细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)及其细胞周期蛋白亚基最初是基于其作为真核细胞周期调节因子的作用而鉴定的(13). 在酵母中酿酒酵母,细胞周期的进展是由单个CDK,Cdc28,以及9个Clb和Cln细胞周期蛋白共同驱动的(45,52,58)在人类中,几个CDK调节细胞周期(46). 然而,随后的研究发现,细胞周期蛋白和CDK也在其他细胞过程中发挥重要作用,包括转录调节和磷酸代谢(三). 在酿酒酵母例如,三种CDK-cyclin复合物可能在转录调控中发挥一般作用:Kin28-Ccl1 CDK-cybrin复合物是一般转录因子TFIIH的重要组成部分(14,66)、Srb10和Srb11是RNA聚合酶II全酶的亚单位(35,38),Ctk1-Ctk2-Ctk3复合物磷酸化RNA聚合酶II的最大亚单位(37,61). 另一种CDK复合物,由Pho80和Pho85组成,对无机磷酸盐水平作出反应,并在细胞周期进程中发挥额外作用(30,43,44). 在高等真核生物中,Cdk7-cyclin H(56),Cdk8-细胞周期蛋白C(36)和Cdk9-cyclin T(48)复合物在转录调控中也发挥着重要作用。Cdk7-cyclin H与酵母Kin28-Ccl1同源,Cdk8-cyclin C与Srb10-Srb11同源,但尚未鉴定出Cdk9-cyclin T的功能性酵母同源物。目前尚不清楚CDK在大型真核生物中广泛用于细胞周期以外的其他过程,但了解所有CDK在简单模型生物中的作用应该有助于了解它们在其他真核生物的潜在作用。
当前CDK研究的一个重要目标是识别所有CDK及其细胞周期蛋白伴侣,并识别体内每个CDK-细胞周期蛋白对调控的过程。这一目标得益于完整真核生物基因组序列的可用性(6,18). 这个酿酒酵母例如,基因组预计编码22个细胞周期蛋白和5个CDK(三),同时分析秀丽隐杆线虫基因组预测至少有11个周期蛋白和12个CDK。然而,这些生物体中CDK和细胞周期蛋白的确切数量仍不确定,因为这些预测主要基于序列相似性。细胞周期蛋白家族的多样性阻碍了仅通过序列比较识别真正的细胞周期蛋白的能力。这个酿酒酵母G公司1例如,cyclin Cln2与G只有22%的序列同源性2/M cyclin Clb4和其他cyclin家族成员之间的成对比较往往表现出更大程度的多样性。此外,与蛋白激酶相比,细胞周期蛋白之间相对较少的氨基酸位置是高度保守的,在22个已证实的蛋白激酶中没有任何残基是绝对保守的酿酒酵母细胞周期蛋白。细胞周期蛋白最保守的区域是一个大约90个氨基酸结构域,称为细胞周期蛋白盒(34). 额外的序列分析表明,细胞周期蛋白盒在细胞周期蛋白中重复,其中N末端的细胞周期蛋白框更为保守(17).
虽然细胞周期蛋白在一级氨基酸水平上没有密切联系,但其结构高度保守。例如,尽管只有15%的氨基酸同源性,但人类细胞周期蛋白A和H的结晶分析显示出显著的结构重叠(2,28,33). 令人惊讶的是,其他蛋白质,如TFIIB和Rb,包含与细胞周期蛋白盒相似的序列,并且在结构上与细胞周期素相关,但没有已知的激酶调节亚单位功能(4,17,32,47). 细胞周期蛋白折叠结构域在蛋白中的存在增加了区分真正的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白相关蛋白的困难,这些蛋白没有已知的激酶刺激亚单位的作用。虽然细胞周期中不同的表达模式最初是细胞周期蛋白的特征(13),一些细胞周期蛋白,特别是那些参与转录调控的细胞周期蛋白没有显示细胞周期依赖性的表达模式(60). 基于这些考虑,序列相似性、结构信息或表达模式都不足以将蛋白质归类为真正的细胞周期蛋白。目前,细胞周期蛋白的定义特征有两个:与激酶催化亚基的物理和功能关联,以及与已建立的细胞周期蛋白家族成员的序列相似性(46).
