与该反义探针杂交的转录物（图。D） ●●●●。
鄂尔多斯2是鼠标开发所必需的。
通过Southern blot分析对后代进行基因分型鄂尔多斯2杂合子交叉试验表明，小鼠没有纯合子鄂尔多斯2突变（表)，表明鄂尔多斯2是胚胎发育所必需的。为了确定鄂尔多斯2突变产生致命表型，建立定时交配，并在第7.5天和第10.5天获得胚胎。通过Southern blot分析对第10.5天胚胎进行基因分型，发现没有鄂尔多斯2鉴定出突变小鼠（表). 接下来我们分析了7.5天的胚胎。PCR基因分型表明存在埃兹2突变体，尽管只是低于孟德尔比率。PCR鉴定出的所有突变胚胎明显小于同窝卵，并分为两个不同的类别。第一类包括生长极为迟缓的胚胎，每天的大小与5.5个胚胎相似。第二类胚胎包括生长迟缓且胚胎外组织数量增加的胚胎。事实上，胚胎组织和胚外组织之间的比例明显偏斜，只有一小部分胚胎由胚胎区域组成。子孟德尔数埃兹2在出生时观察到杂合动物（表). 对来自杂合杂交或野生型-杂合杂交的第10.5天胚胎的基因分型显示杂合动物存在孟德尔比率（表和数据未显示）。这表明鄂尔多斯2杂合小鼠在妊娠中后期会出现问题。然而，这些杂合子缺陷的性质没有进一步研究。
表1
| 类别 | 总数量。 | 数量wt | 编号het | 编号null | 吸收的数量 | ND（无损检测） |
|---|
| 活产 | 82 | 45 | 37 | 0 | | |
| 胚胎（E10.5） | 19 | 4 | 6 | 0 | 9 | |
| 胚胎（E7.5） | 41 | 11 | 19 | 6 | 2 | 三 |
胚胎发育受阻和原肠胚发育失败鄂尔多斯2杂合杂交。
然后，我们对来自杂合杂交后代的第7.0天到第8.5天胚胎进行了组织学检查。分离、固定整个蜕膜，并用苏木精-伊红染色。对制备物进行切片，并对其中一种野生型胚胎进行评分（图。A） 形态异常或吸收。在第8.5天，没有发现异常胚胎，尽管观察到大量的吸收（表). 相比之下，在第7.0天到第7.5天，检测到11个异常胚胎和3个吸收。这11个假定埃兹2-缺陷小鼠分为两个不同的类别，类似于对整装制剂的分析（见上文）。最严重的生长迟缓胚胎在植入后不久停止发育，类似于5.5天的胚胎（图。B） ●●●●。这类突变体占异常胚胎的45%（11个中的5个）。其他突变体似乎开始了原肠胚形成，但没有完全形成（图。C和D）。原肠胚形成的开始由中胚层细胞的存在证实，并通过中胚层标记物的RNA原位分析验证短梗(13)在完整的零胚胎中（数据未显示）。然而，大多数中胚层样细胞似乎迁移到胚外区域，形成一个细胞隆起，推动胚胎的胚胎部分（图。C） ●●●●。图中所示的胚胎。D几乎完全由胚外组织组成，代表了一个突变体，它继续了图中所示的异常细胞迁移。C.图中所示的突变胚胎。C和D分别占异常胚胎的27%（11中的3个）。这种迟发表型类似于电子设备突变，胚胎由于形态发生运动的缺陷而不能完成原肠胚形成(9).
假定发育受阻和原肠胚发育失败鄂尔多斯2-缺乏胚胎。分离第7.0天至第7.5天的蜕膜，以5μm的厚度切片，用苏木精-伊红染色，并根据大小和形态对正常或异常进行评分。（A） 第7.5天，通过野生型胚胎的最接近矢状切面。（B至D）推定部分鄂尔多斯2在第7.0-7.5天分离出突变体。图C中的箭头突出显示了异常胚胎上异常积累的大量中胚层。显示了每张照片的不同放大倍数。缩写：A，前部；Al，尿囊素；Am，羊膜；E、 胚胎；EE，胚胎外胚层；Ec，外胎盘锥；例如，胚胎外；ExE，胚外外胚层；P、 后部；Ch，绒毛膜；VE，内脏内胚层。
表2
| 年龄 | 胚胎数量 | No.异常 | 吸收的数量 | 总数（A+R）b条 |
|---|
| E8.5段 | 22 | | 5 | 5 |
| 2.0至5.5 | 57 | 11 | 三 | 14 |
我们研究了鄂尔多斯2通过与第6.5天到第9.5天的小鼠胚胎进行全山RNA原位杂交。而对照感测探针未观察到染色（图。D） ，的鄂尔多斯2反义探针显示鄂尔多斯2整个原肠化小鼠胚胎（第6.5天；图。A） ●●●●。此表达式配置文件指示的角色鄂尔多斯2在原肠胚形成期间，与假定的缺陷一致鄂尔多斯2-上述缺陷胚胎。然而，鄂尔多斯2在小鼠发育的后期也广泛表达（E7.5至E9.5；图。B和C），建议为鄂尔多斯2在原肠胚发育后。
