检查点是一种信号通路，在细胞致力于复制（S期）或分离（有丝分裂）其DNA之前，监测遗传物质的完整性和复制状态(27). 激活后，检查点与cyclin-Cdk复合物结合，阻止细胞周期进展或诱导细胞死亡。DNA复制检查点监测S期的完成情况，并在没有S期的情况下防止有丝分裂。DNA损伤检查点监测基因组的完整性，并在G1DNA复制之前（称为G1DNA损伤检查点）、S期（S期DNA损伤检查点通过）或G期2有丝分裂前（G2DNA损伤检查点）。真核细胞激活进化上保守的一组检查点蛋白，快速诱导细胞周期停滞，以防止修复完成前受损DNA的复制或分离。
DNA损伤检查点的一个关键组成部分是ATM（共济失调毛细血管扩张症突变），一种370-kDa蛋白激酶(58). 这个自动取款机人类遗传性疾病共济失调毛细血管扩张症的基因突变(58). 来自缺乏ATM患者的细胞系对辐射敏感，对电离辐射（IR）的检查点反应（包括p53依赖性G）有缺陷1细胞周期阻滞和p53依赖性S和G2细胞周期阻滞(31). ATM的激酶活性响应于双链DNA断裂而被激活，ATM靶向检查点控制的几种效应物，包括Cds1（也称为Chk2）、Brca1、p95（nbs1）、p53和Mdm2(2,5,8–10,15,23,33,34,41,42,47,69,74). 缺乏紫外线和碱损伤剂的细胞对检查点的反应正常自动取款机综上所述，这些发现表明ATM在IR诱导的DNA损伤检查点中发挥着重要作用。
ATR（ATM和Rad3相关蛋白激酶）也有助于真核生物的检查点控制(13,32). 不同于自动取款机，删除自动标签阅读器小鼠的胚胎致死表型表明自动标签阅读器是一种基本基因(6,17). 区分这两种激酶的另一个特征是它们对不同类型的检查点信号的敏感性。如上所述，缺乏ATM的细胞对IR过敏，但对UV或羟基脲（HU）不敏感，而过度表达激酶活性形式的ATR的细胞对UV和HU以及IR敏感。这表明ATR在细胞对未复制DNA（由HU等试剂诱导）的反应中比ATM发挥更显著的作用以及某些DNA损伤剂，包括紫外线(14,68). 然而，ATR的过度表达弥补了缺乏ATM细胞的抗辐射DNA合成缺陷，表明这两种激酶在体内具有重叠功能。为了支持这一点，ATM和ATR被证明具有类似的激酶特异性(35,52). 两者都喜欢磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基，然后是谷氨酰胺（SQ/TQ基序），因此，ATM和ATR在体内具有重叠的底物特异性。ATM和ATR共享的底物示例包括p53和Brca1(40,62,63).
ATR的另一个潜在亚群是人类Chk1蛋白激酶。Chk1首先在裂变酵母中被鉴定为DNA损伤检查点的基本成分(1,66). 当同时缺乏Chk1和第二个检测点激酶Cds1的分裂酵母细胞被发现进入有丝分裂期时，Chk1在DNA复制检查点中的另一个作用被揭示出来(4,43,72). 人类中也发现了Chk1同源基因，黑腹果蝇,秀丽隐杆线虫、芽殖酵母和爪蟾(20,21,38,50,55,60). 在人类中，裂变酵母，以及爪蟾，建议Chk1调节G2通过在促进14-3-3蛋白结合的一个或多个残基上磷酸化Cdc25蛋白磷酸酶的检查点(38,54,56,72,73).
喜欢自动标签阅读器,检查1已经证明是小鼠的一种基本基因(6,17,44,61). 这些发现揭示了ATR和Chk1在没有环境施加的遗传毒性应激的情况下的基本功能。缺乏Chk1的胚胎和条件胚胎干细胞株对复制块和DNA损伤剂也表现出缺陷的检查点反应，从而在小鼠中建立了哺乳动物Chk1检查点功能(44,61). Chk1有助于G的证据2人类细胞中的检查点控制来自于研究表明，UCN-01和SB-218078等药物是Chk1的有效抑制剂，可以消除G2人类细胞中的检查点功能(7,25,29).
Chk1是信号通路的一个组成部分，对DNA损伤和/或不完全DNA复制的结构特征作出反应。在裂变酵母中，Chk1对IR或UV诱导的DNA损伤作出反应，并且Chk1也在DNA复制检查点中发挥作用(4,22,43,66,67,72).爪蟾Chk1对DNA复制阻滞和紫外线损伤有反应，但对具有双链断裂的DNA没有反应，这是γ射线照射DNA的特征(26,37). Chk1的调节可能最典型的特征是爪蟾，其中已经证明Chk1被ATR磷酸化和激活，并且ATR-Chk1途径对未复制的DNA和紫外线损伤的DNA作出反应(26). 就人类Chk1而言，人们不仅对其响应的DNA结构类型存在争议，而且对其激酶活性是否因基因毒性应激而升高也存在争议。一些研究报告称，人类Chk1的电泳迁移率在暴露于IR后受到抑制(7,44,56)，匈牙利(7,44)和UV(44,46). 其他研究未能观察到用这些药物处理细胞时Chk1电泳迁移率的变化(30). 此外，两项研究报告了Chk1激酶活性对紫外线和一种拓扑异构酶I抑制剂BNP1350的反应略有增加(46,71)，而其他研究报告称，人类Chk1的激酶活性不会因基因毒性应激而改变(30,76). 最后，当细胞以依赖ATR的方式接受UV、IR或HU处理时，人类Chk1被丝氨酸345磷酸化(44). 然而，尚不清楚在基因毒性应激期间是否有其他位点磷酸化，磷酸化是否有助于Chk1活性，或者人类Chk1是否是ATR的直接靶点。
在本研究中，我们研究了人类Chk1对不同类型基因毒性应激的调节。我们报道，人类Chk1在丝氨酸317和345上磷酸化，以响应检查点激活。丝氨酸317和345磷酸化后，人Chk1的激酶活性被激活，磷酸化活化形式的Chk1在凝胶过滤柱上更快洗脱。最后，我们报道了ATR在体外直接磷酸化丝氨酸317和345上的人Chk1，并且这些残基的磷酸化在体内是ATR依赖性的。
材料和方法
细胞系