我们一直在研究在体内转录过程中起一般作用的蛋白质。通过从上游激活序列(UAS)缺失的启动子中选择增加转录的突变,我们在几个先前特征的标准贯入试验基因和其他六个基因,指定BUR1(燃烧室1)通过BUR6型(BUR(燃烧室)表示旁路UAS要求)(51). 在迄今为止检查的每一个病例中,导致Bur的突变−表型已经确定了转录机制的关键成分或调节因子。这些蛋白质包括组蛋白(21),伸长率(22,40,63,67),全酶成分(7,29),TATA-结合蛋白(TBP)(5)和TBP抑制剂(9,50). 因此,导致Bur的突变−表型已被用于鉴定在体内转录中具有普遍作用的蛋白质。Bur选择鉴定出的一个基因,BUR1(燃烧室1),编码与CDK相关的假定蛋白激酶。BUR1(燃烧室1)与相同SGV1型在筛选影响酵母从α-因子介导的生长停滞中恢复的突变时发现(26). 的具体作用BUR1(燃烧室1)在细胞周期和α因子的恢复方面尚不清楚。然而,我们的发现BUR1(燃烧室1)与相同SGV1型表明原始sgv1型突变通过转录效应间接影响细胞周期和α因子恢复。为了更好地理解BUR1(燃烧室1),我们一直在研究一个功能相关的基因,BUR2(燃烧室2)在这里,我们报告了BUR2(燃烧室2)几条证据表明BUR2(燃烧室2)编码一个不同的细胞周期蛋白,Bur2与Bur1蛋白激酶协同作用。因此,我们的结果(i)确定Bur1和Bur2是一对不同的CDK细胞周期蛋白对,(ii)表明Bur1-Bur2复合物在转录中具有重要的一般作用。
材料和方法
酵母菌株和遗传方法。
酿酒酵母本研究中使用的菌株为GY832(MATαhis4-912δlys2-128δsuc2Δuas(−1900/−390)trp1Δ63 bur2Δ3::trp1 ura3-52 leu2Δ1),GY458(材料一his4-912δlys2-128δsuc2Δuas(−1900/−390)ura3-52 trp1Δ63)、GY103(材料一his4-912δlys2-128δsuc2Δuas(−1900/−390)ura3-52 trp1Δ63 bur2-1),GY139(材料一/材料αhis4-912δ/his4-912Δlys2-128δ/lys2-128δsuc2Δuas(−1900/−390)/suc2Δuas(−1900/–390)ura3-52/ura3-52 trp1Δ63/trp1△63 leu2Δ1/leu2)和PJ69-4A(27). 所用的所有培养基,包括富培养基(YPD)、合成完全脱落培养基(例如SC-Ura)、微量培养基(SD)和产孢培养基,均按其他地方所述进行制作(54). 咖啡因敏感性(Caff秒)在含有15 mM咖啡因的培养基上进行检测,并使用含有2%甲酰胺的培养基来检测甲酰胺敏感性(FA秒). 在整个研究过程中,采用了交配、产孢、转化和四分体分析的标准遗传方法(54). A类毛刺2通过整合PCR产物,精确替换BUR2(燃烧室2)开放式阅读框(ORF)TRP1号机组-包含二倍体菌株GY139的片段。这个bur2Δ3::TRP1本研究中使用的单倍体零品系GY832是通过四分体分离获得的bur2Δ3::TRP1杂合二倍体。
质粒。