鄂尔多斯2在小鼠胚胎发育早期广泛表达。野生型6.5（A）天、7.5（B）天和9.5（C）天胚胎的全套RNA原位杂交分析鄂尔多斯2-特异反义探针或作为对照鄂尔多斯2-所示为特定感测探头（D）。缩写：A，前；Al，尿囊炎；Am，羊膜；Ch，绒毛膜；EE，胚胎外胚层；M、 中胚层；P、 后部。
鄂尔多斯2ES单元格派生需要。
为了进一步分析鄂尔多斯2空表型，我们决定生成鄂尔多斯2-缺乏ES细胞，这将使我们能够深入了解鄂尔多斯2通过细胞分析和嵌合体研究发挥作用。我们从杂合杂交获得的囊胚中获得ES细胞。在ES细胞条件下，扩增的胚泡的内部细胞团（ICM）被分解并接种，而滋养层被用于PCR基因分型。从62个用于ES细胞衍生的囊胚中，建立了33个ES细胞系，这些细胞系中没有一个是纯合的鄂尔多斯2突变（表). 图中显示了一个具有代表性的野生型ES细胞克隆。A.试图从空囊胚中提取ES细胞导致非ES-样细胞无法增殖，获得大空泡，随后死亡（图。B） ●●●●。ES细胞系是从野生型和杂合子胚泡中建立的，其效率约为62%（表). 有了这样的效率，我们本可以从10个空胚泡中获得6个空ES细胞系；因此，我们得出结论：鄂尔多斯2是派生ES细胞所必需的。
表3
| 组 | 总数量。 | 基因型数量
|
|---|
| 重量 | 赫特 | 无效的 |
|---|
| 胚泡 | 62 | 25 | 27 | 10 |
| ES细胞系 | 33 | 16 | 17 | 0 |
ES细胞衍生和生长潜能受损鄂尔多斯2-胚泡缺陷。在第3.5天从杂合杂交中分离出囊胚，并进行胚胎干细胞衍生（A和B）或外生长实验（C到F）。在面板A中，显示了野生型（wt）ES细胞集落，而面板B描述了来源于鄂尔多斯2无囊胚。（C至F）囊胚在体外培养7天并拍照。面板C和D显示野生型胚泡和鄂尔多斯2无囊胚。箭头指向ICM和滋养层巨细胞（GC）。每个百分比表示囊胚的比例(n个=68）显示所描述的表型（见表).
受损的生长潜能鄂尔多斯2-缺乏胚泡。
接下来我们检查了胚泡的生长潜能。囊胚培养的条件是ICM应膨胀并向外生长，而滋养层应粘附并分化为巨细胞（图。C） ●●●●。细胞接种后在培养基中保存7天，拍照记录，然后通过PCR进行基因分型。75%的野生型囊胚和51%的杂合型囊胚发育正常，而空白囊胚只有18%（表; 图。D） ●●●●。无效胚泡未能正常扩展，表现出三种主要表型。无效囊胚的一个子集没有显示ICM的生长，而滋养层附着并分化为巨细胞（表中称为“无ICM”; 图。E） ●●●●。另一组无效囊胚没有显示出ICM或滋养层细胞的任何生长（表中称为“无生长”; 图。F） ●●●●。最后一组无效囊胚无法存活，在培养一段时间后死亡。这些数据表明，在缺乏鄂尔多斯2这似乎主要归因于ICM生长失败，因为滋养层鄂尔多斯2-缺陷囊胚具有粘附并分化为巨细胞的潜能。
表4
| 鄂尔多斯2基因型 | 总数 | 有表型的数量（%）
|
|---|
| 正常 | 无ICM | 无生长 | 不可行 |
|---|
| 重量 | 28 | 21 (75) | 2 (7) | 4 (14) | 1 (3) |
| 赫特 | 29 | 15 (51) | 6 (2) | 6 (21) | 2 (7) |
| 无效的 | 11 | 2 (18) | 3（27） | 3 (27) | 3 (27) |
鄂尔多斯2在受精卵母细胞和植入前胚胎中上调。
最后，我们确定了胚胎植入前的表达谱埃兹2对卵母细胞、受精卵母细胞和植入前胚胎制备的总RNA进行RT-PCR。控制相对丰度鄂尔多斯2转录本，我们对第二只小鼠进行了RT-PCR分析鄂尔多斯基因，鄂尔多斯1(22)以及对无处不在的表达Gapdh公司基因。鉴于鄂尔多斯1在受精卵中表达，鄂尔多斯1在桑椹胚或囊胚中检测不到转录物，在未受精的卵母细胞中也不存在转录物（图。，上部面板）。相比之下，鄂尔多斯2在受精后也表达上调，但在植入前的所有阶段仍大量表达（图。，中间面板）。脾RNA被用作RT-PCR的阳性对照，因为两者都是鄂尔多斯基因座在该组织中表达相似(22). 这些数据表明埃兹2，但不是的鄂尔多斯1，在小鼠植入前胚胎中。