293和HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、每毫升100 U（每个）青霉素和链霉素以及1 mM谷氨酰胺（培养基）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Gibco）中生长。表达ATM（AT）的AT22IJE T细胞+)或不表示ATM（AT负极) (77)在DMEM、10%FBS、100 U青霉素和链霉素/ml、1 mM谷氨酰胺和100μg潮霉素/ml的混合物中培养。U2OS细胞在添加10%FBS的改良McCoy’s 5A培养基（Gibco）中生长，100 U青霉素和链霉素/ml和1 mM谷酰胺。
抗体。
用兔抗细菌产生的谷胱甘肽多克隆抗体检测Chk1S公司-转移酶（GST）-Chk1或从圣克鲁斯生物技术公司购买的商业单克隆（SC8408）或多克隆（SC7898）抗体。用抗c-Myc（9E10）-琼脂糖偶联物（Santa Cruz Biotechnology）或抗Flag M2抗体-琼脂酶亲和凝胶（Sigma Chemical Co.）沉淀Chk1融合蛋白，并用c-Myc多克隆抗体（A-14；Santa Crux Biotechnology）进行Western blotting检测。用辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗鼠抗体（ICN/CAPPEL）或HRP-大鼠抗兔抗体（Zymed）检测结合的一级抗体，并用ECL增强化学发光试剂（Amersham）通过化学发光显示蛋白质。将磷酸肽C-VKYSSpSQPEPRT与锁孔帽贝血蓝蛋白偶联，免疫家兔，产生丝氨酸317磷酸化的Chk1特异性抗体。
重组腺病毒的产生。
将Chk1的野生型和突变型克隆为标记融合到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV（巨细胞病毒）中(28). 用含有Flag标签的正向引物3和千磅I位点（5′-ATAGGTACCATGGACTATAAGGACGATGAGAGGCAGTGC CCTTTGAGGAAG-3′）和反向引物4，包含终止密码子和Xba公司I站点（5′-ATATCTAGATCATGTGGCAGAGAGAC）。PCR产物用千磅我和Xba公司I并克隆到pAdTrack-CMV中。编码野生型和突变型Chk1蛋白的pAdTrack-CMV质粒与pAdEasy-1共转化为大肠杆菌BJ5183实现同源重组。如前所述，用pAdEasy系统产生并繁殖重组腺病毒(28).
编码His-Chk1的重组杆状病毒的制备及Chk1抗体的亲和纯化。
以pAdTrack-CMV-Flag-Chk1（野生型）为模板，用正向引物5′-GGGAATTCGGAGTCATGGCAGTGC CC和反向引物5’-GGGTACCCTGGCAGAGAGCC对Chk1进行PCR扩增。PCR产物用生态RI和千磅I并连接到pFASTBACHTa（Gibco BRL）。编码His的重组杆状病毒6-Chk1是通过BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统（Gibco BRL）和制造商建议的协议生成的。他的6-用Ni-硝基三乙酸琼脂糖（Qiagen）从感染的Sf9昆虫细胞中纯化Chk1蛋白，并纯化His6-在50 mM Tris-Cl（pH 8.0）、150 mM NaCl、200 mM咪唑和1 mM二硫苏糖醇（DTT）的混合物中洗脱Chk1。四毫克他的6-根据制造商的建议，将Chk1偶联到2 g CNBr活化的Sepharose 4B（Sigma Chemical Co.）。将产生的针对GST-Chk1的抗体施加到柱上，并用0.1M甘氨酸（pH 2.8）洗脱Chk1特异性抗体，并立即用1M Tris（pH 8.0）中和。
抗体与固定化蛋白A偶联用于免疫沉淀。
将ImmunoPure固定化蛋白A琼脂糖（Pierce）和亲和纯化的Chk1抗体在4°C的1 ml哺乳动物细胞裂解缓冲液1（MCLB1:50 mM Tris-HCl[pH8.0]，2 mM DTT，5 mM EDTA，0.5%Nonide P-40，100 mM NaCl，1μM微囊藻毒素，1 mM原钒酸钠，2 mM-苯甲基磺酰氟[PMSF]中孵育1 h，每毫升10μg抑肽酶，20μM亮氨酸蛋白酶），亲和纯化抗体14μg与填充珠30μl之比。用1 ml MCLB1清洗一次抗体-基底混合物，用1 ml LiCl缓冲液（0.5 M LiCl，50 mM Tris[pH8.0]）清洗两次，用1 mlMCLB1冲洗两次。
用DNA损伤剂和咖啡因处理细胞
HeLa细胞培养物在含有50μM顺铂、3μM足叶乙甙或3μM 1-β的培养基中培养-d日-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（ara-C）培养1h。取出培养基，清洗细胞一次，然后在培养基中培养6h。对于紫外线照射，去除培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞两次，并用254-nm紫外线照射未盖的组织培养皿中的细胞，照射剂量为10 J/m2与Stratalinker（Stratagene）合作。重新加入新鲜培养基，并将细胞再培养6小时。在一些实验中，在HU处理之前，HeLa细胞在10 mM咖啡因中培养2.5小时。
质粒
