分子细胞生物学。2000年11月；20(21): 8035–8046.
p85α调节亚基三种不同基因产物对磷酸肌醇3-激酶依赖信号通路的正调控和负调控
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Joslin糖尿病中心研究部02215
2000年3月23日收到；2000年5月8日要求的修订；2000年8月9日接受。
摘要
磷脂酰肌醇（PI）3-激酶是胰岛素依赖性代谢作用的关键介质，包括刺激葡萄糖转运和糖原合成。p85α调节亚单位的基因产生三种剪接变体，即p85α、AS53/p55α和p50α。这三种结构都具有（i）C末端结构，由两个Src同源2结构域组成，位于p110催化亚基结合结构域的两侧，以及（ii）分别由304、34和6个氨基酸组成的独特N末端区域。为了确定这些调节亚单位在生理条件下对酶活性和胰岛素受体底物（IRS）蛋白信号转导的影响是否不同，我们使用腺病毒介导的基因转移，在p110α催化亚基共表达或不共表达的情况下，在完全分化的L6肌管中表达每个调节亚基。与p50α相关的PI3-激酶活性大于与p85α或AS53相关的活性。增加p85α或AS53水平，但不增加p50α，抑制磷酸酪氨酸相关和p110相关的PI 3-激酶活性。缺乏p110结合位点（Δp85）的p85α突变体的表达也抑制磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性，但不抑制p110相关的活性。胰岛素刺激PI-3激酶、Akt和p70 S6激酶下游的两种激酶（p70S6K系列)在表达p85α或AS53的细胞中减少，但在表达p50α的细胞中没有减少。对PI 3-激酶、Akt和p70的类似抑制S6K系列观察到，即使p110α与p85α或AS53共表达。p110α的单独表达显著增加了葡萄糖转运，但降低了糖原合成酶的活性。当p110α与三种调节亚基中的任何一种共表达时，这种作用减弱。因此，调节亚单位的三种不同亚型可以以不同的效率将IRS蛋白的信号传递到p110催化亚单位。它们还对PI 3-激酶催化活性进行负调节，但程度不同，取决于每个亚型的独特N末端结构。这些数据还表明存在一种机制，通过这种机制，调节亚单位可以独立于激酶活性调节PI 3-激酶介导的信号，可能通过催化亚单位的亚细胞定位或与其他信号分子的相互作用。
经刺激后，激活的胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化几个细胞内底物，从而刺激多种代谢和有丝分裂作用(20,37). 这是通过磷酸化胰岛素受体底物（IRS）蛋白与许多Src同源性2（SH2）域蛋白（包括Grb2、SHP2和Ia类磷脂酰肌醇（PI）3-激酶）之间的相互作用发生的(37). 大量证据表明，PI 3-激酶在胰岛素调节的碳水化合物、脂质和蛋白质代谢中起着关键作用(34). PI 3-激酶依赖性信号传导介导这些代谢效应的机制尚不清楚，因为这些生物终点对胰岛素非常特异，但与酪氨酸磷酸化受体或其底物相关的PI 3-激酶活性增加是激素、生长因子、，和细胞因子信号通路(34,37).
Ia-PI类3-激酶由一个调节亚单位和一个110-kDa催化亚单位（p110）组成。p110的三种亚型（α、β和δ）是独立的基因产物，根据其结合调节亚单位的能力被鉴定为Ia类(11). 其中，p110α和p110β都与胰岛素信号有关，尽管它们之间的功能差异尚不清楚(34). 已鉴定出至少八种调节亚基亚型，所有这些亚型均可通过SH2结构域与IRS蛋白上的pYXXM或pYMXM基序结合(38). 从结构上看，它们可以根据长度分为两类。p85α和p85β属于调控亚单位的全长版本，由一个SH3结构域、一个Bcr同源结构域（两侧有两个富含脯氨酸的结构域）、一个N末端SH2（nSH2）结构域、包含p110结合位点的间SH2（iSH2）区域和一个C末端SH2结构域组成(27). 此外，调控亚单位的两个截短版本AS53（也称为p55α）(2,18)和p50α(10,19)，是来自p85α基因的剪接变体。它们与p85α具有共同的nSH2-iSH2-cSH2结构，但缺少SH3结构域、N末端富含脯氨酸结构域和Bcr结构域；取而代之的是它们独特的N末端，分别由34和6个氨基酸组成。另一个被截断的调节亚单位是p55PIK公司，由一个独特的基因编码，但具有与p85α高度同源的nSH2-iSH2-cSH2结构和与AS53相似的34-氨基酸N末端(29). 此外，已知p85α和AS53（可能还有p50α）有另一个剪接变体，其中九氨基酸插入取代位于iSH2结构域中靠近调节性磷酸化位点的天冬氨酸(2). 虽然不同组织中表达水平的差异表明每个亚型都有特定的作用，但尚不清楚为什么存在这些调节亚单位的多个亚型，或者每个亚型的生理作用是什么。各种胰岛素敏感性组织和细胞几乎表达所有八个调节亚单位。p85α通常是主要的亚型，而AS53和p50α的表达水平是可变的，取决于组织和细胞类型(2,19)和代谢条件(1,22). p85β与IRS蛋白结合(33)但据报道，胰岛素几乎没有刺激作用(19)因此其对胰岛素作用的影响是有争议的(34).
