液体活检鉴定肝癌免疫治疗的生物标志物

肝癌免疫治疗的常规生物标志物

到目前为止，用于癌症免疫治疗的传统生物标记物可分为以下几类：PD-L1的表达、特异性遗传特征/体细胞突变、肿瘤突变负荷（TMB）、dMMR/MSI（失配修复缺陷/微卫星不稳定性）、肿瘤微环境（TME）和肠道微生物组。直观地说，PD-L1是癌症免疫治疗的理想生物标记物。Gao等人首次报道了PD-L1在HCC中的表达状态，并提供了靶向PD-1/PD-L1途径的免疫疗法的基本原理[4]. 其他研究人员也报告了PD-L1表达与HCC生存率低下之间的正相关关系，这进一步支持了ICIs在这类HCC患者中的应用[5——7]. 此外，邻近肝组织中PD-L1的高表达预示着总生存期（OS）和无病生存期（DFS）较短，这意味着肿瘤周围肝组织中的PD-L1表达也可以作为根治性肝切除术后辅助免疫治疗的指标[8]. 然而，CHECKMATE-040的nivolumab和KEYNOTE-224的pembrolizumab在二线治疗晚期肝癌中的批准与PD-L1或免疫细胞表达无关[9,10]. 此外，PD-L1在肝癌中的表达并不总是很高[11]限制了其作为肝癌免疫治疗生物标记物的实用性。

有趣的是，对于接受肝移植（LT）并经历复发的HCC患者，PD-L1的表达是ICI治疗的坚实禁忌症[12]. 肝移植后HCC的复发在很大程度上是由免疫抑制剂带来的免疫抑制微环境引起的，因此ICI可能为这些患者提供生存益处。尽管有报道称，肝移植术后复发、播散性肝癌患者成功地接受了ICIs治疗[13,14]应该注意到，在这些LT受体中引入ICIs必然会提高免疫力，并可能导致器官排斥和肝衰竭。因此，只有PD-L1染色阴性的患者才能使用ICI治疗LT后肿瘤复发。

TMB已被发现与多种癌症中抗PD-1治疗的活性高度相关[15]它已被美国食品和药物管理局（FDA）批准作为pembrolizumab治疗不同肿瘤类型的标准。在可切除的肺癌中，TMB可预测新辅助PD-1阻断患者的病理反应[16]. 基于下一代测序（NGS）的基因组分析工作已经报道了一些高TMB相关的基因特征，这些特征可能促进抗肿瘤免疫，并作为肝癌ICIs的生物标记物[17].

与TMB部分相似，dMMR的癌症基因组包含异常高数量的突变相关新抗原，可能被免疫系统识别。例如，患有dMMR的结直肠癌（CRC）具有较高的免疫原性，并且对PD-1抗体的免疫检查点阻断敏感[18,19]而在显示MSI或dMMR的转移性CRC中误诊MSI或dMMR状态将导致原发性耐药ICI[20]. 在可切除的原发性胃癌患者中，MSI-H可以强有力地预测免疫治疗反应，并与较长的DFS和OS相关[21]. 同样，最近一项随机对照试验的荟萃分析，包括III期KEYNOTE-062、CheckMate-649、JAVELIN Gastric 100和KEYNOTE-061试验，也表明MSI-H是晚期胃癌患者免疫治疗的积极预测因素[22]. 在患有终末期癌症的危重患者中，建议将MSI-H状态作为肿瘤不可知的预测性生物标记物用于临床实践，以选择挽救性免疫治疗的候选者[23]. 事实上，dMMR/MSI-H状态在多种实体瘤中的重要性已得到进一步验证，并证明对不同来源肿瘤的免疫治疗具有高度反应，FDA已批准加速批准成人和儿童患者使用抗PD-1抗体pembrolizumab治疗不可切除/转移的dMMR或MSI-H癌症[24].

从字面上看，TME和肠道微生物组肯定会在免疫治疗中发挥重要作用，尤其是对于肝癌。通过基于转录组的免疫分析，免疫微环境（包括Wnt/β-catenin激活、PD-L1的高联合阳性评分和HCC中CD8+细胞浸润增加）与接受ICI治疗的HCC患者的更长生存期显著相关[25]. 通过分析HCC中免疫调节基因的表达谱，Cao等人发现了4种不同存活率的HCC免疫亚型：B7-H3患者^低的/CD8（CD8）^高的或CD47^低的/CD8（CD8）^高的B7-H3组表现最好^高的/CD8（CD8）^低的或CD47^高的/CD8（CD8）^低的生存状况最差。这种免疫分类系统可以帮助选择将从ICI治疗中受益的HCC患者[26]. PD1-high CD8+T细胞离散群肝癌可能受益于基于免疫检查点阻滞的联合治疗[27]. 非酒精性脂肪性肝炎（NASH）相关的异常T细胞激活导致组织损伤，从而导致免疫监视功能受损，这可能是非病毒性肝癌，尤其是NASH-HCC对免疫治疗反应较低的原因[28].

