分子细胞生物学。2001年6月；21(11): 3684–3691.
顺铂以ΔMEKK1-依赖方式诱导Bak的促凋亡构象
,1 ,1 ,2 ,2 ,三 ,三 ,4 ,1 ,1和1,*
亚历克桑德拉·曼迪奇
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
克里斯蒂娜·维克托森
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
马格努斯·莫林
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都文京区东京都医院，4日本
Göran Akusjärvi公司
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
江口英太郎
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
Shin-Ichi Hayashi先生
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
Masakazu Toi公司
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
约翰·汉森
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
Stig Linder公司
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都文京区东京都医院，4日本
玛丽亚·肖珊
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1以及乌普萨拉大学BMC医学生物化学和微生物学系，S-751 23乌普萨拉，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都文京区东京都医院，4日本
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系卡罗林斯卡癌症中心镭血红素研究实验室，s-171 76，1乌普萨拉大学BMC医学生物化学与微生物学系，地址：S-751 23 Uppsala，2瑞典，齐塔马癌症中心研究所，Kita-adachigun，Saitama 362-0806，三和东京都会医院，4日本
2000年9月20日收到；2000年11月29日要求的修订；2001年2月22日接受。
摘要
在一组四种人类黑色素瘤细胞系中，等毒性剂量的顺铂在凋亡执行阶段之前诱导了Bcl-2家族蛋白Bak的促凋亡构象。因为顺铂诱导的相关Bax蛋白的调节仅见于一个细胞系，因此表明Bak信号具有一定程度的特异性。对Bak活动的上游调控知之甚少。在本研究中，我们检测了由MEKK1激酶片段（ΔMEKK1）介导的凋亡特异性途径是否参与观察到的Bak调节。我们报道了MEKK1激酶活性片段（显性阴性MEKK[dnMEKK]）的表达有效地阻断了顺铂诱导的Bak和细胞色素的调节c（c）释放，从而也减少了DEVDase的激活和核碎裂。因此，激酶活性MEKK1片段（显性阳性MEKK）的表达足以在三个细胞系中诱导Bak的调节，并在其中两个细胞系诱导凋亡。dnMEKK没有阻断顺铂诱导的c-Jun N末端激酶（JNK）激活，这与ΔMEKK1通路的特异促凋亡作用一致。最后，我们发现反义Bak减少Bak的表达可以减少顺铂诱导的乳腺癌细胞系线粒体完整性损失和caspase裂解活性。总之，我们已经确定Bak是促凋亡、JNK非依赖性ΔMEKK1通路下游顺铂调节成分。
线粒体通透性增加是许多药物诱导凋亡的关键事件，并导致许多凋亡相关蛋白的释放，例如AIF、DIABLO和细胞色素c（c）来自线粒体膜间隙。细胞色素c（c）是凋亡小体复合体的一个组成部分，激活前蛋白酶9，而后激活效应半胱天冬酶，特别是半胱氨酸蛋白酶3和半胱天蛋白酶7（DEVDases）(20).
凋亡过程中线粒体通透性的调节是复杂的，但Bak和Bax发挥着关键作用，这两个促凋亡的Bcl-2家族成员有助于线粒体孔的形成，允许细胞色素的释放c（c）(16,25). 在葡萄孢霉素诱导的凋亡中，Bak和Bax的这种功能最近被证明涉及两种蛋白的构象变化，而不是表达增加(5,10). 其他药物和Bax突变体也获得了类似的结果(10,18). 然而，关于上游凋亡信号是如何传递到这些蛋白质的，我们知之甚少。
应激激活蛋白激酶（SAPK）途径一直是细胞凋亡研究的热点。然而，c-Jun N-末端激酶（JNK）/SAPK亚型的作用尚不清楚，因为据报道，它们具有促进生存的功能和促凋亡的功能，这取决于信号传导环境(三). JNK/SAPK上游的激活剂包括ASK1、MEKK1和Tpl-2(三). 基因毒素、抗Fas连接和细胞黏附丧失（anoikis）等不同因子诱导的细胞凋亡均涉及JNK/SAPK的激活和MEKK1的蛋白水解裂解，导致组成活性激酶片段（ΔMEKK1）(1,4,27).
