在真核细胞中，染色体占据单独的、不重叠的区域，DNA和RNA代谢的反应仅限于细胞核内部的离散结构（综述见参考文献40). 尽管为阐明核结构的分子基础做出了许多努力，但核内高阶结构的明确概念尚未出现。一种备受争议的可能性是，细胞核的结构和功能由一种称为核支架或核基质的蛋白质类骨架实体及其与基因组中DNA结构元素的相互作用决定(18). 染色质附着在核支架上似乎是通过在所有被调查的真核生物中发现的富含AT-的特殊DNA元素发生的，并被提议将基因组分成不同的、拓扑独立的可变大小的环(30). 术语SAR（支架连接区域）或MAR（基质连接区域）(8,17)，这些DNA元素以进化上保守的方式与核支架结合(9)可能是因为这些支架中存在一个或多个保守的结合蛋白。SARs的同源结合蛋白对SARs的识别尚不清楚，但显然不依赖于精确的识别序列，因为无法识别所有SARs共有的一致序列。相反，SAR可以通过结构特征和/或聚集在SAR中的短序列基序识别，但不能通过非SAR DNA识别。事实上，大多数具有特征的SAR都含有A或T（A束）的均聚物，导致DNA的特征性小凹槽狭窄（参考文献综述4). 这些A区对严重急性呼吸系统综合征与核支架相互作用的重要性已通过远端霉素实验证明。这种小沟槽结合肽抗生素选择性结合（dA·dT）n个序列，从而抑制或分离SARs与核支架的相互作用(24). 除了存在A-tracts和其他富含AT-的序列基序，如解舒元件(三)或最近描述的矩阵连接区域识别签名（MRS）(50)SAR需要有一定的长度才能展示特定的交互。天然SAR的长度通常在600到3000 bp之间，这表明SAR和核支架中同源结合蛋白之间需要协同作用。
除了推测其在核结构中的作用外，SAR还与基因表达的调控有关，因为它们经常在增强子附近被观察到(8,17)，当整合到基因组中时，刺激异源报告基因的基因表达(48)，可以调节染色质的可及性(22). SAR在某些情况下界定了基因表达的单个单位(17,41)但也可能位于大基因的内含子中，在那里它们似乎稳定地与核支架结合，但动态性足以不影响转录(23,45). 在核苷酸组成或对报告基因表达的影响方面，内含子SAR与基因包被SAR没有区别。因此，这两种类型的SAR可能在体内执行相同的功能，染色质环锚定在核支架上，从而可能影响相邻基因的表达。
在过去几年中，一些SAR结合蛋白被鉴定和表征。这些蛋白质包括普遍存在的、丰富的蛋白质，如拓扑异构酶II(1)，组蛋白H1(20)，层粘连蛋白B1(34)、HMG I/Y(52)和核仁蛋白(12)也包括主要在某些细胞类型中表达的蛋白质，如SATB1(11)或p114(51). 我们分离并表征了人核蛋白SAF-A（支架附着因子A），也被称为hnRNP-U，因为它与hnRNP颗粒相关(14,15,25,44)和SAF-B(43). 有趣的是，尽管这些蛋白质中的许多已经被彻底表征，但还不可能从分子角度理解结合特异性的机制，而且也很难确定哪些蛋白质是体内核结构所必需的。因此，我们将兴趣集中在人类细胞中的一种主要SAR结合蛋白SAF-A上，以研究SAR的识别和结合模式的分子细节。
在本报告中，我们证明SAF-A通过一个新的、进化上保守的蛋白质结构域与SAR DNA结合。该结构域，我们称之为SAF-Box，存在于从酵母到人类起源的蛋白质中，通过多种弱相互作用识别SAR DNA，共同导致高特异性结合。分离结构域的结合特性与未分离核支架的结合特性非常相似，它在所有真核生物中的存在可能是SAR-支架相互作用进化保持的原因之一。
材料和方法
细胞培养、转染和增殖测定。
将COS7和MCF-7细胞培养在37°C的Dulbecco改良Eagle培养基中，该培养基含有10%胎牛血清和0.6μg/ml胰岛素（仅MCF-7），在潮湿的环境中培养，每3天通过五倍稀释传代到新鲜培养基中。根据制造商的协议，使用自动细胞计数器（Coulter）测定绝对细胞数。为了进行体内蛋白质定位分析，使用制造商推荐的SuperFect试剂（Qiagen），用编码野生型SAF-A或缺失突变体ΔN45的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白的表达载体转染盖玻片上培养的细胞。转染后30 h用荧光显微镜观察细胞。