为了探索不同调节亚基的生理作用，我们使用腺病毒介导的基因转移，在完全分化的L6肌管中表达了p85α、AS53和p50α，无论是否含有p110α。我们发现，三种不同的调节亚单位以不同的效率介导PI 3-激酶依赖信号，并且都对PI 3-激酶催化活性进行不同程度的负调控，这取决于每个亚型的独特N末端结构。这些数据表明，细胞和组织中调节亚单位的平衡对于适当的生理信号可能是必要的，这种平衡的变化可以影响下游胰岛素的作用，导致胰岛素敏感性的改变。
材料和方法
腺病毒的产生。
如前所述，克隆了人p85α和AS53的cDNA(2)，并将每个克隆的编码区域亚克隆到pBluescript。将流感病毒血凝素（HA）序列标签（YPYDVPDYA）添加到每个克隆中，以代替原始终止密码子，从而产生p85α-HA和AS53-HA。通过用p50α的N端独特序列（MHNLQT）取代AS53的前34个氨基酸序列，产生了p50α-HA cDNA(10,19). 将每一个亚克隆到pSVSPORT哺乳动物表达载体中，并用生态RI和速度I.两端钝化后，将cDNA片段连接到斯瓦pAdex1CAwt cosmid盒的I位置(25). 重组腺病毒Adex1CAp85α-HA、Adex1CAAS53-HA和Adex1CA p50α-HA是通过表达载体盒和亲本病毒基因组之间的同源重组构建的(25). Masato Kasuga（神户大学）善意地提供了一种重组腺病毒，该病毒编码缺乏p110结合位点的突变型p85α（Adex1CAΔp85）(31). Lewis Cantley（马萨诸塞州波士顿Beth Israel-Deaconess医疗中心）善意地提供了N端带有c-Myc表位标签的小鼠p110α的cDNA。它还被子克隆到斯瓦I定位pAdex1CAwt粘粒盒，然后构建重组腺病毒Adex1CA p110α。对照腺病毒Adex1CALacZ和cosmid盒由Izumi Saito（东京大学）提供。
细胞培养和腺病毒感染。
L6细胞保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，并如前所述诱导分化为肌管(36). 分化细胞在含有腺病毒的培养基中37°C培养1h；添加补充有胎牛血清的DMEM，培养细胞24小时。细胞在剥夺血清20小时后进行检测。将腺病毒应用于每个实验所指示的MOI（感染多重性）。在这些条件下，lacZ公司通过β-半乳糖苷酶检测，在感染后第1天到第4天，90%以上的L6细胞中观察到基因表达。
抗体。
针对p85α的大鼠N末端SH2结构域产生的p85α（αp85pan）所有亚型的兔多克隆抗体从Upstate Biotechnology Inc.购买。针对与人类p110α的189至390氨基酸对应的肽以及针对p110α、-β和-δ（αp110pan）的肽产生的兔抗p110α抗体（αp110α）针对与人类p110β的800-1039氨基酸对应的肽生成的肽购自圣克鲁斯生物技术公司。从Upstate Biotechnology购买针对人类Akt1的pleckstrin同源结构域产生的兔多克隆抗Akt抗体（αAkt），而p70 S6激酶（p70S6K系列)-特异性抗体（αp70S6K系列)，针对与485至502位大鼠p70对应的肽生成S6K系列以及针对与人类GSK3α的氨基酸408至483相对应的肽生成的GSK3β（αGSK3γ），购自Santa Cruz Biotechnology。针对与小鼠Akt1的Ser473相对应的磷酸丝氨酸肽产生的兔抗磷酸化Akt（α磷酸化-Akt）多克隆抗体和抗磷酸化p70的抗体S6K系列（α-磷酸-p70S6K系列)针对与人类p70的Ser411相对应的磷酸丝氨酸肽生成S6K系列，购自新英格兰生物实验室公司。小鼠单克隆抗卵磷脂抗体4G10购自Upstate Biotechnology。针对与YPYDVPDYA序列相对应的肽产生的小鼠单克隆抗HA抗体（αHA）购自Boehringer Mannheim Corp.。如前所述，产生兔抗IRS-1（αIRS-1）和IRS-2（αIRS-2）的多克隆抗体(17).