肠道微生物组对先天性和适应性免疫的发展和调节至关重要，也可能影响ICI的治疗结果[29,30]. 肠道轴表明肝脏和肠道之间存在密切联系，越来越多的证据表明微生物组在HCC的发展中起着关键作用[31——34]. 因此，肠道微生物组在肝癌的免疫治疗中可能特别有意义。事实上，在接受ICI治疗的HCC患者中，应答者和非应答者在肠道菌群的多样性和组成方面存在显著差异[35]. 肠道微生物组特征的动态变化可以预测免疫治疗的疗效，有助于疾病监测和决策[36]. 尽管还没有报道肠道微生物组与HCC患者ICI治疗效果的相关性，但在疾病控制患者中仍然存在富集的微生物组亚克隆[37].

肿瘤异质性挑战了现有生物标记物在免疫治疗中的作用

到目前为止，很少有生物标志物被成功地转化为肝癌的临床意义。这种生物标记物导向免疫治疗的一个可能原因是肿瘤的异质性。肿瘤异质性是致癌的关键特征，与药物治疗失败有关[38,39]. 肝癌是一种典型的基因组高度异质性肿瘤[40]，表观遗传[41]，转录[42]和蛋白质[43]级别。单细胞分析还表明，肝癌干细胞由表型、功能和转录组异质性亚群组成[44]. 即使如此，肝癌的肿瘤异质性仍然可以分为以下四类：患者间异质性表示同一肿瘤组织学患者之间的差异，肿瘤间异质性意味着同一患者肿瘤病灶之间的差异、肿瘤内异质性（ITH，空间异质性）是同一肿瘤病灶的细胞之间的差异，时间异质性描述了肿瘤在治疗过程中的时间变化。

这四种类型的异质性共同导致药物治疗失败。患者间异质性意味着一个简单的生物标记物可能不适合整个患者群体，个性化ICI治疗模式对于更好的治疗反应是必要的。然而，肿瘤内和肿瘤间异质性的共存，后者更为深刻，多灶性肿瘤在肝癌中普遍存在，这对精确的免疫治疗提出了挑战，因为单个肿瘤活检评估PD-L1表达或基因组信息分析不能代表整个肿瘤的景观，更不用说多灶性肝癌了。因此，可能发生初级处理阻力。即使对于最初敏感的肿瘤，治疗期间选择性压力导致的时间异质性也会导致耐药肿瘤细胞罕见亚克隆的扩张，并认为药物最终会失效。事实上，免疫治疗患者肝肿瘤的单细胞转录组学分析发现，肿瘤细胞状态异质性的增加与治疗反应和患者预后密切相关[45].

液体活检是肿瘤免疫治疗的潜在生物标志物

在过去的几年里，液体活检已成为一种吸引人的新生物标记物来源，并广泛用于包括肝癌在内的癌症的治疗[46]. 因此，评估ICI治疗益处预测因子的研究显示，对液体活检的兴趣正在兴起。分析人员包括液体活检，包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）、淋巴细胞亚群、外泌体和代谢产物等。液体活检与传统的单部位组织取样或血清蛋白标记物相比有几个优点，包括更高的敏感性和特异性、非无效性、动态监测，最重要的是克服了时空异质性的限制[47]. 对于HCC，组织通路并不总是很容易获得，单个活检很难代表整个遗传信息，更不用说在多发性巨大HCC的情况下了。在治疗过程中（TACE、靶向治疗和免疫治疗），克隆进化产生的选择压力必然导致肿瘤基因组改变和耐药性，最终导致治疗失败。然而，治疗前组织活检的遗传信息并不能帮助治疗决策。同时，重复肿瘤活检具有侵袭性，在临床实践中不可操作。在这种情况下，液体活检可能非常有用，因为静脉穿刺几乎是非侵入性的，并且来自ctDNA和CTC的遗传信息已被证明代表了肿瘤基因组[48]. 因此，通过液体活检的应用，它能够揭示更全面的肿瘤基因组，并动态监测治疗过程中的基因变化[49]. 一般来说，液体活检可以帮助选择候选肝癌患者，这些患者将从几个方面受益于免疫治疗。