提出了全长和劈开MEKK1的作用模型(1,27). 根据该模型，活化的全长MEKK1可能是涉及JNK/SAPK的生存途径的一部分，而ΔMEKK1参与细胞凋亡信号的扩增。据报道，ΔMEKK1的过度表达对几种细胞类型是致命的，它还可以使细胞对基因毒性损伤敏感，例如顺铂引起的损伤(13,27,28). 尽管该模型表明ΔMEKK1与参与细胞凋亡控制的分子相互作用(27)，尚未确定ΔMEKK1途径的下游成分。
顺铂是一种广泛使用的破坏DNA的抗癌药物，可激活JNK(23,30,31)并诱导MEKK1裂解和caspase活化(27). 与大多数化疗药物一样，肿瘤可能表现出对顺铂的固有或后天耐药性。反应变异的临床问题引发了对许多耐药机制的研究和认识，例如DNA修复增加(21). 然而，考虑到顺铂的反应性和细胞对DNA损伤反应的复杂性，顺铂诱导的凋亡信号可能涉及多种途径。
由于其在caspase激活中的作用，在本研究中，我们研究了促凋亡的ΔMEKK1通路以及Bak和Bax在顺铂诱导人转移性黑色素瘤细胞凋亡中的作用。
材料和方法
细胞和顺铂治疗。
我们通过评估不同剂量治疗24小时后的细胞核碎片来筛选四种人类转移性黑色素瘤细胞系（224、FM55、AA和DFW）的顺铂敏感性（表). 所有四个细胞系的Bcl-2蛋白水平与Western blotting检测结果相似。只有224细胞系表达突变型p53。作为最敏感的细胞系，选择224个细胞进行阻断顺铂诱导凋亡的实验。使用的顺铂浓度为20μM。MCF-7乳腺癌细胞及其两个稳定表达反义Bak的亚系(6)也用于评估Bak在顺铂诱导的细胞凋亡中的作用。所有细胞系均保持在37°C的5%CO中2在添加胎牛血清（10%）的RPMI培养基中，我-谷氨酸、青霉素和链霉素。
表1
| 细胞系 | 劳埃德50一（微米） | 调制b条（平均值±标准偏差）
|
|---|
| 贝克 | 巴克斯 |
|---|
| 224 | 20 | 2.7 ± 1.0 | 1.0 ± 0.3 |
| FM55型 | 23 | 2.4 ± 1.4 | 1.4 ± 0.2 |
| AA公司 | 40 | 3.5 ± 0.2 | 1.0 ± 0.1 |
| DFW公司 | 60 | 2.3 ± 0.8 | 0.7 ± 0.5 |
评估细胞凋亡。
用细胞解离溶液（Sigma-Aldrich）收获细胞，将其重悬于50至100μl含有30mM甘油的低渗盐溶液中，并涂抹在载玻片上。将气干涂片在丙酮-甲醇（2:1）中固定5分钟，然后用溴化乙锭（蒸馏水中为5 ng/ml）覆盖5分钟。在自来水中冲洗后，用UV显微镜检查染色细胞。每个样品至少计数100个细胞，并评估每个样品中具有浓缩和碎片细胞核的细胞的百分比。
除了细胞色素c（c）通过对Ac-DEVD-AMC底物的DEVDase活性的定量（CaspACE分析；Promega）和使用Ac-LEHD-AMC（酶系统产品公司）作为底物的类似caspase 9分析，也可以评估细胞凋亡。将收集的细胞离心，在冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，并在裂解缓冲液中重新悬浮（25 mM HEPES[pH7.5]，5 mM MgCl25 mM EDTA、5 mM二硫苏糖醇、2 mM苯甲基磺酰氟、每毫升10μg胃蛋白酶抑制素和亮肽）。细胞在液氮中通过三个冻融循环进行裂解。将裂解液离心（16000×克; 20分钟），收集上清液部分。根据制造商的说明分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。标记底物裂解时产生的荧光与样品中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性成正比。向所有具有半胱天冬酶活性的样品中添加DEVD或LEHD抑制剂会消除整个信号。