免疫沉淀和蛋白质印迹。
在血清饥饿20小时后，用胰岛素处理细胞达指定时间，然后用含有25 mM Tris-HCl（pH 7.4）、2 mM Na的缓冲液A溶解细胞三沃4，10 mM氟化钠4P（P）2O（运行）71 mM EGTA、1 mM EDTA、10 nM冈田酸、亮氨酸肽（5μg/ml）、抑肽酶（5μg/ml）、1 mM-苯甲基磺酰基氟化物（PMSF）和1%Nonidet-P40。用上述抗体之一对裂解产物进行免疫沉淀，并将其固定在蛋白A或G-Sepharose微球上。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，对裂解产物或免疫沉淀物进行Western印迹，并通过增强化学发光（Boehringer Mannheim）进行可视化。
PI 3-激酶分析。
将具有αHA、αp85α、4G10或αp110α的免疫沉淀物用缓冲液A洗涤三次，用PI3-激酶反应缓冲液（20mM Tris-HCl[pH 7.4]、100mM NaCl、0.5mM EGTA）洗涤两次，并悬浮在50μl含有0.1mg PI（牛肝；Avanti极性脂质）/ml的PI3-激酶反应缓冲液中。通过加入5μl氯化镁引发反应2-ATP混合物（200 mM MgCl2，200μM ATP），含有5μCi的[γ-32P] 将ATP加入反应混合物中，并在25°C下培养混合物20分钟。通过添加150μl氯仿-甲醇-11.6 N HCl（100:200:2）终止反应。向每个样品中添加120μl三氯甲烷后，通过离心分离有机相，并用甲醇–1 N HCl（1:1）洗涤两次。蒸发后，将小球重新悬浮在20μl氯仿中，点在硅胶板上，并在氯仿-甲醇-28%氢氧化铵-水（43:38:5:7）中展开。通过放射自显影术观察磷酸化脂质。
体外激酶分析。
如上所述用缓冲液A裂解细胞，并用αAkt和αGSK3α对裂解产物进行免疫沉淀，然后进行Akt激酶和GSK3激酶分析(36). 对于p70S6K系列激酶分析，用含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、25 mMβ-甘油磷酸、100 mM NaCl、1 mM原钒酸钠、2 mM EGTA、亮氨酸肽（5μg/ml）、抑肽酶（5μg/ml）和1 mM PMSF的缓冲液B溶解细胞，然后用αp70免疫沉淀S6K系列(36). αPKB、αGSK3α或αp70S6K系列清洗免疫沉淀并将其重新悬浮在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）–10 mM MgCl中2–1 mM二硫苏糖醇，其中50μM ATP，5μCi[γ-32P] 在Akt激酶分析中添加了ATP和1μg Crosstide，在GSK3激酶分析中增加了1μg phospho-glycogen synthase（phosphoy-GS）肽（Upstate Biotechnology），或在S6激酶测试中增加了一μg S6肽（来自核糖体S6蛋白C末端序列的32肽；Life Technologies Inc.）。在30°C下20分钟后，停止反应，在P-81纸的正方形上发现等分样品，并用0.5%磷酸清洗，然后计算放射性。
2-DG摄取分析。
如别处所述，进行2-脱氧葡萄糖（2-DG）摄取分析(36). 细胞生长在12孔板中，并感染上述腺病毒。在用于葡萄糖摄取分析之前，用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞三次，并在37°C下在1 ml无血清DMEM中培养3 h。然后用含有130 mM NaCl的Krebs-Ringer磷酸盐-HEPES缓冲液（KRHB）清洗细胞一次2，5 mM氯化钾2，1.3 mM氯化钙2，1.3 mM硫酸镁4，10 mM钠2高性能操作4和25 mM HEPES（pH 7.4），在37°C下，在1 ml含有0.1%牛血清白蛋白的KRHB中孵育15分钟。葡萄糖摄取是通过添加2-脱氧物开始的-d日-[2,6-三H] 葡萄糖在37°C下达到最终浓度0.5μCi，持续5分钟，最后用冰镇KRHB清洗两次。用0.4 ml 0.1%十二烷基硫酸钠溶解细胞，并在闪烁计数器中计数。在存在20μM细胞松弛素B的情况下测量非特异性葡萄糖摄取，并从每次测定中减去以获得特定摄取。
GS测定。
如前所述测量GS活性(36). 如上所述，用腺病毒感染细胞，并在无血清DMEM中培养20小时。然后清洗两次，并用不含或含有100 nM胰岛素的KRBH培养20分钟。用含有25 mM Tris-HCl（pH 7.0）、30%甘油、10 mM EDTA、100 mM KF和1 mM PMSF的裂解缓冲液对细胞进行裂解。将裂解物离心，并将30μl上清液添加到60μl含有50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、25 mM NaF、20 mM EDTA、糖原（1 mg/ml）和0.1μCi UDP的分析混合物中-[14C] 葡萄糖加0.25或10 mM葡萄糖-6-磷酸。在30°C下培养30分钟后，在3MM纸（Whatman）上发现等分样品，并用70%冰镇乙醇清洗四次，然后在闪烁计数器中计算放射性。
结果
p85α-、AS53-和p50α相关的PI 3-激酶活性以及与IRS蛋白的结合。