pGP60是原件BUR2(燃烧室2)-含有从YCp50-based中分离的质粒欧洲标准化委员会库。7.8-kb的子克隆BUR2(燃烧室2)+插入产生了以下质粒。pGP92包含3.9-kb绍3A级-速度我打嗝2+pRS316中的子克隆,pGP95包含2.3-kbAat公司二-Xba公司我在Sma公司pRS316的I位点,pGP96包含2.3-kb千磅我-绍3A级BUR2(燃烧室2)+中的碎片千磅/平方英寸我-巴姆pRS316和pGP97的HI位点包含1.6-kb千磅我-巴姆中的HI片段巴姆HI(高)-千磅pRS316、pGP98的I位点包含2.2-kb英国标准时间EII公司-Bgl公司II碎片进入Sma公司pRS316的I站点,pGP106包含1.8-kbAat公司二-绍3A级BUR2(燃烧室2)+中的碎片巴姆HI(高)-Aat公司YCp50的II位点。pGP155包含相同的1.8-kbBUR2(燃烧室2)片段为pGP106,但内部1-kbHin公司dIII片段替换为URA3公司.pGP112包含3-kbBUR1(燃烧室1)pRS426中的片段。pGP211与pGP112相同,只是它编码D213A位点定向突变(伯尔1-3)其被预测为使Bur1激酶活性失活。pSM21包含N端标记的FLAGBUR1(燃烧室1)在pRS316衍生向量中。pSM14与pSM21相同,只是它包含伯尔1-3D213A氨基酸取代。pSY14包含2.3-kb打嗝2+pRS424中的片段。pSY6与pSY14相同,只是它在Bur2 N末端含有一个六组氨酸标签。
双杂交分析。
创建两个质粒直接检测Bur1-Bur2相互作用;pGP492包含镀锌4AD(Gal4激活域)-BUR2(燃烧室2)在pACT2矢量中创建的融合,而pSY1包含镀锌4BD(Gal4结合域)-BUR1(燃烧室1)pAS2-1中创建的融合。将pSY1和pGP492转化为报告菌株PJ69-4A(27)以及对照质粒pACT2和pAS2-1。将双转化子复制电镀到SC-His培养基上。
提取物制剂。
通过将10 ml酵母培养到2×10的浓度来制备提取物7每毫升细胞数。通过2000 rpm离心5分钟收集细胞,并将其重新悬浮在500μl破胶缓冲液中(50 mM Tris[pH7.5],10%甘油,10 mM MgCl21 mM EDTA、100 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇、亮氨酸肽[0.5μg/ml]、胃蛋白酶抑制素[0.7μg/ml]、抑肽酶[1μg/ml]1 mM苯甲基磺酰氟)。用玻璃珠漩涡破坏细胞,通过16000×离心澄清提取物克15分钟。
免疫沉淀和激酶分析。
400微克提取物与抗FLAG M2亲和凝胶珠(Sigma)在4°C下孵育4小时。用500μl破胶缓冲液造粒并洗涤五次珠子。对于共免疫沉淀,添加十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液,并将样品加载到SDS-7.5%聚丙烯酰胺凝胶上。将蛋白质转移到Immobilion P上,并用抗FLAG抗体M2或针对细菌表达的Bur2产生的抗体进行探测。与辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育后,使用ECL(增强化学发光)试剂盒(Amersham)检测抗原。对于激酶分析,在30μl激酶缓冲液(25 mM Tris[pH7.8],10 mM MgCl)中平衡免疫沉淀和洗涤珠2,0.1%吐温20,1μCi的[γ-32P] ATP)在30°C下保持30分钟。蛋白质在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离并干燥32通过放射自显影术检测P标记产物。
亲和力纯化分析。
从质粒pSM21表达Bur1和Bur2衍生物的GY458菌株中制备提取物(BUR1标记),pSY14(打嗝2)和pSY6(HIS6-BUR2型). 如上所述制备提取物,并在4°C下与20μl Ni-硝基三乙酸(NTA)琼脂糖珠(Qiagen)孵育2 h。用洗涤缓冲液(50 mM NaH)洗涤珠子两次2人事军官4,300 mM NaCl,20 mM咪唑[pH8.0]),蛋白质在10%凝胶上通过SDS-PAGE分离。