dnMEKK和dpMEKK的诱导表达。
将MEKK1显性阴性突变体（dnMEKK；37-kDa激酶片段，带有K432M点突变）或显性阳性MEKK1突变体（dpMEKK，37-kDa活性激酶片段）的cDNA克隆到重组腺病毒载体中，用于诱导型腺病毒基因转移系统(17)，由两个重组腺病毒载体组成，一个编码反式激活蛋白（adeno-rtTA），另一个编码感兴趣的蛋白。组成性表达的激活蛋白rtTA需要诱导剂（强力霉素[DOX]，一种四环素衍生物）进行构象改变，使其能够结合并激活感兴趣基因的启动子。
单元格（106/培养皿）接种，6小时后感染aden-dnMEKK和aden-rtTA构建物（每个细胞5到10个PFU）。在存在1μM DOX的情况下20小时后，用新添加的DOX对细胞进行后孵育，或在存在新添加DOX的条件下用顺铂处理细胞。Western blotting证实dnMEKK表达。因为最初发现DOX在5μM或更高浓度时会自行诱导细胞凋亡，这与对几种类型细胞（例如骨肉瘤）的类似作用是一致的(7)随后在所有样品中加入1μM DOX。诱导dpMEKK表达的程序与诱导dnMEKK的程序相同。
蛋白质印迹分析。
细胞提取蛋白（20μg）通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上进行Western印迹。使用了以下抗体：抗磷酸化JNK（Biolabs）、抗MEKK1（Santa Cruz Biotechnology）、抗DNA-PK（Labvision）、抗细胞色素c（c）（PharMinen），抗细胞色素c（c）氧化酶亚基IV（分子探针）、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（癌基因研究产品）和抗管蛋白（Sigma-Aldrich）。Tubulin被用作加载的内部标准。
细胞色素c（c）释放。
在dnMEKK存在或不存在的情况下，用20μM顺铂处理细胞（224细胞系）20 h。收获后（107每个样品的细胞数），细胞离心（600×克，5分钟，4°C），在冰镇PBS中洗涤，并再次悬浮在3体积的隔离缓冲液中（20 mM HEPES-KOH[PH7.5]，250 mM蔗糖，10 mM KCl，1.5 mM MgCl2每毫升含1 mM EDTA、EGTA和二硫苏糖醇、2 mM苯甲基磺酰氟、20μg亮肽、10μg抑肽酶和胃蛋白酶抑制素）。在冰上冷却15分钟后，细胞在玻璃均质器中被40次敲打破坏。匀浆以700×克之后为2500×克在4°C下保持10分钟。12000×离心后克通过Western blotting分析上清液组分中的细胞色素蛋白（25μg）（30 min，4°C）c（c）使用针对线粒体细胞色素的抗体监测相同样品中可能的线粒体污染c（c）氧化酶亚基IV。
Bak和Bax相关IFL的流式细胞术分析。
诱导凋亡后，促凋亡Bax和Bak蛋白发生构象变化，从而暴露出无法进入的N末端表位(10,11). 在本研究中，我们使用了两种被证明能特异识别这些表位的抗体。使用异硫氰酸荧光素（FITC）结合二级抗体，可以通过流式细胞术（荧光激活细胞分选[FACS]分析）监测这些表位可及性的增加(10). 在顺铂治疗后的特定时间点，使用细胞分离液（Sigma）分离细胞。然后将细胞固定在多聚甲醛中（0.25%，5分钟），在PBS中洗涤三次，并用小鼠抗Bak氨基酸1至52（AM03，克隆TC100；癌基因研究产品）或抗Bax氨基酸12至24（克隆6A7；PharMinen）的单克隆抗体孵育30分钟。