为了阐明PI3-激酶的每个调节亚基在胰岛素信号传导中的生理作用，我们在完全分化的L6肌管中表达了p85α、AS53或p50α和C末端HA标签。使用腺病毒介导的基因转移，我们之前已经表明，这会导致高效表达，而不会调节细胞的分化功能(36). 感染后，α-HA免疫沉淀后通过Western blotting估计的每个引入亚单位的表达水平相似，至少比内源性p85α的表达水平高5倍，后者是L6肌管中的主要亚型，尽管AS53和p50α的表达也很低（图。a） ●●●●。因此，导入的蛋白质而非内源性p85α是转染细胞中PI 3-激酶信号的主要调节形式。为了评估与每种引入蛋白相关的PI 3-激酶活性，用αHA或4G10对细胞提取物进行特异性免疫沉淀，并评估每种亚型的PI 3-酶活性。如图所示。b、 与p50α相关的αHA沉淀物中的PI 3-激酶比活性约为p85α的2～3倍，与AS53相关的活性介于p85α和p50α之间。相比之下，4G10沉淀物中的PI 3-激酶活性（显示为平均值±标准差[SD]）表明，与受LacZ感染的对照组相比，p85α或AS53（而非p50α）的过度表达显著降低了与酪氨酸磷酸化蛋白相关的活性，以响应胰岛素（图。c） ●●●●。
与每个亚型和酪氨酸磷酸化蛋白相关的调节亚单位和PI 3-激酶活性的瞬时表达。（a） 每个调节亚单位的表达水平。如材料和方法中所述，以20的MOI感染完全分化的L6肌管。在含有2%血清的培养基中培养24小时后，细胞饥饿20小时，然后用100 nM胰岛素刺激5分钟。细胞裂解物经过SDS-PAGE（9%凝胶），然后用αp85pan（顶部）进行免疫印迹（IB）或用αHA进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀也用αp85pan（底部）进行Western印迹。（b） 与每个调节亚单位相关的PI 3-激酶活性。按照材料和方法中的描述，对αHA免疫沉淀物进行PI 3-激酶分析。顶部面板显示了具有代表性的结果；底部面板中的每一条代表根据至少三个独立实验计算的每个调节亚单位表达水平归一化的相对PI-3激酶活性的平均值±SD。(∗,P（P）<0.01 p85与AS53；**，P（P）<0.01 AS53与p50）。（c） PI3-激酶活性与表达每个调节亚单位亚型的细胞中酪氨酸磷酸化蛋白相关。免疫沉淀物使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10制备，并按照材料和方法中所述进行PI 3-激酶分析。左侧面板显示了具有代表性的结果；右侧面板中的每一条代表至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.01 LacZ与AS53）。
胰岛素刺激的PI 3-激酶活性取决于调节亚单位的关键作用，以将磷酸化IRS蛋白与PI 3-激酶的p110催化亚单位联系起来。为了评估每个调节亚单位和IRS蛋白之间的相互作用，我们在用αIRS-1或αIRS-2免疫沉淀后用αHA进行了Western blotting。结果表明，p85α和p50α对酪氨酸磷酸化IRS-1和IRS-2的亲和力都很高，而AS53对这两种蛋白的亲和力则低得多；p85α和p50α与酪氨酸磷酸化IRS蛋白的结合水平高于AS53（图。a） ●●●●。在过度表达人胰岛素受体的NIH 3T3细胞中观察到类似结果，其中调节亚单位使用质粒表达载体过度表达（数据未显示）。还通过使用αp110pan对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后使用αHA进行Western blotting，来评估每个调节亚基对p110催化亚基表达水平的归一化亲和力。p50α和AS53对p110具有相似的亲和力，而p85α的结合稍低，尽管差异没有达到统计学意义（图。b） ●●●●。这些数据表明，调节亚基的所有三种亚型都与p110催化亚基紧密结合，并且p85α和p50α对IRS蛋白的亲和力都高于AS53。此外，当在细胞中过表达时，p85α和AS53（但不是p50α）抑制磷酸酪氨酸相关的PI3-激酶活性。
IRS蛋白和p110催化亚基的每个亚型调节亚基的亲和力。（a） 每个亚型对酪氨酸磷酸化蛋白的亲和力。完全分化的L6肌管感染了显示的腺病毒，MOI为20。用100 nM胰岛素刺激细胞5分钟。细胞裂解物用αHA进行免疫沉淀（IP），然后用4G10（左上）进行免疫印迹（IB）。他们还用αIRS-1（左中）或αIRS-2（左下）进行免疫沉淀，然后用αHA进行Western blotting。在右侧面板中，每一条代表与每个亚型相关的酪氨酸磷酸化蛋白相对量的平均值±SD，该亚型根据至少四个独立实验的结果计算的表达水平进行了标准化。（b） 每个调节亚基亚型与p110的亲和力。细胞裂解物用αp110pan进行免疫沉淀，然后用αHA进行Western印迹。所示为代表性结果（左）和与p110相关的每种亚型相对量的平均值±SD，这些亚型是根据至少四个独立实验（右）的表达水平归一化的。
在胰岛素信号级联中，Akt和p70S6K系列位于PI 3-激酶下游。Akt和p70S6K系列表达每个亚型的细胞的活性降低到与磷酸酪氨酸相关的PI3-激酶活性相当的水平，尽管p70的降低S6K系列每个调节亚单位的表达活性低于Akt（图。).