对于增殖试验，通过电穿孔（在800μl含有5×105细胞；4-mm试管，400 V，960μF）。脉冲后立即将细胞置于10 ml预热培养基中，并将2.5 ml悬浮液涂在六孔培养皿上。对于MCF-7细胞，这种方法产生的转染细胞超过60%，细胞死亡少于5%。对于我们研究中使用的不同类型和数量的DNA，转染效率和细胞死亡无法区分。在转染后30小时，通过抽吸去除培养基，并用含有0.5μCi[三H] 胸腺嘧啶核苷/ml。12 H后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次，在0.5 ml磷酸盐缓冲液-0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中溶解，并用水稀释至5 ml。将裂解液剧烈旋转，并通过在冰上添加最终浓度为20%的三氯乙酸（TCA）沉淀DNA 30分钟。通过Millipore GF/C玻璃纤维过滤器过滤并用10%TCA和甲醇大量洗涤后，通过闪烁计数对沉淀的DNA进行量化。
重组蛋白片段的克隆、表达和纯化。
参考文献中描述了人SAF-A部分蛋白ZZ-N45、ZZ-N247和ZZ-N24ΔN45表达克隆的构建19从蛋白质C43E11.1（来自秀丽隐杆线虫)，百万分之一+（来自葡萄裂殖酵母)和T19P19.70（来自拟南芥)通过将PCR-扩增片段克隆到pEZZ18载体（Pharmacia）中，利用引物结合的限制性位点构建。所有PCR均采用Pfu公司聚合酶（Stratagene），一种带有生态RI位点，以及一个带有终止密码子和Hin公司dIII站点。对于秀丽线虫蛋白质，模板为Cosmid C43E11（由秀丽线虫测序联盟，剑桥，英国），引物为CATGAATTCCGCGGACGAGGATATTTA和ACTGAAGCTTTCATATTTGGCAAGTACCTTT。对于庞贝乳杆菌蛋白质，模板是一个克隆的cDNA片段（cDNA118，由法国波尔多Jean-Paul Javerzat善意提供），引物是CATGAATCCATGCATAGAGAGTCTT和ACTGAGTTCAAGTCATTTCATCGTTACTCC。对于拟南芥蛋白质，模板为BAC T19P19（由俄亥俄州哥伦布市拟南芥生物资源中心善意提供），引物为CATGAATTCTCGTCATCGCCTTTTCCA和ACTGAAGCACCAGCAGATGTTCATC。所有表达结构均通过SAF-A、C43E11.1、mlo1的45、49、45和50氨基酸（aa）的测序和编码蛋白进行验证+和T19P19.70，加上14 kDa的氨基末端ZZ-tag。
如前所述，通过免疫球蛋白G（IgG）-Sepharose和Mono Q（均来自Pharmacia）的色谱法纯化带有ZZ标记的重组蛋白(19). 仅使用纯度>90%的蛋白质组分进行结合分析。
肽合成和纯化。
SAF-Box肽在ABIMED EPS 221半自动肽合成器上合成，使用Novasyn TGR树脂（Novabiochem）、9-氟苯甲氧羰基化学和PyBOP活化、双偶联策略以及未反应N的封盖α乙酸酐基团(36). 合成后，将肽从树脂中在90%（vol/vol）三氟乙酸（TFA）、5%（vol/vol）水和5%（vol/mol）三乙基硅烷中在室温下裂解3.25 h，用5体积的冷沉淀沉淀吨-丁基甲醚在−20°C下保持15 h，并在缓冲液A（100 mM Tris-HCl[pH7.5]，100 mM NaCl，1 mM EDTA）中再溶解。为了纯化，肽通过与N端半胱氨酸在缓冲液A中形成二硫键的方式与硫丙基-Sepharose 6B（Pharmacia）偶联1.5小时。由于该半胱氨酸最后偶联，它仅存在于全长肽中，并允许通过用50体积的缓冲液A洗涤柱来去除较短的合成副产物。用10mM二硫苏糖醇洗脱肽，在缓冲液B（200mM乙酸盐缓冲液[CH三COOH-CH公司三COONa][pH4.0]），并应用于快速蛋白质液相色谱Mono-S柱（Pharmacia；体积，1 ml）。在缓冲液B中以0到1000 mM NaCl的线性梯度洗脱肽。将含有肽的部分（约550 mM NaCl）混合，应用于高效液相色谱（HPLC）C18柱（YMC-pack ODS-AQ；YMC），用线性梯度从水–0.1%（vol/vol）TFA到乙腈–0.07%TFA洗脱。如前所述，通过矩阵辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析粗合成产物以及所有纯化步骤的馏分(5). 只有含有纯度>90%的肽的组分才用于DNA结合分析。
DNA结合分析。