结果
之间的遗传相互作用BUR1(燃烧室1)和BUR2(燃烧室2)。
原始Bur的初步遗传特征−突变体表明,根据其突变体表型和与其他转录调控因子的遗传相互作用,它们至少包括两类(51). 一组,包括BUR1(燃烧室1),BUR2(燃烧室2),BUR4型、和BUR5型,被认为通过染色质介导的效应影响转录,因为BUR5型编码组蛋白H3。第二组,包括BUR3(燃烧室3)和BUR6型,通过TBP影响转录,因为BUR3(燃烧室3)和BUR6型分别编码Mot1和NC2的α亚单位,每个亚单位都直接抑制TBP。进一步描述打嗝2为了确定这个原始表型分组是否经得起进一步的比较,我们首先搜索由以下因素引起的其他表型毛刺2突变。几个打嗝2发现表型;含有任一原始菌株的菌株毛刺2等位基因或a毛刺2空等位基因(见下文)是产孢缺陷的,不能在含有2%甲酰胺或15 mM咖啡因的培养基上生长。与其他人相比毛刺突变体,这些毛刺2表型与毛刺1突变(表). 因此,我们确定的所有七种表型毛刺2突变也是由毛刺1等位基因,而只有这些表型的有限子集与其他表型共享毛刺突变。这种表型相似性强烈表明BUR2(燃烧室2)功能与BUR1(燃烧室1)而不是另一个BUR(燃烧室)基因。
表1
基因型 | 表型一
|
---|
速度 | T型 | Gal公司 | Ino公司 | Ssn公司 | 斯波 | 咖啡馆 | FA公司 |
---|
BUR(燃烧室)+ | + | + | + | + | + | + | + | + |
伯尔1-1 | − | − | + | − | − | − | − | − |
bur2-1 | − | + | + | − | − | − | − | − |
打嗝3-1 | −/+ | − | 负极/+ | + | + | 第二次 | +/− | + |
打嗝4-1 | − | + | + | + | − | 第二次 | + | + |
伯尔5-1 | − | + | + | + | − | 第二次 | + | + |
伯尔6-1 | −/+ | + | −/+ | + | + | 第二次 | + | + |
如果BUR1(燃烧室1)和BUR2(燃烧室2)功能高度相关,那么其中一个基因的过度表达可能会抑制另一个的突变。什么时候?BUR2(燃烧室2)在高拷贝数质粒上从其自身启动子过度表达,没有抑制伯尔1-1或毛刺1-2观察表型。的过度表达BUR1(燃烧室1)然而,Caff抑制了生长缺陷秒和FA秒表型和Ino−由毛刺2删除(图。). 为了确定高拷贝数抑制表型是否需要Bur1激酶活性,构建了一个等位基因,将D213A取代引入预测的Bur1活性位点。类似天冬氨酸和丙氨酸的变化已被用于检测对其他蛋白激酶活性的要求(16). 这个等位基因,指定伯尔1-3,功能不活跃,因为它无法补充任何毛刺1表型。的过度表达伯尔1-3也无法抑制毛刺2Δ表型(图。). 综合以上结果,这些结果表明打嗝1可以绕过BUR2(燃烧室2)Bur1激酶活性需要被抑制毛刺2Δ.
的过度表达BUR1(燃烧室1)禁止删除BUR2(燃烧室2). The毛刺2Δ菌株GY832用含有车道上方所示基因的高拷贝数质粒进行转化。将转化物复制电镀到选择性板(SC-Ura)、含有15 mM咖啡因(Caff)或2%甲酰胺(FA)的SC-Ura板或同样缺乏肌醇(Ino)的SC-Ura板。咖啡馆秒、FA秒和Ino−的表型毛刺2Δ由高拷贝数补充BUR2(燃烧室2),高拷贝数BUR1(燃烧室1)、和BUR1标记.