以pAdTrack-CMV-Flag-Chk1（+）为模板，用正向引物1（5′-AGGAATCCATGGCAGTGCCCTTTGTGG-3′）和反向引物2（5′-GCTTCTAGAGCTCATGTGGCAGCC-3′）对Chk1进行PCR扩增。PCR产物用生态RI和Xba公司I并连接到pcDNA3-myc以生成pcDNA3-myc-Chk1。丙氨酸在130位取代天冬氨酸，生成激酶活性的Chk1（Chk1D130A）。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，采用快速突变试剂盒（Strategene）制备磷酸化位点突变体。在每种情况下，丝氨酸都被改变为丙氨酸。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，结合正向引物5′-GTGAAGTACTCCAGTG公司CTCAGCAGAGAACCCGC-3′和反向引物5′-GCGGGTTCTGTGTGAGC类ACTGGATTCAC-3′生成pcDNA3-myc-Chk1（S317A）。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，结合正向引物5′-CAGGGATCATTTG公司C类T型CAGCCCCACATGTCC-3′和反向引物5′-GGACATGTGGGCTGA类G公司C类AAAGCTGATCCCTTG-3′产生pcDNA3-myc-Chk1（S345A）。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，结合正向引物5′-CATATGCTTTGAATGC公司TCAGTTACTTGCACCC-3′和反向引物5′-GGGGTGCAAGTAACGAGC公司ATTCAAAAGCATG-3′生成pcDNA3-myc-Chk1（S357A）。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，结合正向引物5′-GGCACCCACAGATCCG公司CACAGACCCCTGGCAG-3′和反向引物5′-CTGCCGGTTCTGTGC类GGATCCCTGGGGTGCC-3′生成pcDNA3-myc-Chk1（S366A）。以pcDNA3-myc-Chk1为模板，正向引物为5′-GCTGATGATGTGAGC全球合作协议CAGAAGGTTGGCTTCCTGCC-3′和反向引物5′-GGCAGAGCAACCTTGTGC公司GCTCACAATATCAATCAGC-3′生成pcDNA3-myc-Chk1（S468A）。使用pcDNA3-myc-Chk1（S317A）作为模板，使用上述引物生成pcDNA3-myc-Chk 1（S317%a，S345A）。使用pcDNA3-myc-Chk1（S357A）作为模板与上述引物一起产生pcDNA3-myc-Chk1（S357A、S366A）。用正向引物5（ATACCGGAATGGCAG TGCCCTTTGTGG）和反向引物6（ATAGATTCTCATGTGGCAGCC）对Chk1（野生型和D130A）蛋白进行PCR扩增。PCR产物用Sma公司我和生态RI并连接到pGEX2TN。使用pGEX2TN-Chk1作为模板，通过使用上述方法和引物生成pGEX2TUN-Chk1（S317A。
纯化可溶性GST-Chk1（野生型和突变型）用于激酶分析。
用编码GST-Chk1（野生型和突变体）的质粒转化JM109细胞。培养物在37°C下生长至600 nm（OD600)0.6和异丙基-1-硫代-β-d日-将吡喃半乳糖苷（IPTG）添加到0.5 mM的最终浓度。在30°C下额外生长3 h后，通过离心将细胞制成丸。用PBS缓冲液洗涤细胞颗粒，并将其重新悬浮在补充有2 mM PMSF、10μg抑肽酶/ml、20μM亮氨酸蛋白酶和1.0 mg溶菌酶/ml的STE（100 mM NaCl、10 mM Tris HCl[pH8.0]、1 mM EDTA）中。在4°C下摇晃20分钟后，添加肉桂糖至1.5%的最终浓度，并通过超声波进行溶解。通过离心澄清裂解液，并将Triton X-100添加至最终浓度2%。用谷胱甘肽-甘露糖（Sigma Chemical Co.）沉淀蛋白质，并在STE中洗涤两次，在LiCl缓冲液中洗涤两遍（0.5 M LiCl，50 mM Tris HCl[pH8.0]），在50 mM Tris HCl（pH7.4）中洗涤两回。用20 mM谷胱甘肽在50 mM Tris HCl（pH 7.4）中洗脱GST融合蛋白。
GST-Cdc25C的纯化200–256
GST-Cdc25C型200–256由细菌产生，并按照前面所述进行纯化(53). 在由50 mM Tris（pH 7.4）组成的缓冲液中从GSH琼脂糖中洗脱蛋白质,20 mM谷胱甘肽、2 mM PMSF、每毫升10μg抑肽酶和20μM亮氨酸肽，然后在4°C下在1升透析缓冲液（25 mM Tris[pH8.0]，5 mM DTT）中透析过夜。
Chk1激酶分析
监测内源性Chk1，3×10的活性6HeLa细胞未经处理或用3 mM HU处理17 h。细胞在MCLB2中溶解（50 mM Tris-HCl[pH8.0]，2 mM DTT，5 mM EDTA，0.5%Nonide P-40，100 mM NaCl，1μM微囊藻毒素，1 mM原钒酸钠，2 mM-PMSF，每ml 10μg抑肽酶，20μM[5μg/ml]亮氨酸蛋白酶，10 mMβ-甘油磷酸，1 mM-氟化钠）。用14μg亲和纯化的Chk1抗体与蛋白A琼脂糖偶联，在4°C下培养澄清的裂解液（代表2 mg总细胞蛋白）过夜。用MCLB2洗涤沉淀两次，用不完全的激酶缓冲液洗涤沉淀二次（50 mM Tris Cl[PH7.4]，1 mM DTT，10 mM MgCl2). 在含有10μM ATP、10μCi的[γ-32P] ATP和5μg可溶性GST-Cdc25C200–256反应混合物在30°C下孵育25 min，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行拆分，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。放射自显影术显示放射性标记蛋白。然后用抗Chk1单克隆抗体对相同的膜进行Western blot分析。对于体外产生的Chk1，将代表2 mg总细胞蛋白的澄清裂解物或柱馏分与30μl抗标记琼脂糖（Sigma Chemical Co.）在4°C下培养2 h。沉淀用MCLB2洗涤两次，用LiCl缓冲液洗涤两次和用不完全激酶缓冲液洗涤一次。如上所述进行激酶测定。
