细胞周期阻滞是对可能导致DNA损伤的应激刺激的一种常见反应。据信，细胞周期阻滞在最小化DNA损伤对细胞的后果方面起着重要作用(22). 一般认为G2阻滞为细胞在进入有丝分裂前修复DNA损伤提供了时间(48). DNA损伤及其对细胞周期进程的影响在酵母和爪蟾卵母细胞提取物以及哺乳动物细胞。这些研究表明，Cdc2-cyclin B复合物的激酶活性是G2-至M相（G2/M） 正常细胞周期的转变和Cdc2的酪氨酸磷酸化抑制其激酶活性(47). DNA损伤后，发现Cdc2激酶活性受到抑制，Cdc2磷酸化增强(6,27,36). Cdc2的磷酸化状态由激酶Wee1和Myt1以及磷酸酶Cdc25维持(10,39,41,43). 尽管双方都存在检查点调节，但人们认为Cdc25活性的调节是维持G的重要因素2DNA损伤后被捕(53). 在哺乳动物细胞中，已经鉴定出两种激酶，Chk1和Cds1（也称为Chk2）(5,38,54)并显示磷酸化Cdc25C并阻止其去磷酸化和激活Cdc2(5,9,16,38,52,54). 据认为，Cdc25上的磷酸化促进了与14-3-3蛋白的结合，导致其从细胞核输出(37); 然而，辐照后Chk1和Cds1活化的机制尚不清楚。研究表明，Cds1对DNA损伤的反应依赖于ATM的活性，ATM的基因在共济失调毛细血管扩张症（AT）患者中发生突变(5,8,9,38). 因此，ATM是信号通路的上游。与G的概念一致2逮捕对DNA损伤有保护作用，ATM缺陷患者对辐射的敏感性增强(32). 超越G的药物2/M阻滞常使细胞对γ辐射敏感(30,49); γ辐射诱导的DNA损伤和细胞死亡被认为是放射治疗消除癌细胞的机制。
p38丝裂原活化蛋白（MAP）激酶途径是一种主要的信号通路，可被紫外线照射等应激事件激活。p38组MAP激酶属于MAP激酶超家族的一个亚家族。该组的原型成员p38α（也称为p38、CSBP或RK）经细菌脂多糖处理后在巨噬细胞中被酪氨酸磷酸化(20,21). 该蛋白也被鉴定为一系列抗炎化合物的特定靶点，其中SB203580是其原型成员(34). p38α和p38β对SB203580的抑制敏感，而p38γ和p38δ的活性不受该化合物的影响(17). 虽然不同p38亚型对应激反应的激活谱相似，但越来越多的证据表明，单个p38亚型具有不同的生物学功能。例如，p38α和p38β在心肌细胞肥大中相互拮抗，p38γ与肌肉分化和缺氧反应有关(33,35,40). 一些蛋白质被鉴定为p38α的底物，包括TCF中的转录因子，如CHOP10、MEF2C和Sap1，酶，如cPLA2，以及下游蛋白激酶，如MAPKAPK2/3、MNK1/2和PRAK（有关综述，请参阅参考文献46和50). p38激酶家族的所有四个成员都能在体外磷酸化转录因子激活因子2（ATF2）(17). 与其他MAP激酶一样，p38组MAP激酶的激活需要上游激酶的特异性磷酸化。两种MAP激酶激酶，MKK3和MKK6，已被鉴定为p38家族的直接上游激活物(13).
MAP激酶参与细胞周期阻滞已经在许多生物体中进行了研究。可能由于MAP激酶之间底物特异性和调节的差异，它们在细胞周期调节中的作用似乎不同。激活p42MAPK公司G需要2/成熟过程中的M过渡爪蟾卵母细胞(51)，并且这种MAP激酶的失活释放G2在…时被捕爪蟾卵母细胞受精(2). 据报道，MEK2活性对G是必要的2哺乳动物细胞中的阻滞(1)，而G需要MEK1活动2/M过渡(60). 据报道，BMK1（ERK5）是表皮生长因子诱导的S期进展所必需的(29). 据报道，p38α参与Cdc42诱导的G1制动以及主轴装配检查点(42,56).