个性化免疫治疗的实施

理想情况下，评估肿瘤组织中PD-L1的表达可以预测ICI反应；然而，对循环细胞外囊泡中PD-L1 mRNA和蛋白水平的评估越来越感兴趣，这可能有助于预测抗PD-1/PD-L1抗体的反应[50,51]. 例如，转移性前列腺癌患者的CTC异质性表达免疫检查点，包括B7-H3、PD-L1、PD-L2和CTLA-4，这表明使用这些免疫检查点检测CTC可能会选择适合免疫治疗的患者[52]. 在接受免疫治疗的转移性泌尿生殖道癌患者中，基线时CTC计数较高，并且存在特定的CTC形态亚型PD-L1⁺CTC与较短的生存期相关[53]. 同样，在头颈部鳞状细胞癌患者中，PD-L1过表达的CTC具有预后作用，治疗结束时CTC中PD-L1无过表达与完全缓解密切相关[54]. 检测HCC患者外周血中PD-L1阳性CTC是可行的，为实时监测和个体化免疫治疗奠定了基础[55].

另一方面，肝癌患者基于NGS的ctDNA检测可能对精确免疫治疗非常有用。ctDNA携带大量来自肿瘤组织的遗传信息，可以作为肿瘤活检的补充，也可以单独提供高覆盖率的肿瘤基因组图谱[56]. 不仅TMB，而且遗传特征和MSI/dMMR都可以通过ctDNA分析进行分析。在携带实体瘤的小病例系列的第一阶段试验中，根据ctDNA计算出的TMB与肿瘤组织的形成相关，并在治疗期间观察到应答者的突变变异等位基因频率降低[57]. 通过回顾性分析，Gandara等人发现ctDNA TMB可重复鉴定非小细胞肺癌（NSCLC）患者，这些患者的PFS从阿替佐单抗的二线或更高水平治疗中获得了临床显著改善[58]. 最近，用于从血浆样本中定量bTMB的商业ctDNA平台被证明是可行的、准确的和可重复的，最佳ctDNA TMB截止值≥20 mut/Mb，预测使用杜瓦鲁单抗+特雷米单抗与化疗的临床疗效[59]. 更重要的是，如果用含有更多突变的面板或更大的面板进行分析，ctDNA可以更准确地反映组织TMB[60,61]在接受ICIs治疗的非小细胞肺癌患者中，ctDNA中较高的TMB与较长的PFS相关[62].

通过cfDNA测序分析肿瘤突变是预测免疫治疗结果的另一个有效生物标志物[63]. C类TNNB1公司据报道，基因突变可以预测肝癌患者对免疫治疗的反应[64,65]但肿瘤内部的异质性和多灶肿瘤的存在对单个活检的综合分子分析提出了挑战。此外，在免疫疗法之前进行的肿瘤活检的突变分析并不能确保在整个病程中持续的治疗反应。然而，ctDNA可以提供在单个肿瘤活检中不明显的肿瘤突变的额外信息，结合ctDNA和肿瘤组织的分析可以提高肿瘤的检出率CTNNB1公司突变[66]. 更常见的是，ctDNA已被证明可在所有HCC分期中量化，并可专门检测关键驱动基因的突变[67].

NGS已被批准在ICI治疗前检测转移性CRC患者的MSI/dMMR，据报道，该方法的效率至少与参考方法相同[68]. 将NGS与液体活检相结合来鉴别患有MSI-H的癌症患者在临床上是可行的，并可能克服肿瘤组织活检的局限性和侵袭性[69]. 最近的一份报告显示，基于NGS的液体活检可用于临床实践中的MSI评估：2名转移性去势抵抗前列腺癌患者，他们多行治疗失败，在ctDNA检测中检测到MSI-H，显示出对pembrolizumab的良好临床反应[70]. 因此，建议将ctDNA的NGS或CTC的单细胞测序用于肝癌的MSI/dMMR分析是合理的。

辅助免疫治疗候选人的选择

肝切除术后5年HCC复发率高达70%，需要辅助治疗以防止治愈性肝切除术后复发[71]. 辅助免疫治疗对黑素瘤根治术后患者的生存有益处[72]、食管癌或胃食管交界癌[73]. 因此，建议在肝癌中使用这种药物是合理的，尤其是在复发风险高的患者中。事实上，免疫治疗可能在这种临床环境中发挥关键作用[74]：用活化的自体细胞因子诱导的杀伤细胞进行辅助免疫治疗可提高肝癌治疗患者的无复发和总生存率[75]. 尽管评估肝切除术后辅助免疫治疗效果的临床试验仍在进行中（表2)外科肿瘤学家已经为高复发风险患者开了ICI，这并不罕见。