的克隆BUR2(燃烧室2)。
BUR2(燃烧室2)通过转换bur2-1型具有酵母基因组文库的菌株(53)并选择与Ino互补的质粒−表型。四行证据表明ORF YLR226w编码打嗝2首先,a欧洲标准化委员会仅含有该ORF的质粒足以补充所有毛刺2YLR226w的表型和破坏URA3公司消除了质粒互补活性(图。A) 。其次,整合和联动分析(数据未显示)表明YLR226w与BUR2(燃烧室2)轨迹。第三,已经在两者的YLR226w ORF中鉴定出突变毛刺2等位基因(见下文)。第四,基因组YLR226w位点的破坏导致了极端疾病(图。B) 和Bur−,速度−,Ino−、FA秒和咖啡馆秒与原始表型相同毛刺2等位基因。这些结果表明YLR226w编码BUR2(燃烧室2),那个BUR2(燃烧室2)对生存能力不是必需的,但对正常生长很重要,功能丧失会导致Bur−表型。
(A) 的克隆BUR2(燃烧室2).含有源于原始细胞的亚克隆的质粒毛刺2-对补体质粒进行补体检测毛刺2表型。亲本质粒(pGP92)显示在顶部;ORF用箭头表示,染色体XII上的核苷酸位置显示在片段末端的正下方。在最右边的一列中,+表示所有打嗝2表型和−表示不能补体毛刺2.(B)打嗝2无表型。从一个二倍体菌株中分离出10个四分体,该菌株是杂合的毛刺2缺失等位基因bur2Δ2::TRP1每个四分体的四个孢子(a到d)产生两个健康菌落和两个缓慢生长的菌落。每个缓慢生长的菌落都是Trp+,表明生长缺陷是由毛刺2Δ.
BUR2(燃烧室2)编码一个发散的细胞周期蛋白。
这个BUR2(燃烧室2)ORF编码一个395-氨基酸蛋白。根据整个GenBank数据库对Bur2预测的蛋白质序列进行BLAST搜索,结果显示没有显著的序列相似性。然而,对未完成的基因组序列的搜索白色念珠菌美国国家生物技术信息中心提供的数据显示,与一种未经特征化的ORF有显著同源性SPX63系列(名称位于白色念珠菌主页[http://alces.med.umn.edu/Candida.html]). 重要的是,SPX63系列也显示出与哺乳动物细胞周期蛋白T和葡萄裂殖酵母细胞周期蛋白C相关基因PCH1型.之间的同源区域SPX63系列而cyclin对应于cyclin框(25)和之间同源性最高的区域SPX63系列和BUR2(燃烧室2)(图。A) ,表明BUR2(燃烧室2)用不同的细胞周期蛋白盒编码蛋白质。为了支持这一想法,使用了GONNET评分矩阵(19)在鉴定同源二级结构方面特别准确(1,15),而不是标准的BLOSUM矩阵(23)鉴定出Bur2的相同区域具有显著同源性(E值<E−8)到cyclin T。
细胞周期蛋白同源区BUR2(燃烧室2)横跨整个自行车箱。系统发育分析表明,Bur2与白色念珠菌Spx63p和这两个蛋白是细胞周期蛋白T/细胞周期蛋白C家族的不同成员,不同于有丝分裂细胞周期蛋白(细胞周期蛋白A和B)或G1细胞周期蛋白(Cln1)(图。B) ●●●●。在哺乳动物细胞周期蛋白中,Bur2与Cdk9的伴侣细胞周期蛋白T关系最为密切,Cdk 9是转录延伸因子PTEF-b的一个亚单位(48). 两份原件毛刺2突变导致细胞周期蛋白盒以外的C末端截断:bur2-1型包含两个更改,Pro233更改为Ser,Lys311更改为Stop,而bur2-2型包含Lys274的移码突变。Bur2和细胞周期蛋白之间的序列相似性,以及打嗝1和毛刺2突变,表明Bur2可能在体内作为Bur1蛋白激酶的细胞周期蛋白发挥作用。
Bur1和Bur2之间的物理相互作用。