为了探讨p38及其亚型在γ辐射反应中的作用，我们检测了γ辐射细胞中p38通路成分的激活。这些信号分子的功能是通过引入这些分子的组成活性和/或显性负等位基因来确定的。我们在这里报道，MKK6和所有p38亚型都被γ射线激活，MKK 6的活性形式足以阻止G2抑制MKK6或特定的p38亚型p38γ，破坏DNA损伤检查点。此外，我们发现γ射线照射细胞中p38γ的激活依赖于ATM，MKK6-p38γ级联参与调节Cds1活性。p38通路的激活最终导致Cdc2磷酸化和随后的G2逮捕。这些数据支持p38通路和G之间的重要相互作用2细胞周期检查点控制。
材料和方法
细胞培养。
正常（GM637G；ATM+/+)和ATM不足（GM5849C；ATM−/−)猴病毒40转化的人成纤维细胞取自新泽西州卡姆登市科里尔医学研究所。其他细胞系取自美国型培养物收集。细胞生长在补充有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 U青霉素/ml、50 mg链霉素/ml和1%非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle's培养基中。
γ辐照。
六孔板中的细胞受到来自137γ细胞40中的铯源以65 rads/min的速率(18).
腺病毒感染。
如别处所述，产生了重组腺病毒(25). 将细胞以2×10接种到六孔板中5感染重组腺病毒前24小时每孔细胞数（10三包裹体形成单元（IFU）/单元）。在感染后指定的时间后，收集细胞并进行进一步分析。
细胞周期分析。
收集、清洗细胞，将其重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在逐步添加冰镇无水乙醇后固定18 h以上。细胞在37°C的RNase A（1 mg/ml）中再次悬浮30 min，然后用碘化丙啶（PI；0.05 mg/ml）在冰上染色1 h。使用FACS IV流式细胞仪（加州圣何塞Becton Dickinson）进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。细胞在488nm处激发，在590nm以上收集发射。
有丝分裂指数测定。
γ射线照射或腺病毒感染后，立即用加利福尼亚州Calbiochem的诺康唑（100 ng/ml）处理细胞14 h。然后将细胞固定在70%乙醇中，并在4°C下保存24 h，然后用Hoechst DNA染色（分子探针）染色。在荧光显微镜下对有丝分裂指数进行评分。
脉冲相位标记。
在六孔板中90%的HeLa和U2OS细胞融合培养物用Trans标记-[35S] 标签([35S] Met-Cys公司；Amersham）暴露于辐射前1小时。然后在含有过量未标记Met-Cys但不含标记Met-Cy的培养基中培养细胞，追踪所指示的时间[35S] 用抗Cdc25C抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）和蛋白G树脂免疫沉淀Met-Cys和裂解的Cdc25C，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析。
克隆存活试验。
将细胞分离，以单细胞悬浮液的形式悬浮，并进行计数。通过生长培养基中的平板细胞加0.3%Noble琼脂测定克隆存活率。2周后，将平板固定，用0.01%结晶紫和1.5%醋酸染色，计数大于50个细胞的菌落。未辐照样品中的存活菌落数取100%。
体外激酶测定。
激酶反应在体外进行，使用[γ-32P] 如上所述的ATP(13,26). 激活转录因子2（谷胱甘肽）的重组融合蛋白S公司-转移酶[GST]–ATF2）和非活性形式的p38[GST-p38（KM）]分别用作p38和MKK6的底物。与Cdc25C的208到225残基对应的合成肽被用作人类Cds1的底物。肽磷酸化水平测定如下。将反应混合物应用于Whatman P-81磷纤维素纸。过滤器在1 mM乙酸中清洗两次，然后用4 mM焦磷酸钠清洗。剩余放射性通过液体闪烁计数进行定量。如其他地方所述，通过十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE分析蛋白质底物的磷酸化(13); 酶活性通过放射自显影或磷光成像测定。
免疫复合物激酶分析。