PI 3-激酶调节亚单位亚型表达对下游激酶的影响。（a） 胰岛素诱导表达每个调节亚型的细胞中的Akt活性。按照材料和方法中的描述，在20天的MOI和2天后用100 nM胰岛素刺激5分钟，用指示的腺病毒感染完全分化的L6肌管。将细胞裂解物进行SDS-PAGE（9%凝胶），然后用αphospho-Akt（top）进行免疫印迹（IB）或用αAkt进行免疫沉淀。免疫沉淀物进行免疫复合物激酶分析。在下面的面板中，每个条形代表从至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.01 LacZ与AS53）。（b） 胰岛素诱导的p70S6K系列表达每个调节亚型的细胞活性。用100 nM胰岛素刺激20分钟后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE（9%凝胶），然后用α磷酸化p70进行Western印迹S6K系列（顶部）或用αp70免疫沉淀S6K系列免疫沉淀物进行免疫复合物激酶分析。在下部面板中，每个条形代表相对p70的平均值±SDS6K系列根据至少四个独立实验计算的激酶活性（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**；P（P）<0.05 LacZ与AS53）。
每个调节亚单位对p110 PI 3-激酶催化活性的影响。
调节亚单位对PI 3-激酶依赖信号传导的抑制作用至少有两种可能的机制。一是调节亚单位的过度表达导致IRS蛋白上占据酪氨酸磷酸化位点的亚单位的单体形式增加。通过竞争活性异二聚体，这将导致胰岛素刺激的PI 3-激酶活性及其下游信号级联的二次抑制（图。，左）。或者，调节亚基可能通过一些变构机制直接抑制p110亚基的催化活性（图。，右）。
调节亚单位抑制PI3-激酶机制的假设模型。模型1显示了调节亚单位的单体形式对IRS蛋白磷酸化位点的占领如何降低有效的PI3-激酶介导的信号。模型2表明，调节亚基可能对p110催化亚基活性产生直接的负面影响。
为了评估这两种变化，我们以不同的比率表达p85α和p110α，并测量与磷酸酪氨酸蛋白或p110催化亚单位相关的PI-3激酶活性。我们推断，如果抑制仅由调节亚基与IRS蛋白上磷酸酪氨酸残基的结合引起，则p110与调节亚基的共表达应可缓解抑制，调节亚基的过度表达至少在基础状态下不会影响p110亚基的催化活性。如图所示。a、 然而，即使p85α与p110α共表达，与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性也会随着p85α表达的增加而降低。p110和p85α的共表达对Akt和p70产生类似的影响S6K系列活动。在缺乏外源性p85α的情况下，Akt和p70S6K系列p110α的表达增加了活性，而p85α的共表达则显著降低了这些活性（图。a） ●●●●。对这两种激酶的抑制作用与磷酸酪氨酸蛋白相关的PI3-激酶活性的降低有关。另一方面，通过增加表达p110α的细胞中p85α的表达，与p110α结合的p85蛋白的量增加，而在缺乏p110α表达的情况下，它没有改变（图。a、 左上角）。这些数据表明，在没有增加p110α表达的情况下，内源性p110已经饱和于调节亚单位，而在p110α过度表达的情况，p110α比调节亚单位更丰富，部分p110以单体形式存在（至少在没有p85α过度表达时）。在这些条件下，与p110相关的基础PI3-激酶活性随着p85α表达的增加而降低（图。a、 左下角），支持调节亚基和p110亚基之间的相互作用对p110的催化活性产生抑制作用的假设。
p85α与p110α共表达对PI3-激酶活性和下游激酶的影响。（a） p85α的表达降低了与p110和磷酸酪氨酸相关的PI3-激酶活性，导致PI3-激酶下游激酶受到抑制，即使p110α同时表达。将完全分化的L6肌管与显示的腺病毒在表达为bars（从左到右分别表示0、4和20的MOI）的MOI处共同感染，并用100 nM胰岛素（Ins.）刺激5分钟。用αp85α或αp110α对细胞裂解物进行免疫印迹（IB）（左上两个面板）。他们还使用αp110α进行免疫沉淀（IP），然后使用αp85α进行Western blotting和体外PI 3-激酶分析（中间两个面板位于左侧）。左下方的面板表示从两个独立实验计算出的相对PI-3激酶活性的平均值。免疫沉淀物使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10制备，并进行PI 3-激酶分析（右上图）。右中面板表示从两个独立实验计算的相对PI-3激酶活性的平均值。底部的两个面板显示了用αphospho-Akt和αphosphal-p70进行蛋白质印迹的代表性结果S6K系列（b）缺失p110结合位点（Δp85）的突变p85α的表达抑制与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性，但不抑制与p110相关的活性。在如上所述表达的MOI处，将完全分化的L6肌管与所示腺病毒共感染，并用100 nM胰岛素刺激5分钟。其他细节如上所述。
为了进一步证实调节亚单位对p110催化活性的直接抑制作用，我们在p110α表达的情况下表达了一个缺失p110结合位点（Δp85）的突变型p85α（图。b） ●●●●。该突变体的过度表达有望通过占据IRS蛋白上的酪氨酸磷酸化位点来抑制胰岛素作用，但不应通过直接抑制机制影响基础状态下的p110催化活性。如先前在其他系统中所示(14,31)，Δp85的过表达显著降低了与酪氨酸磷酸化蛋白相关的PI3-激酶活性，从而抑制了Akt和p70S6K系列活动（图。b、 右侧）。然而，它并不影响p110相关的PI 3-激酶活性。这些数据支持调节亚单位直接抑制p110催化亚单位的假设，也表明这种直接抑制机制需要p110和调节亚单位之间的相互作用。
短形式的调节亚基对PI3-激酶和下游激酶活性有不同的影响。因此，AS53的表达降低了与p110α共表达或不共表达的磷酸酪氨酸蛋白相关的PI 3-激酶活性，而p50α的过表达在单独表达或p110α过表达的情况下都没有抑制PI 3-激酶的活性（图。). 同样，AS53或p85α的表达降低了与内源性p110相关的PI 3-激酶活性（图。). 正如预期的那样，p110α的过度表达增加了p110相关的PI 3-激酶在基础和胰岛素刺激状态下的活性，这也被p85α或AS53的共表达所抑制，而不是p50α（图。).