磷酸酶处理。
HeLa细胞在MCLB2（50 mM Tris-Cl[pH8.0]，100 mM NaCl，10 mM MgCl）中溶解2含有2 mM PMSF、每毫升10μg抑肽酶和每毫升5μg亮氨酸蛋白酶的0.5%Nonide P-40、2 mM DTT）。在37°C下，将含有150μg总细胞蛋白的澄清裂解液与5 U小牛肠磷酸酶（NEB）在无或有10 mMβ-甘油磷酸和10 mM NaF的情况下培养1小时。
ATR激酶分析。
293个电池（2.8×106)根据制造商的说明（Life Technologies），使用磷酸钙转染系统，用30μg编码激酶活性或非活性Flag ATR的质粒转染。转染后48小时，细胞在含有1μM微囊藻毒素、1 mM原钒酸钠、2 mM PMSF、每毫升10μg抑肽酶、每毫升5μg亮氨酸肽、10 mMβ-甘油磷酸钠和1 mM氟化钠的MCLB3（50 mM Tris-Cl[pH8.0]、150 mM NaCl、0.5%诺奈特P-40、2 mM-DTT、5 mM EDTA、10%甘油）中溶解。将代表4 mg总细胞蛋白的裂解液与反标记琼脂糖在4°C下培养2 h。用MCLB3清洗沉淀两次，用LiCl缓冲液清洗一次，用不完全的激酶缓冲液（20 mM HEPES[pH 7.4]，10 mM MgCl2，10 mM氯化锰2，50 mM氯化钠，1 mM DTT）。在补充有5μM ATP、20μMβ-甘油磷酸、10μCi的不完全激酶缓冲液中进行激酶分析（50μl）-32P] ATP和1μg从细菌中纯化的GST-Chk1（野生型和突变型）。
腺病毒感染和凝胶过滤。
对HeLa细胞进行模拟感染或用重组腺病毒感染60分钟，重组腺病毒编码标记的Chk1（野生型和突变型），感染倍数（MOI）为10 in 1 ml无血清DMEM。1小时后，加入5毫升培养基。感染15小时后，细胞未经处理或与10 mM HU孵育4小时。细胞在MCLB1中溶解。将裂解液通过一个27 gaug的针头10次，然后在20000×克10分钟，然后50000转/分，持续30分钟。将含有2至5 mg总细胞蛋白的澄清裂解液装入Superdex 200 10/30柱（Pharmacia），并用50 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl和1 mM EDTA洗脱。柱以0.35 ml/min的速度运行，每部分收集0.5 ml。对于模拟感染的细胞，通过SDS-PAGE从组分23至30中分离出150μl。用抗Chk1多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。对于腺病毒感染的细胞，首先用30μl包装好的抗病毒琼脂糖培养部分。沉淀用SDS-PAGE进行解析，用Chk1多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting显示Flag-Chk1（野生型和突变型）蛋白。当进行激酶分析时，沉淀物首先在含有GST-Cdc25C的完整激酶缓冲液中培养200–256通过SDS-PAGE解析激酶反应，并将蛋白质转移到硝化纤维素。放射自显影法显示放射性标记蛋白，然后用Chk1多克隆抗体（SC7898）对膜进行Western印迹。
体内32P标记和二维肽图谱分析。
293个细胞（2×106）用Superfect转染试剂（Qiagen）模拟转染或转染编码myc标记的Chk1野生型和突变型的质粒。培养16小时后，将细胞培养在含有2 mCi的无磷DMEM中32P标记的无机磷酸盐/ml和10mM HU持续4小时。当标记外源Chk1时，在标记期间还包括1μM UCN-01。细胞在MCLB1中溶解。用亲和纯化的多克隆抗体从模拟转染细胞裂解物中免疫沉淀内源性Chk1，该抗体已预偶联到蛋白A珠。用抗myc单克隆抗体琼脂糖（Santa Cruz）免疫沉淀外源性表达的Chk1。免疫沉淀物在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，蛋白质转移到硝化纤维素。将放射性标记的Chk1在含有每毫升0.2 mg胰蛋白酶（沃辛顿）的50 mM碳酸氢铵溶液中消化17 h。在pH 1.9的条件下，通过薄层色谱在第一维中分离色氨酸磷酸肽，在第二维中通过升序色谱在缓冲液中分离色胺酸磷酸肽n个-丁醇-吡啶-乙酸-水，比例为75/50/15/60(65). 或者，将胰蛋白酶磷酸肽与1.2U Asp-N内肽酶（Roche）/ml在50mM碳酸氢铵中孵育17小时，然后与齐普肽C孵育18树脂（Millipore）纯化磷酸肽，然后进行二维磷酸肽映射。在某些情况下，LVQGISF序列的未标记磷酸肽pS公司QPTCP通过二维映射求解。
结果
检查点诱导Chk1的磷酸化和活化。
为了检测Chk1蛋白激酶在检查点反应过程中是如何调节的，用HU处理HeLa和U2OS细胞以激活DNA复制检查点（图。A） ●●●●。U2OS细胞含有一个功能性p53蛋白，而HeLa细胞由于乳头瘤病毒E6蛋白的表达而缺乏功能性p53-蛋白，该蛋白以p53为靶点进行破坏(59). HU处理两种细胞类型后，在SDS凝胶上观察到Chk1的电泳迁移率受到抑制，这表明p53状态不会影响这一途径（图。A、 车道2和6）。磷脂酶处理证实，Chk1电泳速度较慢是由于HU诱导的Chk1磷酸化所致（通道3和4）。有趣的是，当HeLa细胞被紫外光和各种诱导DNA损伤或干扰DNA复制的化疗药物（包括顺铂、阿糖胞苷和足叶乙甙）处理时，Chk1的电泳迁移率也降低（图。B） ●●●●。