在含有20 mM Tris-HCl、120 mM NaCl、10%甘油、1 mM Na的缓冲液中裂解的细胞中免疫沉淀激酶三VO（旁白）4，2 mM EDTA、1%Triton X-100和1 mM苯甲基磺酰氟（pH 7.5）在4°C下保持15分钟(13,26). 在13000×克在4°C下保持10分钟。然后添加3-5μl MAPK或MKK抗体或1μl Cds1抗体，并在4°C下培养过夜；添加40μl蛋白A-琼脂糖（PBS中的1:1浆液），并在4°C下旋转试管2 h，以使蛋白A与抗体结合。然后用含有1%Triton X-100的PBS洗涤免疫沉淀五次，并用作上述体外激酶分析中的酶。
重组蛋白。
GST-ATF2和GST-Cds1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）并使用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠进行纯化（瑞典乌普萨拉法玛西亚生物技术公司）。他的全部6-标记的重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3），并使用Ni次氮基三乙酸纯化系统（Qiagen）进行纯化。伊斯6-先前已经描述过从重组杆状病毒感染的Sf9细胞中产生的Cds1(5). 如其他地方所述进行蛋白质印迹(20). 抗-Cdc2和抗磷酸化-Cdc2抗体来自马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室（NEB）。抗-Cdc25C抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。抗肌动蛋白抗体来自密苏里州圣路易斯Sigma。
北方印迹法。
使用马里兰州盖瑟斯堡Gibco BRL的Trizol试剂从U2OS细胞中提取总RNA。采用标准方法进行Northern印迹和杂交。用PCR方法从人Cdc25C cDNA的编码区产生抗人Cdc25 C mRNA的cDNA。
蛋白质印迹。
细胞裂解物或免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行解析，并转移到硝酸纤维素膜上。使用兔体内培养的多克隆抗体。第一抗体的稀释度如下：抗p38α/β，1:5000；抗p38γ，1:2000；抗p38δ，1:1000；抗凝集素（西格玛），1:1000；抗磷酸化Cdc2（NEB，马萨诸塞州贝弗利），1:1000；和抗Cdc2（NEB），1:1000。
报告基因检测。
GAL4应答质粒pG5E1bLuc包含五个克隆在驱动荧光素酶基因的最小启动子上游的GAL4位点。编码GAL4 DNA结合域与MEF2C、ATF2、ELK1或c-Jun激活域融合的表达质粒如前所述(61). 细胞生长在35-mm直径的多孔板上，并使用脂质体试剂（Gibco BRL）瞬时转染1μg总质粒DNA。使用β-半乳糖苷酶表达质粒（pCMV-β-gal；Clontech，Palo Alto，Calif.）控制转染效率。通过使用空载体pcDNA3，每次转染的DNA总量保持不变。36 h后制备细胞提取物，并测定β-半乳糖苷酶和荧光素酶活性。在评估非活性MKK的抑制作用的实验中，细胞在转染前12小时感染重组腺病毒。转染后24小时用血清或肿瘤坏死因子刺激12小时。
结果
γ辐射激活p38 MAP激酶途径。
为了评估p38通路在γ辐射刺激的细胞中的作用，我们首先检测了p38通路不同成分的激活。在暴露于γ射线的U2OS细胞（人骨肉瘤细胞系）中，测定了该级联反应中MAP激酶激酶MKK3和MKK6的激活。用6Gyγ射线照射细胞，并在照射后的不同时间点采集细胞。如别处所述，MKK3或MKK6由特定抗体免疫沉淀(25). 在体外激酶检测中，免疫沉淀用于磷酸化p38（KM）。如图所示。A、 辐射后1h检测到MKK6的活化，并维持16h。相比之下，在相同条件下，仅观察到MKK 3的中度活化，活化时间大大延迟。采用类似的方法研究γ辐射对p38亚型的激活。辐照后用异形特异性抗体免疫沉淀p38亚型，并以ATF2为底物进行激酶分析。图B表明p38α/β、p38γ和p38δ在相似的时间框架内被γ辐射激活。照射后1小时观察到活化，并保持升高至少16小时，这与MKK6活化的动力学有关。实验中使用的抗体的特异性如图所示。C.当使用HeLa细胞时，MKK6和p38亚型也被激活（数据未显示）。此处观察到的p38亚型的激活很可能是MKK6和MKK3的下游，而MKK5似乎是激活的主要原因。γ辐射引起的p38长时间激活与其他刺激（如细胞因子）产生的激活形成对比，在这种情况下，p38激活是暂时的(17,46).