抗体在含有洋地黄素（100μg/ml）的PBS中以1:50稀释。在PBS中洗涤三次后，用FITC-标记的抗鼠抗体培养细胞30分钟，在PBS内洗涤两次，然后在PBS重新悬浮。还制备了使用无关初级抗体（兔抗MEKK1）的阴性对照。使用Cell Quest软件在FACSCalibur流式细胞仪上分析细胞（10000个/样本）。为了量化结果，首先通过电子门控将细胞碎片排除在分析之外。从荧光高于fI的细胞中的Bak/Bax相关免疫荧光（IFL）中值减去无关抗体样品（fI）的荧光中值。数据显示为IFL比对照水平增加了一倍。
结果
顺铂诱导黑色素瘤细胞系224中Bak的促凋亡构象，而不是Bax。
人类黑色素瘤细胞系224对顺铂（50%致死剂量[LD50]，20μM[表])诱导细胞凋亡，如核分裂和细胞色素所示c（c）释放、激活DEVDases（具有类似底物特异性的caspase 3和7）和caspase 9，以及通过DNA-PK裂解（见下文）。
体内，细胞色素c（c）促凋亡Bcl-2家族蛋白Bak和Bax促进释放(25). 为了检测Bak和Bax的促凋亡构象变化，我们在洋地黄素存在下培养对照细胞和顺铂处理的细胞，使用识别Bak和Bax N末端表位的单克隆抗体。FITC-偶联二级抗体允许通过流式细胞术检测结合的抗Bak/Bax抗体。结果图或直方图中向右移动表示Bak/Bax相关IFL增加。
通过这种方法，我们首次表明，顺铂诱导Bak促凋亡构象的增加，如用20μM顺铂处理16小时的224个细胞所示（图。A） ●●●●。14和18小时时也出现了类似的变化（未显示）。相比之下，顺铂治疗在16小时时没有导致Bax调节（图。B） ●●●●。Staurosporine治疗（1μM；5 h）确实导致Bax调节（图。C） 这表明，在224个细胞中，这种作用并没有构成性地消除。Western blotting证实对照细胞和顺铂处理细胞中的Bak蛋白水平相似（图。D） 。在其他三种人类黑色素瘤细胞系中，发现大约等量的顺铂也能诱导Bak调制，而Bax调制并不是一个普遍特征，仅在FM55细胞中可见（表).
顺铂诱导Bak而非Bax的调节。如图所示，在制备样本用于Bak或Bax相关IFL的FACS分析之前，用顺铂（20μM，16 h）或staurosporine（1μM，5 h）处理人黑色素瘤224细胞。对照细胞，灰色峰值；处理过的细胞，黑线。（A） 顺铂治疗后Bak相关IFL；（B） 顺铂治疗后Bax相关IFL；（C） 星形孢菌素治疗后Bax相关IFL；（D） Western blot显示对照细胞和顺铂（CISPL）治疗16小时后的Bak蛋白水平。使用微管蛋白（β-TUB）作为内部负荷对照。Ig2a、免疫球蛋白2a。
dnMEKK阻断顺铂诱导的细胞凋亡和细胞色素c（c）释放但不激活JNK。
由于Bak和Bax功能最终导致caspase激活，并且凋亡特异性ΔMEKK1通路隐含在caspase活化中(1,27,28)，我们检测了激酶活性和非活性ΔMEKK1突变体对Bak/Bax调节、caspase激活和顺铂诱导的凋亡中的核碎裂的影响。腺病毒载体系统(17)用于诱导表达包含MEKK1激酶域的dpMEKK和携带失活点突变（K432M）的dnMEKK。
在预先诱导表达dnMEKK的224个细胞中，顺铂诱导的核碎裂显著减少（图。). 同样，dnMEKK在其他三种细胞系中抑制了50%至75%的核分裂（未显示）。dnMEKK的表达本身不会导致核分裂，也不会激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或导致DNA-PK断裂（见下文）。仅用adeno-rtTA感染和随后的DOX治疗并没有阻断核碎裂，这表明阻断不是一种非特异性的腺病毒介导的效应。