检查点诱导的Chk1磷酸化和活化。（A） HeLa和U20S细胞未经处理（−）或用3 mM HU处理（+）20 h。含有150μg蛋白质的细胞裂解物通过SDS-PAGE（1、2、5和6道）直接溶解，或在没有（3道）或存在（+INH）磷酸酶抑制剂的情况下，用5 U小牛肠磷酸酶（CIP）处理，包括10 mMβ-甘油磷酸和10 mM NaF（第4车道）。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（B） HeLa细胞在DMEM中单独培养（1区）或含有50μM顺铂（2区）、3μM足叶乙甙（3区）或3μM ara-C（4区）的DMEM培养1h，然后用新鲜DMEM替换培养基，然后细胞再培养6h2（第5车道）。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（C） HeLa细胞未经处理（−）或用3 mM HU处理（+）17 h。将澄清的细胞裂解物与亲和纯化的Chk1抗体孵育，并在5μg GST-Cdc25C存在下在体外进行激酶分析200–256通过SDS-PAGE解析反应，并将蛋白质转移到硝化纤维素上。放射性标记GST-Cdc25C200–256放射自显影。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）通过蛋白质印迹法测定每种免疫沉淀物中Chk1的水平。
为了确定Chk1的蛋白激酶活性是否受磷酸化调节，在体外进行免疫复合物激酶分析（图。C） ●●●●。内源性Chk1是从在没有HU（第1道）或存在HU的情况下培养的HeLa细胞中免疫沉淀出来的。监测Chk1免疫沉淀物磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256，一种由200到256个Cdc25C氨基酸与GST融合而成的蛋白质。该底物以前曾用于监测Chk1的活性(25,56). 有趣的是，从HU处理的细胞中分离出的Chk1蛋白激酶活性比从未处理细胞中分离出来的高出大约五倍。
人Chk1凝胶过滤分析。
进行凝胶过滤分析以监测HU治疗前后Chk1的洗脱曲线（图。). 在没有HU处理的情况下，Chk1在组分29和30中洗脱，这与它是细胞中的单体一致。然而，在HU处理后，在较早洗脱的组分中也检测到Chk1（图。[和见图。]). 有趣的是，在SDS凝胶上以较慢的电泳迁移率迁移的磷酸化形式的Chk1优先出现在洗脱较早的组分中。这些发现表明，磷酸化形式的Chk1要么多聚酶化，结合细胞蛋白质，要么发生构象变化，导致其用100~158kDa的蛋白质标准洗脱。为了确定异位表达的Chk1是否表现得像内源性Chk1，我们产生了一种表达Flag标记的Chk1的重组腺病毒。由感染的HeLa细胞制备的裂解液通过凝胶过滤进行分离，并将选定的部分与Flag-agarose孵育，以特异性沉淀Flag-tagged Chk1。通过Western blotting分析沉淀中是否存在Chk1。如图所示。在没有HU处理的情况下，Flag-Chk1在与内源性Chk1相同的组分中洗脱（组分29和30）。HU处理后，Flag-Chk1也在组分27和28中洗脱，内源性Chk1也洗脱。
通过凝胶过滤分析Chk11。HeLa细胞要么被模拟感染，要么被编码标记Chk1的重组腺病毒感染。感染15小时后，细胞未经处理（−HU）或与10 mM HU（+HU）孵育4小时。澄清的裂解产物直接通过SDS-PAGE和Western blotting（总裂解产物）进行分析，或加载到Superdex 200 10/30柱上。对于模拟感染的细胞，通过SDS-PAGE分离来自组分23至30的150μl。对于腺病毒感染的细胞，首先用抗病毒琼脂糖培养组分23至30。用Chk1多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1和Flag-Chk1。显示了含有158和44 kDa蛋白质标准物的组分。44-kDa蛋白质标准物主要在组分30和31中洗脱。
磷酸化位点突变体保留固有的蛋白激酶活性。（A） 在细菌中纯化Chk1、Chk1（D130A）、Chkl（S317A）、Chk1（S345A）和Chk1的GST融合蛋白，并测试其磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256体外试验。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并将蛋白质转移到硝化纤维素中。磷酸化Cdc25C200–256通过放射自显影检测，并用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察GST-Chk1（野生型和突变型）的水平。（B） HeLa细胞被编码GFP（第1道）、Flag-Chk1（第2道）、Flag-Chk 1（S317A、S345A）（第3道）和Flag-Ch 1（D130A）的重组腺病毒感染。制备裂解物并与Flag琼脂糖一起孵育。测试沉淀磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256体外试验。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并将蛋白质转移到硝化纤维素中。磷酸化Cdc25C200–256通过放射自显影检测，并用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察GST-Chk1（野生型和突变型）的水平。
检查点诱导的Chk1磷酸化与ATM无关，但对咖啡因敏感。
为了确定HU诱导的Chk1磷酸化是否需要功能性ATM，来源于缺乏ATM的患者的永生成纤维细胞（AT细胞），用ATM表达载体（AT+)或空向量（AT负极)用HU处理。然后用免疫印迹法监测Chk1的电泳迁移率（图。A） ●●●●。在两个AT中检测到较慢的Chk1电泳形式+（车道2）和AT负极尽管HU处理后，两种细胞系中的Chk1蛋白水平都有所降低，但仍有（第5通道）细胞。我们还监测了AT治疗后Chk1的电泳迁移率+和AT负极电离辐射的细胞。如图所示。A（通道3和6），发现部分Chk1的电泳迁移率在两个AT中都受到抑制+和AT负极细胞，尽管程度低于HU观察到的程度。