共表达每个调节亚单位亚型与或不与p110α对与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性的影响。（a） 表达每个调节亚型的细胞中与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性的时间进程。在MOI为20的情况下，用所示腺病毒感染完全分化的L6肌管，然后在所示时间内用100 nM胰岛素刺激。细胞裂解物用4G10进行免疫沉淀（IP），然后进行PI 3-激酶分析。所示为代表性结果（顶部）和至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**；P（P）<0.01 LacZ与AS53）（底部）。（b） 与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性在细胞中与p110α共存的每个调节亚型的时间进程。完全分化的L6肌管感染了编码调节亚单位和p110α的腺病毒，MOI为20。胰岛素刺激后，对细胞裂解物进行上述PI 3-激酶分析。所示为代表性结果（顶部）和至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.01 LacZ与AS53）（底部）。
将每个调节亚型与p110α共表达或不与之共表达对与p110相关的PI 3-激酶活性的影响。（a） 表达每个调节亚单位亚型的细胞中与p110相关的PI 3-激酶活性的时间进程。在MOI为20的情况下，用所示腺病毒感染完全分化的L6肌管，然后在所示时间内用100 nM胰岛素刺激。细胞裂解物用αp110α进行免疫沉淀（IP），然后进行PI 3-激酶分析。所示为代表性结果（顶部）和至少四个独立实验（*，P（P）<0.05 LacZ与p85；**，P（P）<0.05 LacZ相对于AS53）（底部）。（b） 细胞中与p110相关的PI 3-激酶活性的时间进程，与p110α共表达每个调节亚单位亚型。完全分化的L6肌管感染了调节亚单位和p110α的腺病毒，MOI为20。胰岛素处理细胞的裂解物进行PI 3-激酶分析。所示为代表性结果（顶部）和至少四个独立实验（*，P（P）<0.05 LacZ与p85；**，P（P）<0.05 LacZ与AS53）（底部）。
同样，Akt和p70S6K系列活性与磷酸酪氨酸相关的PI3-激酶活性的变化平行。因此，Akt和p70S6K系列与LacZ对照组相比，p110α表达增加了活性，p85α或AS53的共同表达减少了p110的这种增强，尽管p70S6K系列活性，p110α表达增加的基础活性显著高于Akt。另一方面，p50α的共表达对Akt或p70的p110刺激没有影响S6K系列（图。). 这些结果与p85α和AS53与p110的结合抑制了PI 3-激酶的催化活性，继而降低下游酶的活性这一概念一致。
每个调节亚型与p110共存对PI3-激酶下游激酶的影响。（a） 胰岛素诱导的细胞Akt活性与p110α共表达每个调节亚型。将完全分化的L6肌管在MOI为20的情况下感染所示腺病毒，然后用100 nM胰岛素刺激5分钟。细胞裂解物进行SDS-PAGE（9%凝胶），然后用α磷酸-Akt（top）免疫印迹（IB）或用αAkt免疫沉淀。免疫沉淀物进行免疫复合物激酶分析。在下面的面板中，每个条形代表从至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.05 LacZ与AS53）。（b） 胰岛素诱导的p70S6K系列与p110α共存的每个调节亚型的细胞活性。用100 nM胰岛素刺激20分钟后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE（9%凝胶），然后用α磷酸化p70进行Western印迹S6K系列（顶部）或用αp70免疫沉淀S6K系列免疫沉淀物进行免疫复合物激酶分析。在下部面板中，每个条形代表相对p70的平均值±SDS6K系列根据至少四个独立实验（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.05 LacZ与AS53）。
调节亚单位通过PI 3-激酶依赖和独立机制调节葡萄糖转运和GS活性。
胰岛素的大多数主要代谢作用，包括刺激骨骼肌中的葡萄糖转运和糖原合成，位于PI 3-激酶下游(三,7,23). 当单个调节亚单位在没有p110催化亚单位的情况下表达时，p85α和AS53都会显著降低胰岛素依赖的葡萄糖转运活性（图。). 相反，与对照组相比，表达p50α的细胞具有葡萄糖转运活性（图。). 另一方面，p110α的过表达增加了葡萄糖转运活性，即使在基础状态下，也几乎与对照细胞中胰岛素诱导的最大活性相同（图。). 与正常细胞一样，任何调节亚单位与p110α的共表达都显著降低了增强的葡萄糖转运活性，p85α或AS53共表达的这种降低幅度大于p50α共表达的幅度（图。b） ●●●●。值得注意的是，p50α与p110α共存的细胞具有几乎相同水平的PI 3-激酶、Akt和p70S6K系列细胞仅表达p110α，但葡萄糖转运仍然减少。因此，这种对葡萄糖转运的抑制可能是由于除调节PI 3-激酶活性之外的一种效应。
表达含有或不含有p110α的每种调节亚型对胰岛素诱导的葡萄糖转运活性的影响。细胞在12孔培养皿中生长，并在MOI为20时感染所示的腺病毒。感染后一天，用指定浓度的胰岛素处理细胞，并进行材料和方法中所述的2-DG摄取试验。结果表示为表达LacZ的未经处理细胞的比值。每个条形代表至少四个独立实验的平均值±SD。