对于下拉DNA结合分析，重组蛋白或合成肽分别与IgG-Sepharose或Thiopropyl-Sepharose100 mM Tris-HCl（pH 7.5）–100 mM NaCl–1 mM EDTA在室温下偶联1 h，并在同一缓冲液中洗涤三次。珠子要么立即用于结合分析，要么在4°C的耦合缓冲液中储存数天，而结合活性没有明显变化。用10μl沉淀珠和30ng放射性末端标记的DNA在200μl结合缓冲液（10mM Tris-HCl[pH 8.0]、80mM NaCl、2mM EDTA）中进行标准DNA结合测定，并在室温下在摇摆平台上孵育1小时。剪切大肠杆菌DNA（平均片段大小，在500到1000 bp之间）被用作未标记的非特定竞争对手。用结合缓冲液洗涤六次，去除未结合的DNA，并通过闪烁计数定量DNA结合。对于凝胶分析，用3%SDS在50μl结合缓冲液中从排出的珠中洗脱结合DNA，然后立即添加380μl Tris-EDTA（TE）（10 mM Tris[pH8.0]，1 mM EDTA），通过酚氯仿萃取纯化，并用乙醇沉淀。DNA在TE中重新溶解，在1%标准琼脂糖或3%瑞福琼脂糖（Eurobio）凝胶上分离，凝胶干燥后通过放射自显影进行可视化。用于结合分析的DNA有生态RI公司-巴姆HI-digested pMII（克隆到pUC18中的人类SAR MII[45])和Xba公司我-Hin公司dIII-digested pGN1.5（矮牵牛SAR GN1.5克隆到pGEM3[13]. 对于图中所示的实验。，两个未磷酸化的互补45米寡核苷酸，AATTCAGAAAAATAATAAAAAAAACTAGCTATTTATTTTTTC和GTCTTTTATTTATCGATAAAAAAAGTTAA（含生态通过在10μl TE中煮沸5分钟并在约30分钟内冷却至70°C进行退火。混合物（2μg退火寡核苷酸）在37°C的连接酶缓冲液中用10U的T4多核苷酸激酶磷酸化5′端30分钟之前，让其冷却至室温，并在室温下用1U的T4-连接酶连接15小时。通过与Klenow聚合酶的填充反应对连接的寡核苷酸进行放射性标记[32P] dATP与等量的MII-pUC18（作为内部特异性控制）混合，并增加大肠杆菌竞争对手DNA，并在标准分析中测试与SAF-Box的结合。对于对照实验，底物是使用不相关的寡核苷酸以相同的方式制备的。
SAR结合肽倾向于与长DNA片段结合。（A） 含有MRS序列的合成寡核苷酸(50)通过连接聚合，放射性末端标记，并在与固定化合成肽的下拉DNA结合分析中用作底物。添加标记的MII-pUC18混合物作为内部特异性对照。在含有越来越多竞争DNA的分析中，从珠子中回收结合的DNA，将其分成两等份，并通过3%Resophor琼脂糖（上面板）进行凝胶电泳分析，以显示多聚体或1%琼脂糖以解决内部控制（下面板）。在闪烁计数的基础上对样品进行归一化，并对每个通道施加相同的放射性。对照：MII-pUC18混合物单独、多聚体单独和输入混合物。（B） 扫描图A上部所示的凝胶以通过密度计定量结合的DNA。使用第3通道（输入）和第9通道（在竞争对手DNA超过500倍的情况下绑定）（如左图a所示）分别计算每个多聚体的绑定输入比；比率超过1是因为在每条车道上使用了相同的放射性物质，这表明较高的多聚体的比例过高。请注意，明显倾向于大于200 bp的片段。
其他方法。
重组蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照Laemmli的描述进行(29)根据Schägger和von Jagow的方法进行肽电泳(46). 蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色(47). 使用Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度，并通过与SDS-聚丙烯酰胺凝胶上已知蛋白质含量的样品进行比较验证。
结果
SAF-Box的标识。
SAF-A是核支架中一种丰富的成分，与SAR DNA结合具有很强的特异性(14,15,44). 在最近的一份报告中，我们发现SAF-a的DNA结合活性在细胞凋亡过程中蛋白水解裂解时被破坏，并且可以将SAF-a DNA结合域映射到氨基末端247残基(19,26). 在Southwestern blotting程序中，短于247 aa的重组部分蛋白没有与DNA结合，这247 aa蛋白中的两个区域似乎是DNA结合所必需的。这两个区域，aa 1至45和aa 158至247，被一段酸性残基分隔开。这种酸性延伸与DNA结合无关，因为它可以从重组蛋白中删除，从而导致两个必要区域的直接融合，而不会影响西南印迹中的DNA结合特性（未显示）。在这些实验中，我们认为西南印迹法固有的蛋白质变性可能是详细定义蛋白质-DNA相互作用的严重限制。为了消除这个实验问题，我们采用了一种使用天然纯化部分蛋白质的下拉分析。重组氨基末端蛋白，用ZZ-tag分泌融合蛋白表达(19,33)用IgG-Sepharose固定，并测试与标记DNA的结合。当用这种更灵敏的方法进行研究时，SAF-A的DNA结合域被映射到SAF-A氨基末端的45个残基（图。)，包含我们之前出版物中描述的间隔亮氨酸基序(19). 令人惊讶的是，这些原始实验中确定的第二个“必要”区域被发现对DNA结合本身来说是不必要的。该区域似乎与变性后DNA结合域的重折叠有关，因为它在西南免疫印迹中是必要的，但在使用天然蛋白质的下拉分析中不是必要的。另一方面，带有aa 1到45的蛋白质片段保留了与当时已知的最短DNA结合片段N247无法区分的DNA结合特征，并且从N247中去除它完全取消了DNA结合（图。B） ●●●●。因此，SAF-A的氨基末端45残基对于与SAR DNA的特异性结合是必要和充分的。