植入前表达鄂尔多斯1和鄂尔多斯2在早期小鼠胚胎中。RT-PCR检测埃兹1,鄂尔多斯2号，和Gapdh公司野生型卵母细胞、受精卵、桑椹胚和囊胚总RNA制备中的转录物。作为对照，还对脾组织的总RNA进行了RT-PCR。
讨论
鄂尔多斯2是小鼠植入前的一种早期作用的Pc-G基因。
根据上述分析，鄂尔多斯2连接年1作为唯一描述的其他Pc-G基因(7)在小鼠发育的植入前阶段表达（图。). 相比之下，尽管eed和Ezh2在物理上相互作用(33,37)，合子电子设备直到植入后的第5.5天，表达才开始(32). 这些数据表明，Ezh2在eed-Ezh2综合体之外的其他和早期作用。鄂尔多斯2可以在植入前发育期间发挥作用，为胚胎的快速细胞增殖以及复杂基因表达程序的启动和维持做好准备。由于Ezh2是一种含SET结构域的蛋白质，因此很有意思的推断是，这些早期功能中的一些可能会影响基础染色质结构的更局部的修饰，可能是通过增强或干扰未知底物的甲基化。
或者，Ezh2可能被招募到植入前胚胎基因组中需要在植入时进行遗传调控的位置。植入期间和发病时电子设备表达，Ezh2将与eed相互作用以靶向HDAC(35)到这些基因组位点。事实上，这一层次结构得到了这项和其他（G.Lagger、D.O'Carroll、T.Jenuwein和C.Seiser，未发表的数据）小鼠遗传研究的支持。鄂尔多斯2-胚泡发育不足显示出发育不全的潜能（表和图。D到F），以及鄂尔多斯2突变体（45%）在植入后停止进展（图。B） ●●●●。后期开发鄂尔多斯2突变体与具有电子设备表型，这是原肠胚形成期间形态发生运动所必需的电子设备突变体在第8.5天左右死亡(8,9). 类似地埃兹2突变体（55%）开始原肠胚形成但未能完成，并且在中胚层迁移中也表现出明显缺陷（图。C和D）。
鄂尔多斯2：扩散调节器？
鄂尔多斯2零突变导致早期胚胎死亡，以及鄂尔多斯2-缺乏的小鼠胚胎在从植入前发育到植入后发育的过渡期死亡（表和和图。). 这种转变伴随着细胞分裂速度的提高，在原肠胚形成前后，这些分裂的特点是细胞周期很短（某些细胞类型为4到6小时）(16). The broad expression profile of鄂尔多斯2在小鼠发育的植入前和植入后阶段（图。和图。）将与鄂尔多斯2在控制和/或扩散进程中发挥更为全球性的作用。尽管鄂尔多斯2-有缺陷的囊胚保持着超过ICM和滋养层细胞的潜能，大多数无缺陷的囊囊在体外无法扩展ICM（表和和图。). 同样，鄂尔多斯2-缺陷胚胎在植入后发育停滞（图。).
有许多其他证据关联鄂尔多斯2与植入前小鼠胚胎中存在的细胞类型相比，这些细胞类型的增殖功能更加特殊。例如，Ezh2也通过与原癌基因的基因产物相互作用而被鉴定Vav值(14)，作为刺激淋巴细胞增殖所需的信号分子(34). 静止的脾脏B或T细胞不表达鄂尔多斯2但在有丝分裂原刺激下，鄂尔多斯2迅速上调（D.O’Carroll和T.Jenuwein，未公布数据）。此外，静止的外套膜B细胞向增殖的滤泡中心粒细胞的转变与Ezh2和eed表达的出现相一致(27). 一般来说，SET结构域蛋白似乎是参与调节生长控制的信号通路的重要染色质相关靶点。类似于抗磷酸酶的SET域结合因子Sbf-1的强制表达(5)，导致成纤维细胞致癌转化或原代B细胞培养物增殖增强(6). Sbf-1与E（Z）相关蛋白的SET结构域相互作用(5).
总之，我们已经证明Pc-G基因鄂尔多斯2是小鼠早期发育所必需的。表型的严重程度不同鄂尔多斯2来自大多数其他Pc-G基因并定义鄂尔多斯2作为一种早期作用基因年1和电子设备(7,32). 因此，我们的遗传分析表明，在小鼠植入前，这些Pc-G基因的功能重叠，并扩展了最近的观察，即YY1可以与eed-Ezh2蛋白复合物发生物理相互作用(31). 尽管鄂尔多斯2它是最早期作用的Pc-G基因之一，也广泛表达于植入后胚胎和淋巴器官中(15,22). 根据此处提供的数据，我们建议鄂尔多斯2是生长控制的重要调节器，其在小鼠发育后期的破坏将严重损害鄂尔多斯2-突变细胞。