当调控亚单位单独表达时，胰岛素刺激的GS活性与磷酸酪氨酸蛋白相关的PI 3-激酶活性相关，即按p85α>AS53>p50α的顺序降低（图。a、 左），尽管AS53和p50α之间的差异没有达到统计意义。尽管一些研究表明PI3-激酶活性是激活GS所必需的(30,39)令我们惊讶的是，与LacZ对照组相比，p110α单独表达显著降低了GS活性（图。a、 右侧）。然而，这一发现与最近的一些研究一致，这些研究表明，野生型或活化形式的PI 3-激酶催化亚基表达可以抑制GS活性(8,9). 另一方面，Akt活性已被证明足以激活L6细胞中的GS(7,36)在表达p110α的细胞中增加到与表达LacZ的细胞相当的水平。有趣的是，在表达p110α的细胞中，GSK3是Akt下游的一种酶，对GS活性起负调节作用，在基础状态下显著增加，并且在胰岛素刺激后与表达LacZ的细胞中的基础活性保持几乎相同的水平（图。b） ●●●●。GSK3活性的增加可能导致表达p110α的细胞中胰岛素对GS的激活较差。
表达带有或不带有p110α的每个调节亚型对GS和GSK3活性（a和b）GS活性的影响。在MOI为20时感染所示腺病毒一天后，细胞饥饿20小时。用100 nM胰岛素处理30分钟，然后按照材料和方法中的描述进行GS分析。通过将0.25 mM葡萄糖-6-磷酸（配体依赖活性）测得的活性除以10 mM葡萄糖-6磷酸（总活性）测得的活性，将每个结果转换为确定的活性比。每个条形代表至少四个独立实验的平均值±SD。（a） p110α表达缺失时的GS活性（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.05 LacZ与AS53）；（b） p110α表达（*，P（P）<0.01 LacZ与p85；**，P（P）<0.01 LacZ与AS53；***，P（P）与p50相比，<0.01 LacZ）。（c） GSK3激酶活性。在MOI为20的情况下感染所示腺病毒一天后，细胞饥饿20小时，然后用100 nM胰岛素处理20分钟，并用αGSK3α进行免疫沉淀。免疫沉淀用于材料和方法中所述的激酶分析。结果以表达LacZ的未处理细胞最大值的百分比表示。每个条形代表至少四个独立实验的平均值±SD（*，P（P）<0.01 LacZ与带有p110的LacZ相比；**，P（P）与p110的AS53相比，p110的LacZ＜0.01，P（P）与p110的p50相比，p110的LacZ＜0.01）。
讨论
在过去的几年里，大量证据表明PI 3-激酶在胰岛素的代谢作用中起着核心作用(34,37). PI 3-激酶活性已被证明是必需的，在某些情况下，足以进行多种胰岛素的代谢和有丝分裂作用，包括葡萄糖转运(5,9,14,21,26)，糖原合成(30,39)，蛋白质合成(24)和DNA合成(5,9). PI 3-激酶是一种异源二聚体，其中调节亚基和催化亚基以多种亚型出现，是不同基因产物和选择性剪接的结果(11,34). 已有研究表明，调节亚单位p85α、AS53/p55α和p50α（p85α基因的产物）参与胰岛素信号传导，并且有研究表明，每种亚单位都可能具有特定的生理作用(2,19,33). p85α基因所有剪接亚型的破坏导致新生儿死亡(12)但我们实验室最近的研究表明，在杂合子状态下，胰岛素敏感性增加，可能是由于p85α和p110的更有效耦合所致（F.Mauvais-Jarvis、K.Ueki、D.Fruman、D.Accili、L.C.Cantley和C.R.Kahn提交发表）。仅缺乏长型p85α的转基因小鼠对胰岛素表现出超敏反应，表明p50α或其他短型亚型具有代偿性，甚至可能改善信号传导(35). 此外，我们和其他人已经证明，在胰岛素抵抗的肥胖动物中，肝脏中p85α的表达降低，而AS53/p55α和p50α的表达高于其瘦肉同胞(1,22). 考虑到敲除小鼠的数据，这些肥胖动物中调节亚单位表达的改变可能是对胰岛素抵抗状态的一种补偿反应。这些发现表明，正常代谢和发育可能需要p85α基因的不同剪接亚型，并且每个亚型可能具有某些不同的信号特征。事实上，一些报告表明，每种亚型对p110和磷酸化蛋白都有不同的亲和力(2,19,33)尽管其机制和生理意义尚不清楚。
在本研究中，我们已经表明，在对葡萄糖代谢具有重要生理意义的组织之一骨骼肌中，与p50α相关的PI 3-激酶活性大于与p85α或AS53相关的PI 3-kinase活性。与每个调节亚基相关的PI 3-激酶活性的差异可以通过每个调节亚单位对p110或IRS蛋白亲和力的差异来解释。在这方面，p85α和p50α比AS53更有效地结合酪氨酸磷酸化IRS蛋白，而AS53和p50β对p110的亲和力略高于p85α。因此，p110和IRS蛋白的亲和力不太可能是定义每个调节亚单位介导的PI 3-激酶活性的唯一因素。如其他人所述(19,21)αHA或αp85pan沉淀（数据未显示）中胰岛素刺激的总体水平很小，表明只有一小部分调节催化亚基复合物与IRS蛋白结合并被胰岛素激活。