dnMEKK对顺铂诱导的核碎裂的影响。在有无腺-dnMEKK的情况下，用20μM顺铂处理细胞。顺铂治疗前20 h用DOX诱导dnMEKK表达。（A） 顺铂治疗16和24小时后224个细胞的核碎裂；（B） Western blot显示dnMEKK（37 kDa）在相同样本中表达。在未受感染的细胞提取物中也可以看到微弱的内源性条带，因此不是由于渗漏。实验重复进行，结果相似。
顺铂诱导细胞色素释放c（c）在20小时时，在224个表达dnMEKK的细胞中被废除（图。A） ●●●●。确认dnMEKK阻断细胞色素上游c（c）我们使用白桦酸（BA）作为凋亡诱导剂。据报道，BA对线粒体有直接影响，导致线粒体通透性转变，随后出现细胞色素c（c）释放、caspase激活和核碎裂(8). 同意dnMEKK阻断细胞色素上游的事件c（c）释放后，dnMEKK既没有阻止BA诱导的凋亡（未显示），也没有阻止16和24小时时看到的BA诱导的DEVDase激活（图。B） ●●●●。
dnMEKK阻断细胞色素上游c（c）释放而不阻断JNK激活。用20μM顺铂或每毫升15μg BA处理224个细胞，在有无aden-dnMEKK的情况下。药物治疗前20 h用DOX诱导dnMEKK的表达。（A） 细胞色素的蛋白质印迹c（c）（CYT.C）在加入顺铂（CISPL）后20小时的胞浆提取物中。还用抗线粒体细胞色素氧化酶亚基IV的抗体探测膜，以确保提取物（未显示）不会受到线粒体污染。β-桶。，微管蛋白。（B） 在指定的时间点，在细胞提取物（50μg）中测定BA（BET.ACID）诱导的DEVDase活性。结果显示为相对于对照细胞的折叠激活。（C） 顺铂诱导的JNK1和-2活化，如在有或无dnMEKK的情况下，在指定的时间点磷酸化所示，通过Western blotting使用磷酸化的JNK1和-2（P-JNK1和-2）特异性抗体进行评估。Tubulin被用作内部负荷控制。
因为治疗3到12小时之间JNK的持续激活暗示着顺铂诱导的细胞凋亡(23)用磷酸化JNK1和JNK2特异性抗体评估第4、7和16小时的JNK活性。在这些时间点，顺铂诱导的JNK1和-2磷酸化以及dnMEKK的表达并没有阻断这种作用（图。C） ●●●●。
进行时间进程实验以确定何时需要表达dnMEKK来阻止凋亡。DOX处理2小时后，突变体没有表达，而4小时后出现了一些表达（图。A） ●●●●。当顺铂后2小时添加DOX时，凋亡被阻断的程度与添加顺铂时表达dnMEKK的细胞相同（图。B） ●●●●。甚至后来添加的DOX也对细胞凋亡提供了一些保护（图。B） ●●●●。本实验表明，dnMEKK对细胞凋亡的抑制发生在加入顺铂后的4～6小时。
延迟诱导dnMEKK表达阻止核分裂。（A） Western blot显示添加DOX后不同时间点37-kDa dnMEKK表达。（B） 通过在指定的时间点添加DOX，诱导224个感染了aden-dnMEKK的细胞表达dnMEKK，这与0h时添加顺铂的时间（20μM）有关。在24h时评估核分裂水平，并与在没有aden-dn MEKK时诱导的分裂相比较。
dnMEKK阻断半胱天冬酶激活。
如果dnMEKK阻断细胞色素c（c）释放，它还应该阻止caspase激活。224个细胞中顺铂诱导的DEVDase活性在24小时时表现出15倍的增加（图。). dnMEKK的表达部分抑制了这种激活（图。). 通过减少顺铂诱导的DNA-PK（一种核caspase 3底物）裂解，在相同的样品中证实了DEVDase活性的阻断（图。).