检查点诱导的Chk1磷酸化与ATM无关，但对咖啡因敏感。（A） 自动变速箱+和AT负极细胞未经处理（通道1和4）或用3 mM HU处理（通道2和5）或用10 Gy IR照射（通道3和6）。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（B） HeLa细胞在缺乏咖啡因的DMEM中培养2.5小时（通道1和2）或含有10 mM咖啡因（通道3和4）。细胞在没有（通道1、3）或存在（通道2和4）3 mM HU的情况下再培养20小时。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）通过蛋白质印迹检测Chk1。
我们还监测了咖啡因对HU诱导的Chk1磷酸化的影响，因为咖啡因抑制ATM和ATR(三,9,49,57,75). 如图所示。B、 当用10 mM咖啡因预处理细胞时（通道4），HU诱导Chk1磷酸化的能力完全消失。综上所述，这些观察结果表明HU诱导的Chk1磷酸化独立于ATM，但可能依赖于ATR或另一种咖啡因敏感性激酶。
Chk1在体内被丝氨酸317和345磷酸化。
对Chk1进行二维磷酸肽定位，以识别HU处理后磷酸化的残基。HU处理的HeLa细胞与32用免疫沉淀法分离P标记的无机磷和内源性Chk1。此外，用编码myc标记的Chk1的质粒转染HeLa细胞。转染细胞与32在HU和1μM UCN-01存在下的P-标记无机磷酸盐。UCN-01抑制Chk1激酶的活性，但不抑制位于Chk1上游的激酶的活性(7,25,29). 我们观察到在标记期间加入UCN-01后，外源表达的Chk1磷酸化增强，但内源性Chk1的磷酸化没有增强。尽管其机制尚不清楚，但UCN-01有望抑制体外产生的Chk1的激酶活性，从而使细胞以激酶活性形式过度产生Chk1。32用胰蛋白酶消化P-标记的内源性Chk1和myc-标记的Chk1，并在二维上分离肽。如图所示。，在内源性的情况下，两种主要的磷酸肽（表示为1和2）是明显的（图。B） 和外显（图。C） 检查1。鉴于Chk1磷酸化对咖啡因的敏感性，我们检测了Chk1蛋白序列中是否存在SQ和TQ残基。丝氨酸和苏氨酸残基以及谷氨酰胺是ATM和ATR激酶磷酸化的优选位点(35,52). 如图所示。A、 在Chk1的C末端有五个SQ残基（丝氨酸317、345、357、366和468）。在HeLa细胞中，含有丙氨酸而不是丝氨酸的Chk1突变形式在317位被表达为myc标记的融合蛋白。二维胰蛋白酶磷酸肽图谱显示丝氨酸317突变导致磷酸肽1消失（图。D） ●●●●。这表明HU处理的细胞中丝氨酸317被磷酸化。
Chk1在体内被丝氨酸317磷酸化。（A） ●●●●。对Chk1的结构进行了图示，以显示激酶结构域（氨基酸9至265）、C末端富含SQ的区域以及相对于潜在磷酸化位点的胰蛋白酶和天冬氨酸-N裂解位点的位置。（B至D）293细胞被模拟转染或转染表达myc-Chk1（野生型）或myc-Chk 1（S317A）的质粒。细胞与32在HU存在下P标记无机磷酸盐。用胰蛋白酶消化放射性标记的Chk1，并对肽进行二维磷酸肽定位。箭头指示第一个和第二个尺寸的方向，原点位于两个箭头相交的位置。（E） HeLa细胞未经处理（1和5道），或用3 mM HU（2、3、6和7道）或20 J UV m处理2（车道4和8）。按照SDS-PAGE的指示制备并分析裂解液（1到4道），或者首先在没有竞争性磷酸肽免疫原（5、6和8道）或存在竞争性磷酸肽类免疫原（7道）的情况下与S317磷酸特异性抗体孵育。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）免疫印迹法检测Chk1。
为了在体内直接监测丝氨酸317的磷酸化，我们生成了一种抗体，当Chk1在丝氨酸318上磷酸化时，该抗体能够识别Chk1。HeLa细胞要么未经处理，要么用HU或UV处理（图。E） ●●●●。裂解液由SDS-PAGE（1到4道）指导制备和分析，或在SDS-PAGE（5到8道）之前与S317磷酸特异性抗体孵育。正如预期的那样，HU和UV处理导致出现较慢的Chk1电泳（磷酸化）形式。有趣的是，磷酸特异性抗体仅免疫沉淀了HU和紫外线处理细胞（第6和第8道）中发现的较慢电泳（磷酸化）形式的Chk1。抗体与磷酸肽免疫原的预孵育阻断了S317-磷酸化Chk1的免疫沉淀（第7车道）。这些结果证实了体内Chk1在丝氨酸317上磷酸化，以响应HU和UV处理。
因为丝氨酸345、357和366包含在单个大胰蛋白酶肽中（图。A） ，我们用胰蛋白酶消化myc标记的Chk1（野生型和突变型），然后用Asp-N内肽酶消化。如图所示。A、 在这些条件下，可观察到五种磷酸肽。丝氨酸317的突变导致磷酸肽1的缺失（图。B） 而丝氨酸345的突变导致磷酸肽2的丢失（图。C[见图。]). S345以前被证明是磷酸化的，以响应检查点激活(44). 用丙氨酸取代丝氨酸357和366不会导致鉴定为野生型Chk1的五种磷酸肽中的任何一种的损失（图。D） ●●●●。此外，用丙氨酸替换丝氨酸468并没有改变二维磷酸肽定位结果，这表明该残基在体内没有磷酸化（数据未显示）。这些发现还表明丝氨酸317和345是体内Chk1磷酸化的位点。
Chk1在体内也被丝氨酸345磷酸化。用表达myc-Chk1（野生型）、myc-Chk1（S317A）、myc-Chk1和myc-Chk 1（S357A、S366A）的质粒转染293细胞。细胞与32在HU存在下P标记无机磷酸盐。用胰蛋白酶消化放射性标记的Chk1（野生型和突变型），然后用天冬氨酸-N内肽酶消化肽，并对肽进行二维磷酸肽定位。箭头指示第一和第二维度的方向，原点位于两个箭头相交的位置。