辅助免疫治疗适应症的潜在机制可能在于微小残留病（MRD），这意味着播散性肿瘤细胞（DTC）从原发病灶到远处器官，在最初治疗时没有任何临床或放射学证据表明有转移，或在有效的手术后残留肿瘤细胞，最终导致局部复发。MRD的存在可高度预测肿瘤的复发和转移。此外，DTC可以利用PD-L1等检查点配体的表达来逃避TIL的抗肿瘤活性，这意味着基于ICI的抗癌策略可能与MRD特别相关。因此，肝癌患者MRD的鉴别有助于精确的辅助免疫治疗，而液体活检对MRD的检测显示出极高的敏感性[76]. 例如，在局限性结肠癌中，术后血浆ctDNA检测到MRD，并确定患者复发风险高，放射性复发前的中位提前期为11.5个月[77].

事实上，液体活检引导的辅助免疫治疗已经证明对癌症患者的生存有益。在III期IMvigor010研究中，辅助atezolizumab不会延长未经选择的接受手术的尿路上皮癌患者的DFS；然而，在那些ctDNA检测呈阳性的患者中，观察到DFS和总生存率都有所改善[78]. 相比之下，在整个研究人群中，血液中ctDNA阴性的试验参与者之间没有发现这种差异[79].

在HCC中，微血管浸润（MVI）意味着邻近肝组织中存在播散性肿瘤细胞，是常见的MRD类型。有趣的是，肝切除术后ctDNA阳性状态与MVI相关，并预测HCC的早期肿瘤复发[80]. 同样，HCC患者肝切除术后CTC负荷立即下降，而那些术后持续高CTC负荷的患者肿瘤复发的可能性很高[81]. 此外，术后CTC负荷≥3的患者在肝癌根治性手术切除后肝外转移的风险较高，应建议他们进行密切监测，及时实施干预措施[82]. 事实上，术后CTC计数被发现是辅助TACE（经导管动脉化疗栓塞）给药的有效指标，因为辅助TACE可以减少意图肝切除术后CTC呈阳性的HCC患者的早期复发[83]. 因此，检测术后ctDNA状态或CTC负荷可能是肝癌患者术后的可行选择，ctDNA阳性表达或CTC负载可能是辅助免疫治疗的指征。更常见的是，无论辅助ICI治疗的类型，甚至其他方式如何，确定MRD阳性HCC患者肯定会带来额外的益处。

动态治疗监测

液体活检除了作为辅助免疫治疗的指标外，还可以动态监测ICI治疗反应，尤其适合[84——87]（表三). 传统上，治疗反应主要通过影像学上肿瘤大小的比较来判断。但这种评估存在灵敏度低、放射性强、最重要的是不够及时的缺点。此外，免疫治疗的治疗效果很难解释，因为肿瘤通常因炎症而缓慢缩小或扩大（放射伪进展）。更重要的是，免疫治疗过程中的选择压力可能会导致克隆进化，这意味着肿瘤基因组与治疗前的图谱不同。不幸的是，传统技术几乎不可能通过纵向和实时分析动态监测这些变化。

然而，液体活检有可能以动态和无创的方式确定肿瘤的演变模式和治疗反应。在肺癌和尿路上皮癌中，ctDNA体细胞突变的变异等位基因频率的变化与ICIs治疗持续时间、活性和预后密切相关[88]. CTC上的CTC数量和PD-L1表达都可能表明接受ICI的尿路上皮癌患者在疾病过程中的疾病进展[89]. ctDNA水平降低是ICIs治疗肺癌患者疗效的早期标志，并预示着患者生存期显著延长[90]. 黑色素瘤患者免疫治疗期间使用定制NGS基因面板进行ctDNA纵向分析以监测疾病负担[91]治疗期间ctDNA持续升高表明预后不良，有必要对后续治疗进行联合和排序[92]. 此外，免疫治疗期间基线未检测到的ctDNA或基线可检测到的ctDNA随后下降10倍以上与假进展相关，而经历真正进展的患者基线可检测出的ctDNA保持稳定或增加[93]. 这些经验可供肝癌患者参考。事实上，来伐替尼治疗期间的ctDNA分析是疾病进展的有用标记[94]使用靶向超深测序对ctDNA进行序列分析，并与系统治疗反应相关[95].

没有。