dnMEKK阻断顺铂诱导的DEVDase活性。在存在或不存在aden-dnMEKK的情况下，用20μM顺铂处理224个细胞，持续指定的时间。顺铂治疗前20 h用DOX诱导dnMEKK表达。收获后，对细胞进行凋亡、DEVDase分析和western blotting。凋亡水平，被视为核分裂，显示在相关的条形图上。填充条，在指定的时间点在细胞提取物中测量对合成底物（Ac-DEVD-AMC）的DEVDase活性。结果显示为相对于对照样品的活性诱导。空条，DNA-PK的切割，通过蛋白质印迹膜上160kDa蛋白水解片段的密度扫描进行评估。结果显示为相对于对照样品的碎片水平。
然后，在有无dnMEKK的情况下，对顺铂治疗后几个时间点的细胞提取物进行DEVDase和caspase 9/LEHDase活性分析（图。). 这些实验证实，DEVDase活性在13小时及其后出现显著增加，并且这种增加部分被dnMEKK抑制（图。A） ●●●●。作为LEHDase活性的胱天蛋白酶9的酶促测定在13小时和19小时分别显示1.6倍和3倍的活化（图。B） ●●●●。这种caspase 9/LEHDase活性在dnMEKK的存在下进一步受到抑制（图。B） ●●●●。为了证实这一结果，我们对胱天蛋白酶9进行了蛋白质印迹。纤溶酶9的35-kDa活性裂解片段在13至16小时时呈微弱条带，在顺铂治疗19小时时很容易观察到（图。C） ●●●●。根据酶分析，发现dnMEKK在所有三个时间点都降低了片段信号（图。C） ●●●●。在试图通过Western blotting检测这些细胞中的DEVDase裂解片段时，我们始终未能用一系列市售的抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和7抗体检测到任何片段。
顺铂诱导的DEVDase和caspase 9/LEHDase活性动力学。224个细胞在没有或存在腺-dnMEKK的情况下，用20μM顺铂处理指定的时间段。顺铂治疗前20 h用DOX诱导dnMEKK表达。空棒，仅顺铂；填充棒，在dnMEKK存在下进行顺铂治疗。（A） 对每个重复样品的合成底物Ac-DEVD-AMC上的DEVDase活性进行两次评估。抑制剂DEVD-CHO将所有平行样品中的所有活性降至背景值。结果显示，未经处理（对照[C]）的细胞活性增加了倍。（B） 合成底物Ac-LEHD-AMC上的半胱氨酸蛋白酶9/LEH酶活性。抑制剂LEHD-CHO将所有平行样品中的所有活性降至背景值。（C） 通过半胱天冬酶9的Western blotting分析细胞提取物（30μg/lane）。35-kDa裂解片段代表活性形式。β-TUB。，微管蛋白；CISPL，顺铂。
dnMEKK阻断顺铂诱导的Bak调制。
根据细胞色素上游的阻断效应c（c）在224个细胞中释放caspase 9并激活，发现dnMEKK可以阻断顺铂诱导的224和AA细胞中的Bak调节（图。). dnMEKK没有阻断staurosporine诱导的Bak调节（未显示），表明该途径具有一定程度的特异性。
dnMEKK阻断顺铂诱导的Bak调节。（A） 224个细胞在没有或存在腺-dnMEKK的情况下用20μM顺铂处理16小时。顺铂治疗前20 h用DOX诱导dnMEKK表达。所示为指示Bak相关IFL的重叠FACS图。灰色峰值，对照细胞；暗线，如图所示，在有或无dnMEKK的情况下进行顺铂治疗。（B） 224和AA细胞系中存在或不存在dnMEKK时顺铂诱导的Bak调制的定量。用LD处理细胞50顺铂（CISPL.）。结果显示，与对照组相比，中位数IFL信号增加了倍。
dpMEKK诱导Bak调节和凋亡。
MEKK1的组成活性激酶片段已被证明对凋亡信号的放大很重要(1,27,28). 使用与dnMEKK相同的方案，用表达MEKK1的组成型活性37kDa激酶片段（dpMEKK）的腺病毒载体感染细胞。在诱导后24小时，dpMEKK在AA、FM55和DFW细胞中诱导了Bak调制，但在224个细胞中没有（图。A） ●●●●。dpMEKK在224或DFW细胞中未诱导凋亡，而在FM55和AA细胞中分别诱导了19%和13%的凋亡（图。B） ●●●●。
dpMEKK诱导Bak调节和凋亡。（A） 用腺-dpMEKK感染细胞，并在添加DOX后24小时评估Bak相关IFL。为了进行比较，LD诱导的16小时Bak调制50还显示了顺铂（CISPL）的s。结果显示，与对照组相比，中位数IFL信号增加了倍。（B） 用adeno-dpMEKK感染细胞，并在添加DOX后24小时评估细胞核碎片。对照细胞中的背景水平有所不同，但不超过6%。
顺铂和dpMEKK对Bax的调节。
在四分之三的细胞系中，顺铂治疗16小时或dpMEKK均不能诱导Bax调节。因此，FM55细胞是独一无二的，因为它们是两种治疗中唯一显示Bax调节的细胞（图。). Staurosporine对224和AA细胞的处理表明，在这些细胞系中Bax调节并没有被成分性地消除（图。).