ATR和Chk1在体内外的相互作用。（A） 用编码激酶活性（ATR）的质粒转染293个细胞+)和-不活动（ATR负极)标记ATR的形式。制备裂解液，并与反旗帜琼脂糖孵育。监测沉淀对融合到GST（GST-Chk1D130A）的细菌产生的激酶敏感型Chk1磷酸化能力。通过SDS-PAGE解析激酶反应，将蛋白质转移到硝化纤维素中，并通过放射自显影术显示放射性标记的Chk1。用编码标记ATR的质粒转染（B至E）293细胞。制备裂解液，并与反旗帜琼脂糖孵育。在细菌产生的GST-Chk1（D130A）、GST-Chk1（D130A，S317A）和GST-Chk 1（D130 A，S345A）存在的情况下进行激酶反应。用胰蛋白酶和天冬氨酸-N内肽酶消化放射性标记的Chk1蛋白，并对肽进行二维磷酸肽定位。显示了第一和第二个分离维度，原点位于两个箭头相交的位置。蛋白质水解的GST-Chk1（D130A）中的磷酸肽在映射（B）之前与未标记的磷酸肽（LVQGISFpSQPTCP）混合，或者磷酸肽单独分解（C）并用茚三酮染色。箭头指示未标记磷酸肽的位置。（F） 用编码激酶活性（ATR）的质粒转染293个细胞+)和-不活动（ATR负极)标记ATR的形式。转染细胞未经处理（1、3、5和7道）或接受20 J紫外线照射2（车道2、4、6和8）。裂解液由SDS-PAGE（1到4道）指导制备和分析，或在SDS-PAGE（5到8道）之前首先与S317磷酸特异性抗体孵育。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）免疫印迹法检测Chk1。
HU诱导的Chk1活化需要丝氨酸317和345的磷酸化。
为了解决丝氨酸317和345磷酸化的功能意义，产生了表达Chk1的单磷酸化和双磷酸化突变体的重组腺病毒。在HU存在下用野生型和突变型病毒感染HeLa细胞。制备裂解液并通过凝胶过滤分离。对所选部分进行Chk1蛋白和Chk1激酶活性分析。如图所示。如前所示（图。)，磷酸化活化形式的Chk1在分子大小为～100至158 kDa的组分中洗脱（组分26至28）。正如单体蛋白预期的那样，大部分低磷酸化或未磷酸化的非活性Chk1在第29至30组分中迁移。S317或S345突变为丙氨酸会降低早期洗脱组分（组分26至28）中Chk1的含量。此外，与野生型Chk1相比，第26至28组分中与Chk1（S317A）和Chk1相关的激酶活性显著降低。最后，含有丙氨酸而不是丝氨酸317和345的Chk1突变体主要在组分29和30中洗脱，并且在HU处理下活性较差。综上所述，这些发现表明S317和S345的磷酸化都有助于Chk1的活化及其在凝胶过滤柱上更快的洗脱。
HU诱导的Chk1活化需要丝氨酸317和345的磷酸化。（A） HeLa细胞感染重组腺病毒，编码Flag-Chk1（野生型）、Flag-Cchk1（S317A）、Flage-Chkl（S345A）或Flag-Ck1。感染15小时后，将细胞与10 mM HU孵育4小时。将澄清的裂解产物加载到Superdex 200 10/30柱上。将分数26和27合并。将第26/27、28、29和30组分与反标记琼脂糖孵育。对沉淀物磷酸化GST-Cdc25C的能力进行监测200–25通过SDS-PAGE解析激酶反应，并将蛋白质转移到硝化纤维素。放射性标记GST-Cdc25C200–256通过放射自显影观察到Chk1，使用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察到Chk 1。
为了确定Chk1的固有蛋白激酶活性是否因氨基酸替换而改变，我们监测了细菌产生的Chk1（野生型和突变型）的激酶活性。从细菌中表达和纯化激酶缺失型Chk1、野生型Chkl、Chk1（S317A）、Chkl（S345A）和Chk1200–256体外试验。如图所示。A、 在本试验中，Chk1的每个磷酸化位点突变体具有与野生型Chk1相似的激酶活性。还检测了HeLa细胞中表达的Chk1野生型和突变型的激酶活性（图。B） 。用编码绿色荧光蛋白（GFP；第1道）、Flag-Chk1（第2道）、Flag-Chk 1（S317A，S345A）和激酶活性Flag-Ch 1（D130A）的腺病毒感染的细胞制备的裂解液与反Flag琼脂糖孵育，并测试沉淀物磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256体外试验。在本试验中，Chk1的双磷酸化突变体（第3通道）具有与野生型Chk1（第2通道）相似的激酶活性。这些结果表明，当细胞被HU处理时，Chk1磷酸化位点突变体未能被完全激活（图。)这反映了由于氨基酸替代，这些突变体不能被磷酸化，而不是激酶活性的内在缺陷。
ATR对Chk1的磷酸化。
接下来我们询问Chk1是否是体外ATR的直接底物。对激酶活性和非活性形式的ATR进行体外磷酸化Chk1的能力测试。与GST融合的Chk1（D130A）激酶活性突变体被用作这些检测中的底物。如图所示。A、 Chk1被激酶活性的（泳道2）ATR磷酸化，但不被激酶非活性的（泳道3）ATR磷酸化。分离并用胰蛋白酶消化放射性标记的Chk1，然后用Asp-N内肽酶消化。肽被二维分离，磷酸肽被放射自显影。如图所示。B、 在这些条件下检测到两种主要的磷酸肽。丝氨酸317突变导致磷酸肽1丢失（图。D） 而丝氨酸345的突变导致磷酸肽2的丢失（图。E） ●●●●。为了进一步证实磷酸肽2代表含有磷酸化丝氨酸345的肽，我们用胰蛋白酶和天冬氨酸-N内肽酶（LVQGISFpSQPTCP）消化Chk1后合成了预期的磷酸肽，并在二维磷酸肽映射后监测其位置。如图所示。B和C，合成的磷酸肽与磷酸肽2结合，证实磷酸肽2含有S345。这些结果表明，体外ATR使Chk1在丝氨酸317和345上磷酸化，表明Chk1也可能是体内ATR的直接靶点。