在表达p50α的细胞中，与磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性（往往反映生物反应信号的强度）远大于表达p85α或AS53的细胞。有趣的是，p85α或AS53的表达，而不是p50α，会降低PI 3-激酶活性和下游激酶Akt和p70的激活S6K系列与LacZ表达控制相比。这一发现的可能解释之一是，当调节亚单位在没有额外催化亚单位的情况下过度表达时，它们作为单体占据IRS蛋白上的磷酸化位点，从而通过PI 3-激酶异二聚体抑制有效的PI 3-激酶信号。事实上，这种竞争性抑制已经通过p85信号缺失突变体的过度表达表现出来，例如缺乏p110结合位点的p85α突变体（Δp85）(14,31)或p85α的孤立SH2结构域(32). 这解释了为什么过表达p85α的细胞中磷酸酪氨酸相关的PI 3-激酶活性低于表达内源性p85α对照细胞中的活性。这也可以解释为什么尽管p50α相关的PI 3-激酶活性高于p85α或AS53相关的活性，但p50α的表达并没有使磷酸酪氨酸相关的PI 3激酶活性高于控制水平。然而，这可能不是调节亚基对PI3-激酶依赖性信号传导的唯一抑制机制，因为p85α或AS53的过表达，而不是p50α的过表达，也会降低基础状态下p110相关的PI3-激酶活性。这种效应在p110共表达的情况下更为明显，可能是因为内源性p110似乎几乎被调节亚单位饱和了。后一种效应似乎是由于调节亚基对p110催化活性的直接抑制作用，表明这些亚基之间存在变构相互作用。Δp85的表达不能抑制基础p110活性，即使存在p110α的表达，也支持这种变构抑制的存在。
调节亚单位的抑制作用似乎取决于分子N末端的结构，因为这是这三种亚型之间唯一不同的区域。然而，尚不清楚调节亚单位是直接抑制p110催化活性，还是通过与调节亚单位的N末端区域相互作用的其他分子抑制p110的催化活性。事实上，我们使用酵母双杂交系统（K.Ueki和C.R.Kahn，未发表的数据）获得了几个与AS53的N末端独特区域相互作用的克隆，并且已知有几个分子与p85的N末端半部分相互作用(4,13,16,28). 因此，与每个调节亚基的N-末端区域相互作用的特异性蛋白可能有助于p110催化活性的差异调节。
这项研究首次证明了调节亚基可以在体内以不同的效率抑制p110活性和PI3-激酶依赖性信号传导。Yu及其同事此前在体外系统中显示了p85调节亚基对p110的抑制和稳定作用(40,41). 最近，Harpur及其同事表明，p85调节亚单位也可能通过N-末端富含脯氨酸区域和SH3结构域的分子间相互作用，或可能通过Bcr同源结构域的相互作用，以同二聚体的形式存在(15). 这种二聚化可能有助于p85α对PI 3-激酶的调节，但不能解释AS53或p50α的作用，两者都缺乏这些区域。无论机制如何，数据表明，PI 3-激酶表现为一种典型的变构酶，其中的调节亚基对催化活性进行负调控。调节亚单位与酪氨酸磷酸化蛋白的相互作用降低了这种抑制作用，从而刺激了PI 3-激酶的活性。
关于胰岛素刺激介导的最终生物效应，我们的数据与Katagiri等人的数据一致(21)who发现p110α的表达增加了葡萄糖转运。然而，并非所有研究都观察到这一点(9). 观察到p110α具有不同的稳定性和活性水平，这取决于它是否具有N末端或C末端标记，可以解释这种差异(41). 我们的p110α结构具有N末端Myc标记，这可能有助于本研究中观察到的p110的稳定性和活性。然而，任何调节亚单位亚型的共表达都显著降低了p110对葡萄糖转运的影响。与单独表达p110α的细胞相比，p50α与p110α共表达对磷酸酪氨酸和p110相关的PI 3-激酶活性几乎没有影响，这与事实不符。这些数据表明，调控亚单位可以通过直接影响PI 3-激酶活性以及间接机制来调节一些下游信号传导，而不依赖于PI 3-激酶的活性水平。
间接调节机制的一种可能是改变催化亚单位的亚细胞分布和PI 3-激酶活性的细胞内位点。事实上，最近的研究表明，胰岛素刺激后与PI 3-激酶的信号复合物的特定亚细胞区隔可能有助于胰岛素的独特代谢作用(6,17). 关于这些分子在细胞内贩运的机制知之甚少。然而，由于每种IRS蛋白在胰岛素刺激下似乎都具有独特的转运特征(6)，每个调节亚单位对这些对接蛋白的亲和力可能反映了PI 3-激酶的亚细胞定位，从而调节PI 3-激酶依赖的生物活性。我们实验室使用常规细胞分离的初步实验未能检测到单独表达p110α或共表达每个调节亚单位的细胞之间p110或PI 3-激酶活性分布模式的显著差异（数据未显示）；然而，需要对此进行更详细的研究。此外，对于不同的PI 3-激酶信号事件，可能存在具有不同效率的几个隔间，即使是在用传统分馏方法分离的相同部分中也是如此。事实上，p110单体的表达导致GS活性显著降低，可能是通过GSK3活性的增加。p110或组成活性突变体p110的表达也被证明抑制3T3-L1脂肪细胞中的GS活性(8,9). 这些结果表明，p110单体通常不稳定，存在于特定的隔室中，该隔室适合支持葡萄糖转运，但不利于GS的激活。如果是这样，与各种调节亚单位的相互作用可能会将p110募集到能够释放正常胰岛素信号的适当信号室。
总之，我们的数据表明，各种调节亚单位通过至少三种不同的机制调节PI 3-激酶依赖信号：调节亚单位单体占领IRS蛋白，抑制催化活性，以及可能改变亚细胞隔室。因此，它们以不同的效率将IRS蛋白的信号传递给PI3-激酶。这些发现表明，每个调节亚单位表达水平的变化可导致不同胰岛素反应组织中胰岛素信号的重大改变，并可能导致胰岛素抵抗状态，如糖尿病。
致谢
这项工作得到了NIH拨款DK 33201和DK55545的支持。
我们感谢M.Kasuga的腺病毒编码Δp85，L.C.Cantley的p110构建体，I.Saito的粘粒盒和对照腺病毒，以及T.L.Bellman-Azar和J.Konigsberg的出色秘书协助。
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