SAR结合域映射到人类SAF-A的极端氨基末端。（A）完整SAF-A和用于DNA结合分析的蛋白质片段的示意图。RNA结合RGG-Box(25)以及富含亮氨酸（L）、酸性残基（D、E）、谷氨酰胺（Q）和甘氨酸（G）的区域。（B） 使用人SAF-A重组构建物进行下拉DNA结合分析。蛋白质ZZ-N247和ZZ-N45过表达、纯化，用IgG-Sepharose固定，并与人SAR元素MII（填充方形）、非SAR pUC18（填充圆形）或两种DNA的等摩尔混合物（填充三角形）孵育在数量不断增加的情况下大肠杆菌竞争对手DNA。结合DNA通过闪烁计数定量，并以输入百分比表示。请注意，固定化蛋白（1μg）的量被选择为饱和到竞争对手DNA的100倍。左面板显示了缺少氨基末端45残基的ZZ-N247（ZZ-N24ΔN45）的对照实验（开圈）。（C） 使用SAR（MII）和非SAR DNA（pUC18）的等摩尔混合物以及增加数量的非特定竞争对手DNA进行下拉DNA结合分析。从珠子中洗脱结合DNA，在琼脂糖凝胶上分析相同放射性的等分样品。注意在严格条件下SAR DNA的高度特异性。
在互补实验中，我们合成了一种含有人SAF-a的氨基末端45个残基和额外的氨基末端半胱氨酸的肽。该单一氨基酸标签用于硫丙基-Sepharose的色谱纯化，并固定在用于下拉DNA结合分析的相同材料上。纯化的肽在反相HPLC中洗脱为对称峰（图。A） 并具有通过MALDI-TOF质谱测定的预期分子质量（图。B） ●●●●。在DNA结合分析中，肽的SAR特异性结合与重组ZZ-N45融合蛋白的结合没有区别（图。C、 与图相比。C） ●●●●。这表明合成肽自发折叠成活性构象，根据这个定义，它代表一个独立的蛋白质结构域。
合成SAR结合肽。（A） 从人SAF-A中合成并通过色谱法纯化了具有SAF-Box的46个残基的肽。最后一个纯化步骤，C上的反相HPLC18柱，显示肽在水-乙腈梯度中以对称峰洗脱。（B） MALDI-TOF质谱显示肽的完整性。计算的分子量为5245。（C） 将纯化的肽（100 ng）固定在Sepharose珠上，并在存在越来越多的竞争DNA的情况下测试DNA与MII-pUC18混合物的结合。
为了研究新型DNA结合域的体内相关性，我们构建了人类SAF-A的表达载体，其中含有或不含有前45个氨基酸，氨基末端与EGFP融合，以便在活细胞中直接可视化。瞬时转染实验表明，野生型和ΔN45缺失突变体的表达水平略低于内源性SAF-A或与之相当（图。A） 并定位于间期细胞的细胞核（图。B） ●●●●。然而，在有丝分裂细胞中，这两种蛋白质的定位明显不同。虽然野生型SAF-A在三分之二的细胞中定位于有丝分裂染色体，但缺失突变完全与染色体无关（图。B和C）。相反，在三分之二以上的细胞中，浓缩染色体区域对缺失突变呈阴性。对于这两种蛋白质，大约三分之一的细胞显示出与EGFP控制细胞相似的均质细胞染色，这表明SAF-A结构既没有特别集中在这些细胞的浓缩染色体区域，也没有被排除在该区域之外。我们目前尚不清楚同一蛋白质在不同细胞中表现出不同行为的原因，但在比较单个细胞的信号强度和蛋白质定位时，发现其与表达水平无关。然而，氨基末端结构域缺失的明显作用强烈表明染色体定位是由于SAF-A的DNA结合。
在瞬时转染实验中，SAF-Box将SAF-A靶向有丝分裂染色体。（A） 用编码野生型SAF-A融合蛋白或带有EGFP的SAF-Box缺失突变体的表达载体转染COS7细胞。细胞转染后24小时通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和SAF-A特异性抗体的总细胞提取物免疫印迹分析。对照细胞未转染。（B） 如上所述转染培养在盖玻片上的COS7细胞并进行显微镜分析。两种蛋白结构的间期细胞和有丝分裂细胞的典型图像均显示出来。（C） 对转染野生型SAF-A–EGFP、ΔN45突变型EGFP或单独转染EGFP的有丝分裂细胞在染色体上的绿色荧光定位（是或否）或均匀细胞染色（homo）进行评分。在所有病例中，对100多个有丝分裂细胞进行了评分（n=）。