Bax调制的诱导。在添加顺铂（CISPL）后16 h或添加DOX后24 h评估Bax相关IFL，以诱导腺-dpMEKK感染细胞中的dpMEKK表达。还显示了staurosporine（STSN；1μM，5 h）对224、AA和FM55细胞Bax调节的影响。
反义Bak减少顺铂诱导的凋亡反应。
由于dnMEKK阻断了顺铂诱导的Bak调节和凋亡，我们也希望检测顺铂对表达反义Bak的细胞的影响。因此，我们比较了顺铂对亲代MCF-7乳腺癌细胞和两个稳定表达反义Bak的亚系的影响(6). 由于MCF-7细胞缺乏caspase 3的表达，因此可能存在异常的DNA片段，因此使用一种抗体M30来评估细胞凋亡，该抗体专门识别细胞角蛋白18的caspase-叶片段，该片段可被活化的caspase而非caspase 2裂解(2,6). M30抗体用于细胞凋亡的免疫组织化学检测，或如我们在这里所做的那样，用于酶联免疫吸附测定（ELISA）系统（瑞典斯德哥尔摩Peviva AB）(14). 我们发现，在添加20μM顺铂后21小时，与亲代细胞相比，表达反义Bak的细胞系中细胞角蛋白18的半胱氨酸蛋白酶裂解显著减少（图。A） ●●●●。顺铂治疗也能诱导线粒体去极化，这种作用在表达反义Bak的细胞中被阻断，但在亲代细胞中没有被阻断（图。B） ●●●●。
减少表达反义Bak的细胞的凋亡反应。用20μM顺铂处理父母MCF-7和两个稳定表达反义Bak的亚克隆21小时。（A）根据制造商的指示，通过ELISA定量细胞裂解液中细胞角蛋白18的Caspase-片断来评估Caspase活性（凋亡ELISA试剂盒；Peviva AB）。结果显示为抗体M30特异性识别的片段水平的倍数增加。（B） 在重复样品中测定线粒体跨膜电位，作为四甲基罗丹明乙酯（TMRE；Molecular Probes Inc.）的保留物，这是一种阳离子、亲油性荧光染料，积聚在带负电的线粒体基质中。线粒体去极化，如凋亡期间所见，定量为通过流式细胞术评估的TMRE荧光信号的损失。结果显示，线粒体去极化的细胞比例增加了倍，即在对照组中显示TMRE信号中位数小于中位数信号的5%的细胞。AS#8和AS#9是稳定表达反义Bak的克隆。
讨论
Bax和Bak是Bcl-2家族的促凋亡成员，与细胞色素有关c（c）释放(16,25)，其促凋亡功能依赖于特定的构象变化(5,10,11,18). 这是首次报道表明顺铂诱导的凋亡涉及Bak的凋亡构象的诱导。因此，在所测试的四种细胞系中，近似等毒性的顺铂治疗导致了核分裂开始之前的Bak调节。在突变型p53（224个细胞）和其他三种表达野生型p53的细胞系中均观察到Bak调制。与Bak相反，Bax仅在其中一个细胞系（FM55）中受到影响。这表明Bak信号具有一定程度的特异性。
在基因毒性应激或抗Fas治疗诱导的凋亡中，已经暗示了一条涉及凋亡前细胞中组成活性MEKK1片段（ΔMEKK1）的特异途径(1,4,27)可能是通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(24)，尽管分子细节尚不清楚。我们在这里使用激酶活性和非活性MEKK1片段突变体来研究Bak和Bax、caspase激活以及顺铂诱导凋亡中促凋亡MEKK1通路之间的关系。我们发现37-kDa激酶激活的MEKK1突变体（dnMEKK）抑制顺铂诱导的Bak、细胞色素的调节c（c）释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和核碎裂。