如果Bur2作为Bur1的细胞周期蛋白发挥作用,那么这两种蛋白质应该在物理上相互作用。为了确定Bur1和Bur2是否在体内发生物理相互作用,我们首先在酵母中进行了双杂交分析。A类镀锌4BD-BUR1融合激活的表达GALUAS-HIS3号机组与一个BUR2-镀锌4AD融合,而每个单独的杂交蛋白都无法激活GALUAS-HIS3号机组(图。). 该试验中的阳性信号是特异性的,因为两种融合都不能与空载体转化子或对照杂交毒饵结合激活。
双杂交分析。报告菌株PJ69-4A被转化为表达镀锌4AD或镀锌4BD融合到BUR1(燃烧室1)或BUR2(燃烧室2)如顶部所示。A−表示存在镀锌4AD或镀锌4BD矢量控制。将转化子进行复制电镀以获得完整的培养基和缺乏组氨酸的培养基(−His)。通过此分析,他的培养皿上的生长表明存在积极的相互作用。左侧的Gal4BD-p53和Gal4AD-T抗原(TAg)融合作为相互作用杂交蛋白的阳性对照。
为了进一步确定Bur1和Bur2是否形成一个稳定的复合物,如预期的cyclin-CDK对,我们测试了Bur1与Bur2在全细胞提取物中是否共沉淀。由于Bur1和Bur2的表达水平较低,因此使用从其启动子在高拷贝数质粒上表达Bur2和FLAG表位标记Bur1的菌株制备的提取物进行联合免疫沉淀。这些蛋白单独或组合的过度表达没有产生可检测的突变表型和互补测试(图。数据未显示)表明FLAG表位不会干扰Bur1功能。当使用抗FLAG单克隆抗体免疫沉淀FLAG-Bur1时,观察到Bur2的共免疫沉淀(图。A、 车道4)。Bur2共免疫沉淀是特异性的,因为它仅在我们使用含有标记Bur1的提取物时观察到(图。A、 车道3与车道4)。Bur1-Bur2相互作用也使用不同的亲和试剂进行检测。FLAG-Bur1与未标记的Bur2或在其N末端用六个组氨酸残基标记的Bur 2联合表达。镍亲和纯化His-Bur22+-NTA琼脂糖珠导致FLAG-Bur1的共纯化。这不是因为FLAG-Bur1与珠子的非特异性结合,因为它需要提取物中的His-tagged Bur2(图。B、 车道3与车道4)。基于双杂交和共沉淀分析中的阳性信号,我们得出结论,Bur1和Bur2在体内具有物理相关性。
Bur1和Bur2物理相互作用。(A) 协同免疫沉淀。提取物是从表达打嗝2与任何一种组合BUR1(燃烧室1)(车道1和3)或标记有FLAGBUR1(燃烧室1)(车道2和4)。FLAG M2抗体结合琼脂糖珠用于免疫沉淀。使用抗FLAG(顶部)和抗Bur2(底部)抗体对粗(1和2道)和免疫沉淀(IP)(3和4道)材料进行Western blot分析。将15微克蛋白质等分样品装入粗提物通道中,并将250μg蛋白质的免疫沉淀物质装入通道3和4中。(B) 亲和力纯化。提取物是从表达BUR1标记与他的6-已标记BUR2(燃烧室2)(车道1和3)或BUR2(燃烧室2)(车道2和4)。使用Ni-NTA琼脂糖珠纯化蛋白质。使用抗Bur2(顶部)和抗FLAG(底部)抗体对粗(通道1和2)和亲和纯化(通道3和4)材料进行Western blot分析。在粗提物通道中装载30毫克等分蛋白质,在通道3和4中装载从350μg蛋白质纯化的材料亲和力。
Bur1激酶活性需要Bur2。