假设SAR是组织高阶染色质结构域的重要调节元件。根据这种作用，人们可以预测SAR结合蛋白在DNA复制、基因转录或更多全球过程（如增殖或分化）中具有关键功能。事实上，SAF-A缺失突变体ΔN45与EGFP融合的细胞瞬时转染导致这些细胞的增殖显著降低。较低的绝对细胞数证明了这一点（图。A） 放射性胸腺嘧啶核苷复制性并入基因组DNA的浓度显著降低（图。B） ●●●●。在用编码野生型SAF-A–EGFP融合蛋白的构建物转染的细胞和仅接受空pEGFP-N1载体的对照细胞中均未观察到类似效果。显然，缺失DNA结合域的突变蛋白对SAF-a的自然功能产生了显性的负面影响，并证实了新结构域在体内的重要性。
缺乏SAF-Box的突变型SAF-a的表达对增殖有显著的负面影响。（A） 用12μg野生型SAF-A–EGFP或ΔN45突变型EGFP表达载体转染MCF-7细胞，并在转染后48 h使用Coulter细胞计数器测定绝对细胞数。（B） 用12μg空pEGFP-N1载体（对照）或3、6或12μg面板A中描述的表达载体转染MCF-7细胞。30 h后，通过将培养基与含有0.5μCi的新鲜培养基交换来标记细胞[三H] 胸腺嘧啶核苷/ml。12h后，收集细胞，并通过TCA沉淀、GF/C玻璃纤维过滤器过滤和闪烁计数测定纳入基因组DNA的放射性胸腺嘧啶核糖核酸的数量。所有试验一式三份；误差条表示标准偏差。结果以每分钟计数（cpm）的绝对值表示，相对值根据矢量控制进行标准化。在所有检测中，转染效率和细胞死亡分别约为60%和4%。
数据库比较显示，在真核生物而非原核生物的许多蛋白质中存在一个与31个氨基酸同源的蛋白质基序。有趣的是，在本实验室鉴定的SAF蛋白SAF-A和SAF-B中都发现了该基序，并且是这两种蛋白的唯一同源序列。因此，我们将该区域指定为SAF-Box（图。A） ●●●●。SAF-Box与同源结构域的螺旋1和螺旋2具有显著同源性，例如来自Hox-C12（3F）的同源结构域，SAF-Box的所有残基与Bürglin推导的同源结构体一致序列兼容(6). 因此，SAF-Box在结构上似乎与同源结构域的相应区域有关，该同源结构域折叠成由两个α螺旋线组成的钩状结构（图。B） ●●●●。有趣的是，螺旋3对所有同源结构域都是通用的，并赋予特定的DNA结合，它既不存在于SAF-Box中，也不需要与SAR-DNA结合。该实验室正在进行实验，以阐明SAF-Box的实际结构以及它如何与DNA相互作用。
SAF-Box是一个保守的蛋白质结构域。（A） 来自人类（hs）、小鼠（mm）、，非洲爪蟾（xl）、斑马鱼（dr）、，拟南芥（在），秀丽线虫（ce），家蚕（bm），庞贝乳杆菌（sp），黑腹果蝇（dm），和酿酒酵母（sc）。来自拟南芥氨基接线盒或羧基接线盒的PARP分别表示为PARP-N和PARP-C。Hox-C12（3F）的同源结构域如下所示。星号表示用于进一步研究的蛋白质。（B） 根据二级结构预测和计算机辅助建模得出的SAF-Box假定结构与扶植塔拉祖已知结构的比较(42)并雕刻(7,27)顺势疗法。同源盒（浅灰色）的螺旋线3不在SAF-Box中。核磁共振，核磁共振。
为了研究SAF-Box基序的保存是否伴随着特定SAR结合活性的保存，我们克隆、表达并纯化了源于人类的四种不同蛋白质的重组SAF-Boxs，秀丽线虫,拟南芥、和庞贝乳杆菌（图。A） ●●●●。如上所述，将纯化的蛋白质固定在IgG-Sepharose上，并使用两种不同的等摩尔SAR–非SAR DNA混合物测试其与DNA的结合。事实上，所有测试的蛋白质都显示出与人类和矮牵牛SARs的特异性结合，但与非SAR载体对照组没有特异性结合（图。B） ●●●●。因此，特定SAR结合是SAF-Box的一个保守特征。
SAR结合是SAF-Box的保守活性。（A） 含有源自人类的四种不同蛋白质的SAF-Box的蛋白质，秀丽线虫,庞贝乳杆菌、和拟南芥，每个都有一个氨基末端ZZ标签，被细菌过表达、纯化，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。（B） DNA结合分析。将等量的四种蛋白质固定在IgG-Sepharose上，并在不存在（−）或存在（+）500倍过量竞争DNA的情况下与两种不同的SAR–非SAR混合物孵育。请注意，所有蛋白质在存在竞争DNA的情况下特异性结合SARs MII（人类）和GN1.5（矮牵牛），但不结合质粒对照（pUC18，pGEM3），尽管特异性略有不同。
SAF-Box通过质量结合与SAR DNA结合。