为了检测ATR对体内S317磷酸化的贡献，我们在293细胞中表达了激酶活性或非活性的ATR，并在紫外线处理后检测了S317的磷酸化。如图所示。F、 相对于激酶活性ATR（通道2），表达激酶活性ATR4（通道4）的细胞中，紫外线诱导的Chk1磷酸化减弱。用S317磷酸特异性抗体进行免疫沉淀证明，在表达激酶激活型ATR的细胞中，丝氨酸317上Chk1的磷酸化对紫外线的反应降低（第8车道）。以前有报道称S345在体内以ATR依赖的方式对HU、UV和IR进行磷酸化(44). 综上所述，这些结果表明，Chk1在S317和S345上被诱导磷酸化，以响应引起检查点激活的各种刺激，并且体内S317和S45上的Chk1磷酸化是ATR依赖性的。
讨论
在这项研究中，在细胞暴露于诱导各种形式的DNA损伤或干扰DNA复制的试剂后，检测人类Chk1蛋白激酶的调节。关于人类Chk1对什么样的DNA结构产生反应，以及Chk1的激酶活性是否因基因毒性应激而升高，一直存在争议。据报道，人Chk1在丝氨酸345上被诱导磷酸化，以响应HU和UV，在较小程度上，IR(44). 此外，ATR的显性阴性形式在体内干扰Chk1在丝氨酸345上的磷酸化(44). 然而，尚未确定人类Chk1是否因体内基因毒性应激而在其他部位磷酸化，磷酸化是否调节人Chk1的激酶活性，或者人类Chkl是否是ATR的直接靶点。
在本研究中，丝氨酸317和345被鉴定为体内磷酸化位点和体外ATR磷酸化位点。此外，激酶激活型ATR的表达干扰了体内丝氨酸317上紫外线诱导的Chk1磷酸化。以前有报道称，激酶激活的ATR也会干扰体内丝氨酸345上由紫外线诱导的Chk1磷酸化。这些发现以及ATR在调节细胞对紫外线和HU反应中的作用表明，体内ATR可能直接磷酸化丝氨酸317和345上的人类Chk1。爪蟾Chk1在其C末端包含四个SQ/TQ共有位点，并且所有四个位点都可以在体外被ATR磷酸化(26). 缺乏所有四个磷酸化位点的Chk1突变形式的表达消除了爪蟾复制块和紫外线损伤DNA的提取物(26). 这些发现突出了真核生物中ATR-Chk1检查点通路的保守性。
人类Chk1在其C末端有五个ATM或ATR共识磷酸化位点（SQ/TQ）。其中包括丝氨酸317、345、357、366和468，每个丝氨酸之后都是谷氨酰胺。丝氨酸317和345是Chk1中发现的唯一两个来自其他物种的保守序列，包括裂变酵母，秀丽隐杆线虫,爪蟾、和果蝇属此外，人Chk1中包括丝氨酸317和345及其周围的残基包括最佳的ATM或ATR共有磷酸化位点(35). 有趣的是人类C末端的缺失爪蟾Chk1能有效激活其内在激酶活性，表明C末端起负调节器的作用(12,51). ATR对Chk1的磷酸化可能有助于减轻这种C末端抑制功能，从而在细胞对基因毒性应激的反应中激活Chk1。除了激活Chk1的蛋白激酶活性外，磷酸化还使Chk1在凝胶过滤柱上洗脱更快。需要进行更多研究，以确定人Chk1磷酸化形式的更快洗脱特征是否是Chk1与细胞蛋白结合、多重聚合或经历构象变化的结果。在检查点激活的摘录中，爪蟾Chk1已被证明与卡环蛋白（一种215-kDa蛋白）结合，并且与爪蟾检查点诱导的Chk1激活需要Chk1和卡环(37).
尽管Chk1在整个进化过程中高度保守，但Chk1响应的信号在真核生物中发生了分化。在裂变酵母中，Chk1对IR或甲基甲磺酸甲酯以及UV诱导的DNA损伤作出反应(66,67). 在爪蟾，Chk1被DNA复制块和紫外线损伤的DNA激活，而不是被IR诱导的双链DNA断裂激活。在本研究中，我们报告了人Chk1由HU、UV、足叶乙甙、顺铂和ara-C激活，但IR激活较差。HU通过抑制核糖核苷酸还原酶来阻止DNA复制，但随后可能导致DNA损伤。ara-C是一种核苷类似物，与DNA结合并干扰DNA聚合酶，而聚合酶又会在DNA复制和DNA修复过程中干扰DNA链的延长(48,64). 紫外线和顺铂干扰DNA双链的螺旋结构，从而抑制DNA复制(19). 足叶乙甙是一种DNA拓扑异构酶II抑制剂，可导致双链DNA断裂(11). IR还诱导双链DNA断裂，但不能有效地向人类Chk1发出信号。DNA拓扑异构酶II的一个功能是在DNA复制后和有丝分裂前解缠结的子染色单体。因此，依托泊甙对拓扑异构酶II的抑制也导致染色单体连环检查点的激活(18)这可能部分解释了依托泊苷而非IR导致Chk1激活的原因。因此，当DNA复制被直接阻断（即被HU等试剂阻断）或被禁用（ara-C、UV、顺铂）时，人类Chk1被激活，但被IR诱导的双链DNA断裂激活较差。此外，当细胞识别到由于试图跨修饰或损坏的碱基复制而导致的不匹配时，Chk1可能被激活。Chk1在DNA复制期间的基因组监测中的重要作用可能解释了为什么Chk1的破坏会导致小鼠早期胚胎死亡(44,61).
本研究和其他地方报告的数据表明，ATR直接位于Chk1上游的通路中，对未复制DNA和某些形式的DNA损伤作出反应。在这些途径中也可能存在Chk1的几个下游细胞靶点。在人类中，裂变酵母，以及爪蟾，Chk1已被证明在促进14-3-3蛋白结合的一个或多个残基上磷酸化Cdc25(38,54,56,72,73). 通过表达不能与14-3-3蛋白结合的Cdc25突变体，已经在一些生物体中证明了14-3-3-Cdc25相互作用的功能重要性。DNA复制检查点和/或G中的扰动2-在表达Cdc25非14-3-3结合突变体的细胞中观察到DNA损伤检查点(39,54,72,73). 14-3-3结合缺失导致裂变酵母中Cdc25的核积累，爪蟾和人类组织培养细胞(16,24,25,36,45,70,73). 因此，Chk1的一个功能可能是作为细胞对检查点激活反应的一部分，将Cdc25C排除在细胞核之外。Cdc25A蛋白磷酸酶也被认为是人类Chk1的靶标。最近的一项研究报告称1紫外线损伤DNA诱导的细胞周期阻滞需要泛素介导的Cdc25A蛋白水解，而这又需要Chk1(46). Chk1在体外也被证明能直接磷酸化Cdc25A，尽管其功能意义未被检测(56). 需要进一步研究以确定人类Chk1的其他底物。