由于顺铂诱导的Bak调制和核碎裂受dnMEKK的影响，我们研究了dpMEKK是否会产生与顺铂类似的作用。首先，我们发现dpMEKK信号可能足以诱导细胞凋亡。因此，在AA和FM55细胞中，dpMEKK诱导了一些凋亡；这在FM55细胞中更高，其中dpMEKK同时调节Bak和Bax。尽管dpMEKK在克隆形成试验中已被证明在2周内抑制一系列细胞系的生长(24)，这是第一项显示24小时内诱导凋亡的实际能力的研究。其次，我们发现，与顺铂一样，dpMEKK表达可能足以诱导Bak调制，如AA、FM55和DFW细胞系中所示。
这些发现的例外情况表明，在某些细胞系中，Bak的调节和/或其作用除了需要dpMEKK提供的信号外，还需要一个信号，顺铂可能会诱导这种信号。这可能解释了224个细胞对dpMEKK诱导的反应的抵抗。DFW细胞对dpMEKK诱导的Bak调节的弱凋亡反应可能反过来解释为最近发现一些转移性黑色素瘤由于甲基化导致基因失活而失去Apaf-1的表达(26). 由于Apaf-1在线粒体事件下游caspase激活中的作用，降低Apaf-1水平将阻止caspase活化，但不会阻止Bak调节等线粒体事件。
除通过ΔMEKK1外，其他顺铂诱导信号的存在也表明dnMEKK非常有效地阻断了Bak调节和细胞色素c（c）在224个细胞中释放，而DEVDase激活和核碎裂仅减少一半。这表明存在Bak-independent，dnMEKK不敏感的DEVDase激活，应该是细胞色素c（c）独立。另一种可能性是存在具有不同激活机制的不同胞内caspase 3池，因为有报道称caspase三前体既有细胞溶质分布又有线粒体分布，可能具有不同的激活模式(12,15,32).
据报道，顺铂诱导的细胞凋亡需要JNK激活(23,30)令人感兴趣的是，dnMEKK在不抑制JNK活化的情况下抑制细胞凋亡。当诱导剂（DOX）的添加时间晚于顺铂时，细胞凋亡也受到抑制。需要DOX处理约4小时才能诱导dnMEKK表达，这意味着当JNK已经激活时，dnMEKKK不表达。因此，dnMEKK在该系统中的阻断作用至少与早期JNK激活无关。
凋亡诱导剂对JNK的激活不一定依赖于MEKK1，因为紫外线对MEKK1缺陷细胞的JNK激活没有受损(29)而dnMEKK1并没有通过肿瘤坏死因子α阻断JNK的激活(27). 据报道，顺铂介导的JNK激活与SEK1无关(19). 如果是这样，它与经典的MEKK1通路无关，dnMEKK不应阻断。推测dnMEKK敏感性JNK激活是否与dnMEKK-敏感性、Bak-independent DEVDase激活有关是很有趣的。
总之，我们在这里证明，顺铂诱导的凋亡涉及Bak的凋亡构象的诱导，而Bax的类似调节并不是一个普遍特征。根据Bak在顺铂诱导的凋亡中的作用，我们还发现，与亲代MCF-7细胞相比，稳定表达反义Bak的MCF-7亚克隆对顺铂的凋亡反应显著降低。Bak调制和随后的细胞色素c（c）释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9激活均被激酶阴性的MEKK1片段（dnMEKK）阻断。相反，激酶活性的MEKK1片段（dpMEKK）能够诱导Bak调节和凋亡。因此，我们的发现将上游激酶活性与凋亡执行阶段的线粒体事件联系起来。
致谢
K.V.和A.M.为这项工作做出了同等贡献。
我们感谢T.Maniatis慷慨提供dn-和dpMEKK的质粒结构，感谢M.Varsanyi分析p53状态。
这项工作由瑞典癌症协会和斯德哥尔摩癌症协会资助。K.V.得到了瑞典战略研究基金会的资助。
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