早期对人类细胞天然纯化SAF-A特性的研究表明，该蛋白的DNA结合与自组装成长丝状或球状复合物密切相关(14,15). 在没有自组装的情况下，在任何实验条件下都不能观察到DNA结合，反之亦然，这表明蛋白质-蛋白质相互作用在SAF-a与DNA的结合中起着核心作用。因此，不可能独立于蛋白质自组装来表征DNA结合活性。SAF-Box的鉴定使我们现在能够更详细地研究该结构域与DNA的结合模式，从而深入了解SAR与核支架的结合机制。作为第一步，我们使用越来越多的与IgG-Sepharose偶联的重组ZZ-N247和ZZ-N45进行下拉DNA结合分析。当以摩尔数表示时，DNA结合发生在两种蛋白质的S形结合曲线上，表明合作结合模式（图。A） ●●●●。当用SAR和非SAR DNA的混合物进行类似实验时，结合DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，在低蛋白浓度下，SAR DNA明显优于非SAR DNA（图。B） ●●●●。与非SAR DNA以及SAR DNA结合的SAF-Box的饱和量，反映了之前描述的全长SAF-a的一般DNA结合活性(14). 重组SAF-Box从庞贝乳杆菌百万分之一+蛋白质（图。B、 下部面板）和合成SAF-Box肽（未显示）。从这些实验中，我们确定了大约300个SAF-Box的化学计量比，这些SAF-Boxs是与人类MII SAR（3000 bp）的一个分子结合所必需的，或者大约是每10 bp DNA中一个SAF-Box。这当然是高估了，因为由于珠子表面的空间位阻，并非所有的偶联蛋白分子都可以用于DNA结合，但清楚地表明，许多SAF-Box必须协同作用才能与单个DNA分子结合。我们的发现进一步支持了这一结论，即当在溶液中进行测试时，分离的SAF-Box的DNA结合几乎无法检测到，例如在过滤结合或凝胶迁移率变化分析中（数据未显示），这表明单个SAF-Box与DNA的相互作用不稳定或亲和力低。因此，在下拉分析中SARs的强而特异的结合似乎是由于蛋白质固定导致单个蛋白质分子接近。因此，SAF-Box的SAR结合可能是由于Zuckerkandl和Villet的质量结合机制(53)其特征是大量单个蛋白质分子与周期性重复出现在一条DNA链上的序列基序结合。虽然每种相互作用的亲和力和特异性都相对较低，但许多相互作用通过协同效应共同转化为高亲和力、高特异性结合。对于完整、全长的SAF-A，这些协同效应似乎是由蛋白质多重聚合引起的（见上文），而分离的SAF-Box需要固定在表面上，以模拟天然蛋白质复合物中各个结构域的接近性。
SAF-Box的DNA结合模式。（A） 将越来越多的来自人SAF-A的ZZ-N247和ZZ-N45固定在Sepharose珠上，并测试其与分离的人MII SAR元件的结合。注意，当以摩尔数表示时，这两种蛋白质具有相同的结合曲线（下表）。（B） 使用SAR（MII）和非SAR（pUC18）DNA的等摩尔混合物以及来自人类SAF-A的SAF-Box蛋白ZZ-N247和ZZ-N45以及来自庞贝乳杆菌百万分之一+从珠子中洗脱结合DNA并用琼脂糖凝胶电泳进行分析。（C） 在两种不同的条件下，将人SAF-Box蛋白ZZ-N45固定在Sepharose珠上，这两种条件产生的蛋白质绝对量相同，但表面密度不同（上图）。用分离的MII SAR进行的DNA结合分析表明，结合DNA与蛋白质的化学计量比取决于偶联蛋白质的密度，而不是蛋白质的绝对量。填充圆，恒定密度；打开圆圈，降低密度（下面板）。注意x个轴。
DNA-蛋白质相互作用的质量结合模式具有可测试的结果，即它应该取决于单个蛋白质分子之间的距离，因为这些分子必须足够近才能与同一DNA片段接触。因此，我们比较了在两种不同条件下，DNA与包被SAF-Box蛋白的珠子的结合情况（图。C） ●●●●。首先，将SAF-Box蛋白ZZ-N45固定在高密度下，并用空珠逐步稀释，以减少蛋白质的绝对量，但表面密度相同。第二，蛋白质与不断增加的珠子相结合，导致数量与第一次检测的数量相同，但表面密度不同。我们发现，在具有相同表面密度的第一次分析中，每个蛋白质分子结合的DNA分子比率不受影响，但在第二次分析中受到强烈影响。因此，SAF-Box的DNA结合通过质量结合发生。
我们使用合成的SAR结合肽进一步表征DNA结合模式，并将其与SAR与未分离核支架之间相互作用的已知特征进行比较。在第一个实验中，我们研究了SAF-Box肽的DNA结合是否受到DNA片段长度的影响，从而可能重现SAR与Caffold相互作用的已知长度效应（见上文）。为此，我们使用了通过连接含有最近描述的MRS的寡核苷酸而产生的可变长度的人工SAR(50). 这个序列是经过仔细研究的果蝇属组蛋白簇SAR最初由Laemmli及其同事鉴定(38)并与核支架制剂结合(50). 标记45-bp MRS寡核苷酸的多聚体结构，与pUC18-MII底物混合作为内部特异性控制，并测试其与固定化SAF-Box肽的结合。结合DNA在高分辨率琼脂糖凝胶上洗脱和分析，揭示了当反应中添加更多的竞争DNA时，结合多聚体的数量发生了变化（图。A） ●●●●。因此，SAF-Box的DNA结合在严格的条件下明显是长度依赖性的（其中内部对照证实了特异性结合），在DNA片段长度大于300bp时，S形曲线饱和（图。B） ●●●●。使用无MRS序列的寡核苷酸进行的对照实验表明，在严格条件下，单体或多聚体均未表现出显著的结合（未显示）。