上述遗传和物理相互作用强烈表明,Bur2作为Bur1蛋白激酶的周期蛋白发挥作用。因此,建立了一种免疫沉淀激酶试验,以确定Bur1激酶活性是否需要Bur2。这个BUR(燃烧室)+将表达Bur2的2μm质粒与FLAG标记或未标记Bur1结合转化酵母菌株GY458。制备提取物,并用与抗FLAG单克隆抗体M2偶联的琼脂糖珠免疫沉淀FLAG-Bur1。免疫沉淀蛋白与[γ-32P] ATP,少量32观察到P标记蛋白,包括两个依赖FLAG-标记Bur1的蛋白(图。A、 车道1与车道2)。这两种Bur1候选底物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以约80和>200 kDa的速度迁移。~80-kDa带接近FLAG-Bur1的预测大小,表明Bur1可能是自磷酸化的。目前正在进行测试该模型的实验。这两种蛋白质的磷酸化依赖于Bur1激酶的活性,因为在含有未标记Bur1的提取物中未观察到它们(图。A、 或FLAG-Bur1-3,一个在Bur1活性位点含有D213A错义替换的失活等位基因(图。A、 车道3)。为了确定这些底物的磷酸化是否也依赖于Bur2,将表达标记Bur1的质粒转化为毛刺2Δ应变GY832。FLAG-Bur1在毛刺2Δ应变(图。B、 通道4),但这些提取物中的免疫沉淀物对磷酸化80-kDa和>200kDa底物不起作用(图。A、 车道2与车道4)。然而,通过在2μm上表达自身启动子的Bur2,激酶活性可以恢复(图。A、 车道4与车道5)或欧洲标准化委员会(数据未显示)质粒,证明缺乏磷酸化是由于缺乏Bur2。我们得出结论,Bur2是Bur1蛋白激酶活性所必需的。
BUR2(燃烧室2)是Bur1激酶活性所必需的。提取物由以下两种成分制备BUR2(燃烧室2)+(GY458)或毛刺2用2μm质粒pSM21转化Δ(GY832)菌株(BUR1标记),pSM14(bur1-3标志),和pSY14(BUR2(燃烧室2))在面板A顶部所示的组合中,蛋白质用FLAG偶联琼脂糖珠免疫沉淀,并广泛洗涤,以及[γ-32P] 加入ATP以检测激酶活性。(A) 激酶分析。显示了SDS-聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影图,左侧显示了以千道尔顿表示的尺寸标记。右边的箭头指示了FLAG-BUR1提取物所特有的两种主要磷酸化蛋白>200和80kDa。(B) 蛋白质印迹。用抗FLAG单克隆抗体检测A组中的免疫沉淀蛋白。箭头表示FLAG-Bur1(车道2、4和5)和FLAG-Bur1-3(车道3)波段。
讨论
Bur选择对于鉴定在转录中具有相对普遍作用的蛋白质、鉴定对体内基础启动子的转录具有染色质介导和染色质非依赖效应的基因非常有效(51). 本文给出的结果为我们理解其中两个方面提供了两个重要进展BUR(燃烧室)基因:我们发现BUR2(燃烧室2)编码细胞周期蛋白,我们已经证明BUR2(燃烧室2)生物化学和遗传功能与Bur1蛋白激酶一致。综合遗传和生化结果表明,Bur1和Bur2形成了一个分化的CDK-cyclin复合物,在体内转录中具有重要的一般作用。
我们提供了三条证据BUR2(燃烧室2)编码一个真正的细胞周期蛋白。首先BUR2(燃烧室2)蛋白质序列与具有生物化学特征的细胞周期蛋白序列相关。系统发育比较表明,Bur2与细胞周期蛋白的细胞周期蛋白C和细胞周期蛋白T家族关系最为密切。该家族所有先前特征成员都具有转录调节器的一般作用;细胞周期蛋白C是RNA聚合酶II全酶的组成部分(36)而细胞周期蛋白T是转录延伸因子PTEF-b的一个组分(48). 相比之下,Bur2与G相差甚远1和有丝分裂细胞周期蛋白一样,细胞周期蛋白C和T家族的其他成员BUR2(燃烧室2)mRNA在整个细胞周期中保持相对恒定(60). 其次,双杂交和共免疫沉淀分析表明,Bur2与Bur1紧密相关,Bur1是一种与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶家族相似的蛋白质。第三,免疫沉淀激酶分析表明Bur2是Bur1激酶活性所必需的。因此,这些结果满足将Bur2分类为周期蛋白的所有要求,并证明Bur1是CDK。