在第二组实验中，我们确定了SAR-DNA与分离的SAF-Box的相互作用是否受到DNA配体的影响，DNA配体是指在体内外特定位置与DNA结合的小分子。根据SAR与Caffold相互作用的实验报告，我们使用了两种小沟槽结合肽抗生素distamycin和chromomycin，这两种抗生素分别具有与A-tracts和G+C-rich序列基序的特异结合特征（参考文献24以及其中的参考）。对于图中所示的实验。A、 我们使用pUC18-MII的等摩尔混合物和500倍过量的非特异性大肠杆菌竞争对手DNA。在这些条件下，在没有任何一种药物的情况下都可以观察到特定的SAR结合（图。A） ●●●●。当以已知的药物/DNA比率添加distamycin和chromomycin时，会导致药物与DNA的高度特异性结合(24)distamycin以浓度依赖的方式有效地阻断了SAR结合，而chromomycin没有作用。因此，SAF-Box通过与DNA小沟中的A区相互作用与SAR结合，就像纯化的全长SAF-A（参考文献14和未发表的观察结果）或未切割的核支架(24). 有趣的是，远端霉素阻断了SAR DNA与SAF盒的结合，但即使在非常高的药物/DNA比率下也不能破坏先前存在的相互作用（图。B） ●●●●。
合成肽的SAR结合对去霉素敏感。（A） 使用MII-pUC18混合物和超过500倍的非特异性竞争对手DNA进行拉下DNA结合分析，同时添加更多的远端霉素或铬霉素。结合DNA通过闪烁计数定量（上面板），并通过琼脂糖凝胶电泳分析（下面板，上面板中的样品3至8）。（B） SARs与肽的先前结合在司他霉素的存在下是稳定的。如图A所示，在没有药物的情况下进行了下拉DNA结合分析。1小时后添加Distamycin（斑点条）或chromomycin（阴影条），并与DNA-肽复合物孵育30分钟，然后清洗并通过闪烁计数定量。
讨论
在本研究中，我们报告了人类SAF-A最小SAR-DNA结合域的鉴定，并表明该域是一个新的进化保守域，也存在于异源蛋白中。该SAF-Box在结构上似乎与缺乏DNA识别螺旋的同源结构域有关，并以特征性的质量结合模式与DNA小凹槽中的a区结合。
SAF箱的保护。
这项研究的结果表明，人类SAF-A的最小SAR结合域映射到蛋白质的氨基末端。数据库比较和生化实验表明，SAR-DNA结合是由一个高度保守的新蛋白质结构域赋予的，我们称之为SAF-Box（图。). 我们发现，SAF-Box存在于酵母、植物和哺乳动物等生物的蛋白质中，它们之间的进化距离很遥远。另一方面，对原核基因组的数据库搜索并没有发现真细菌或古细菌中存在等效序列。因此，SAF-Box似乎对所有真核生物都很常见，但在原核生物中不存在，它与SAR DNA的特异性结合（也仅在真核生物中鉴定）及其在细胞核结构中的推断作用相兼容。有趣的是，来自进化上遥远的真核生物的含有SAF-Box的蛋白质并不是同源蛋白质，也就是说，不同物种的蛋白质可以追溯到一个共同的祖先。相反，SAF-盒外的序列同源性通常无法检测到，这表明该盒是几个不同蛋白质共享的独立域。大多数这些蛋白质的功能尚不清楚，因为它们是通过基因组测序项目而不是通过生物化学或生物活性确定的。例外情况是与核结构和/或RNA代谢有关的人类蛋白SAF-A、SAF-B和E1B-AP5(14,16,19,43,44)，的庞贝乳杆菌百万分之一+已知在过度表达时会导致染色体丢失和致死的蛋白质(21)和来自拟南芥(31)参与DNA修复机制。通常蛋白质只包含一个SAF-Box，但拟南芥PARP具有两个串联排列的SAF盒，其在蛋白质中的位置与第二亚型中的两个锌指DNA结合结构域的位置相等拟南芥PARP（M.Kazmaier等人，未公布数据）（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AJ131705”，“term_id”：“4038490”，“term_text”：“aJ131706”}}AJ131705型)和来自动物的PARP(49). 因此，SAF-Box可以取代不同的、结构无关的DNA结合域，并可能将PARP的这种亚型靶向SAR DNA。一般来说，真核细胞似乎有不止一种SAF-Box蛋白。在人类中，已知五种这种蛋白质（SAF-A和SAF-B的两种亚型以及E1B-AP5）；在里面拟南芥,秀丽线虫、和酿酒酵母，有两个。在未来的基因组测序项目中，很可能会发现更多的含SAF-Box的蛋白质，通过收集特征良好的蛋白质（如SAF-A）的知识，有助于阐明其功能。
SAF-Box的结构和DNA结合活性。
序列同源性、二级结构预测和计算机辅助建模强烈表明SAF-Box在结构上与同源结构域的螺旋1和螺旋2相关。有趣的是，SAF-Box没有螺旋3，即所有同源结构域共有的DNA识别螺旋，并且在其DNA结合特征方面与同源结构域显著不同。虽然同源结构域与DNA主槽中严格定义的核苷酸序列结合，但SAF盒的DNA结合并不局限于简单、易于检测的序列基序。相反，结合通过合作结合模式发生，该模式通过与多个聚集的a束的小沟相互作用识别SAR DNA。与同源结构域相反，SAF-Box与DNA的结合在溶液中无法检测到，但需要将蛋白质分子固定在某些表面，例如Sepharose珠的表面。这表明DNA结合受一种质量结合机制控制，该机制要求个体DNA结合域紧密靠近，这些结合域以高度特异性与相邻DNA链上重复出现的序列基序结合。这与之前获得的纯化全长SAF-A的数据进行了很好的比较，该数据表明，发生DNA结合绝对需要蛋白质自组装(14,15). 这里展示的结果表明，固定化通过在表面上以拓扑约束形式排列SAF-Box来模拟这种自组装。此外，这种不寻常的结合模式与体内SAF-A和其他SAF-Box蛋白的假定功能完全兼容，即SAR DNA与不溶性核支架的结合。因此，SAR DNA的识别是“模糊的”，因为如果许多不同的DNA序列在一定长度的DNA片段上聚集了大量的结合位点（可能是a区、MRS或解旋元件），那么它们符合SAR的标准。
我们能够在合成SAR结合肽、合成寡核苷酸和Sepharose珠的简单三组分系统中重现未拆分核支架的所有特征DNA结合特性。在这种全合成方法中，SAF-Box与最近发现的与许多但不是全部SAR相关的二部分MRS序列特异性相互作用(50)表明MRS可能是SAR DNA与体内核支架之间相互作用的点之一。Laemmli及其同事的优雅实验支持了这一结论，他们绘制了（匿名）SAR结合蛋白在H1–H3基因间SAR上的位置果蝇属使用ExoIII(37). 在这个SAR（也是我们实验中使用的MRS元素的来源）中，他们发现ExoIII有四个强大的停止点，精确映射到这个SAR中两个二分MRS的16-bp和8-bp分量的位置。
在我们的实验中，SAF-Box显示出对长度超过200 bp的DNA片段的明显偏好，并产生了一条与之前报道的普通支架长度相关的曲线重叠(2,三). 此外，SAF-Box肽的SAR结合在药物/DNA比率下被远端霉素有效竞争，导致与小凹槽中的A束高度特异性结合并阻断SAR与支架的相互作用(24,45). SAR结合即使在超过数千倍的情况下也能抵抗与原核DNA的竞争，但在真核生物中高度保守，因为人类的SAF-Boxs，秀丽线虫,庞贝乳杆菌、和拟南芥所有这些都与SARs相关，其来源与人类和矮牵牛一样遥远。
分离的SAF-Box和未分离的核支架的SAR结合在定性和定量上的相似性强烈表明，核支架的大部分DNA结合是由于SAF-Box-包含的蛋白质，如SAF-A。不幸的是，解决这个问题的直接方法，例如。，由于SAF-Box的特殊质量结合模式，证明SAF-Box-肽是否能阻止SARs与核支架制剂的结合的实验是不可行的。然而，SAF-A是传统支架制备中10种最丰富的蛋白质之一，也是唯一具有SAR结合活性的蛋白质(35). 其他带有或不带有SAF-Box的SAR结合蛋白（SATB1、拓扑异构酶II、SAF-B、组蛋白H1、层粘连蛋白、HMG I/Y或ARBP）有助于SAR与支架的相互作用达到各种程度，可能与细胞类型相关。可以想象，其中一些蛋白质在与支架相关的功能中发挥更特殊的作用，例如转录、剪接、DNA复制或修复，而不是染色质的高度保守的结构附着。这些作用已经被证明，例如，对于SATB1和SAF-B，它们分别参与转录或剪接的调节(28,32,39). 有趣的是，SATB1是一种主要在胸腺细胞中表达的细胞类型特异性SAR结合蛋白，早先有报道称它还包含一个参与SAR结合的非典型同源结构域(10). 然而，与SAF-A的SAF-Box相反，SATB1的同源结构域与DNA结合不良且特异性低，不足以进行SAR结合。相反，同源结构域帮助一个独立的SAR结合结构域识别SAR基区内的核心解舒元件，从而提高SAR结合域的亲和力。在未来的实验中，当使用本报告中描述的下拉方法进行测试时，如果SATB1的同源结构域本身具有SAR偏好，那么将进行调查。