尽管这些综合证据表明Bur1活动需要Bur2,但我们尚不知道这是否足够。Bur1可能需要第三种蛋白质,类似于分别对Mat1和Ctk3的Cdk7和Ctk 1 CDK的需求(10,61,64). Bur1也可能需要CDK激活激酶的调节性磷酸化(49,59)如Cak1(12,31,65)进行全面活动。Bur1可能依赖Cak的一个迹象是,在240位存在苏氨酸残基,类似于人类Cdk2 T环中苏氨酸160处Cak磷酸化的位点(20,55). 我们目前正在从酵母中纯化Bur1,以鉴定活性Bur1复合物的所有成分,并检查其是否受Cak或CDK抑制剂的调节(57). 一个相关的问题是,Bur1或Bur2在体内是否具有任何其他相互独立的功能,特别是它们是否与其他细胞周期蛋白或CDK相互作用。我们怀疑Bur2对激活Bur1具有特异性,因为迄今为止毛刺2突变也由毛刺1突变。如果Bur2具有任何Bur1非依赖性功能,我们预计它们的突变表型会重叠但不完全相同。相比之下,毛刺1突变产生至少两种表型,而这两种表型不是毛刺2突变;对特定温度敏感bur1/sgv1突变导致Cdc−表型,在非允许温度下阻止大的未添加细胞,以及毛刺1删除是致命的(26). 自BUR2(燃烧室2)并不会导致细胞周期缺陷,这些结果表明BUR1(燃烧室1)可能与其他细胞周期蛋白相互作用或具有独立于Bur2的其他作用,类似于对多个细胞周期蛋白作出反应的其他CDK(45). 或者,在没有Bur2的情况下,Bur1可能具有一些残余或基础酶活性,导致更严重的毛刺1Δ表型相对于毛刺2Δ.
Bur1-Bur2复合物在转录过程中的作用是什么?正式地,BUR1(燃烧室1)和BUR2(燃烧室2)充当SUC2公司基础转录,因为功能丧失突变增加了suc2Δuas基本启动子。其他启动子的转录减少毛刺1和打嗝2然而,突变菌株表明BUR1(燃烧室1)和打嗝2可能在体内也有积极作用(数据未显示)。许多其他在转录中起一般作用的因子也检测到类似的体内双重作用,包括Mot1(8,39,50),Bur6(50),组蛋白(11,21,42,69)和SNF/SWI组件(24). 生化分析将有必要确定这两种作用是否直接。
Bur1-Bur2功能的潜在线索来自其在其他生物体中最接近的已知同源物。与Bur1关系最密切的哺乳动物激酶是Cdk9,它是人类免疫缺陷病毒1型基因组转录所必需的,并在转录延长过程中发挥作用(68). 同样,与Bur2关系最密切的哺乳动物细胞周期蛋白是细胞周期蛋白T,它是与Cdk9相关的细胞周期蛋白(48). 因此,我们推测Bur1-Bur2复合物可能在功能上等同于哺乳动物Cdk9-cyclin T,在酵母的转录延伸过程中发挥作用。为了支持这一建议,几种酵母延伸因子的突变会导致Bur−和Spt−表型类似于由毛刺1和毛刺2突变(22,40,41,51,62,63,67). 为了研究Bur1-Bur2和Cdk9-cyclin T之间的关系,并确定Bur1-Bur2复合物是否影响起始或延伸,有必要纯化活性复合物。继续研究BUR1(燃烧室1)和BUR2(燃烧室2)肯定会对其在转录周期中的特定功能以及与其他在转录中起一般作用的CDK-cyclin复合物的潜在重叠产生有趣的见解。