γ辐射激活MKK6-p38通路。（A） 用6Gyγ射线照射U2OS细胞，在照射后的指定时间，MKK3和MKK6被免疫沉淀。以GST-p38（KM）为底物，通过激酶测定法测定MKK3和MKK6的激酶活性。Western blotting（WB）用于确保在所有样品中使用等量的激酶（下面板）。（B） 通过免疫复合物激酶分析，γ射线诱导p38α/β、-γ和-δ活化的时间进程。以GST-ATF2（1-109）为底物，用p38亚型特异性抗血清免疫沉淀分离p38，测定其激酶活性。再次，通过Western blotting（下面板）确保激酶的负载量相等。将不同时间点磷酸化p38（KM）（A）或ATF2（B）的放射性强度除以时间零点的放射性强度，计算折叠激活。在两个实验中获得了类似的结果。（C） 异型特异性抗体的特异性测定如下。293个细胞中表达标记的p38α、p38β、p38γ和p38δ。这些表位标记蛋白的表达通过使用抗Flag单克隆抗体M2的Western blotting进行测定（顶面板）。使用293个细胞的细胞裂解液中的异形特异性抗体免疫沉淀p38α/β、p38γ或p38δ，这些细胞已被不同的标记p38亚型瞬时转染。免疫沉淀物用抗Flag单克隆抗体M2进行免疫印迹分析。
MKK6的本构激活导致G2逮捕。
由于p38通路被γ辐射细胞激活，γ辐射可以引起G2许多不同的细胞被阻滞，γ辐射诱导的p38通路激活可能有助于G2/M检查点控制。因此，我们测试了p38通路的激活是否可以模拟γ辐射诱导G2逮捕。我们使用Ad.MKK6（E），一种由重组腺病毒编码的MKK6的组成型活性形式，在没有细胞外刺激的情况下激活p38通路(25). 在我们的实验细胞系中，腺病毒基因传递系统在不影响细胞活力或细胞周期的情况下达到了>95%的感染效率（数据未显示）。U2OS细胞在六孔培养板中培养，并用γ射线、Ad.MKK6（E）或Ad.MKK6（A）（腺病毒编码的非活性MKK 6）处理。用流式细胞仪分析细胞周期相分布；如图所示。A、 γ射线照射后，细胞积累了4N DNA含量。感染Ad.MKK6（E）的细胞也积累了4N DNA含量（图。B） ●●●●。带有4N DNA的细胞数量在Ad.MKK6（E）感染后24小时开始增加，同时G细胞减少1出现了相位。在MKK6（E）表达后，4N DNA含量的细胞数量增加，这在感染后16小时可检测到（数据未显示）。用光学显微镜检查细胞形态。感染Ad.MKK6（E）的细胞表现出与γ射线照射的细胞相似的形态学变化，并且典型地变大变平，几乎没有分裂细胞。因此，含有4N DNA的细胞的积累不太可能是由于M期细胞的增加。通过有丝分裂指数分析进一步证实了这一点（数据未显示）。Ad.MKK6（A）感染（图。B） 或编码绿色荧光蛋白（Ad.GFP）的腺病毒（数据未显示）对细胞周期曲线或细胞形态没有影响（数据未示出）。因此，γ辐射和MKK6（E）表达都诱导G2细胞周期阻滞。
γ射线照射和MKK6（E）表达均诱导G2逮捕。（A） 收集U2OS细胞，在γ射线照射（IR）6Gy后的指定时间固定，采用PI染色的FACS分析测定细胞周期。该图是使用CellQuest软件生成的。（B） U2OS细胞以2×10的密度接种在6孔板中5细胞/孔，并在电镀后24小时以1000 IFU/细胞感染Ad.MKK6（E）或Ad.MKK6（A）。然后在感染后的指定时间收集细胞进行细胞周期分析。（C） 用Ad.GFP（对照）或Ad.MKK6（E）感染HeLa、U2OS和SW480细胞，并在感染后48 h进行细胞周期分析。G中的细胞百分比2/使用MetLight软件计算M分期。数据是三个独立观测值的平均值±标准误差。（D） 腺病毒介导的MKK6基因表达的Western blotting分析。HeLa、U2OS或SW480细胞接种Ad.MKK6（E）后24小时以1000 IFU/细胞感染。感染后16 h对细胞进行裂解，并使用抗MKK6多克隆抗体进行Western分析。腺病毒编码的MKK6的表达可通过MKK总蛋白的增加来证明。用Ponceau S对膜进行染色，结果显示样品的装载量相等。膜的一部分显示在底部。
HeLa细胞和SW480细胞的Ad.MKK6（E）感染（图。C） 也导致具有4N DNA含量的细胞的增加。图D显示Western blotting检测到的Ad.MKK6（E）的表达。细胞在G中停滞的趋势2尽管所有三个细胞系都表现出显著的G2MKK6（E）表达后停止。而U2OS细胞表达野生型p53(24)HeLa细胞和SW480结肠癌细胞缺乏p53。奇怪的是，U2OS显示了最高的G百分比2-被捕的牢房。p53状态是否在决定MKK6介导的G水平中起作用2被捕情况不详。用Ad.MKK3（E）进行了类似的实验，它可以引起G2但与MKK6（E）处理的细胞相比，其程度要小得多（数据未显示）。由于γ射线照射和MKK6（E）表达诱导G2制动（图。)由于p38通路被γ辐射激活（图。)，很可能MKK6是γ辐射诱导G2逮捕。
G需要MKK6-p38γ级联2因DNA损伤而被捕。
p38通路的激活足以满足G2制动（图。). 因此，我们测试了p38通路的激活是否是G2γ射线照射引起的阻滞。我们首先确定G是否需要激活MKK62逮捕。用Ad.MKK6（A）感染U2OS或HeLa细胞，24小时后用6Gyγ射线照射。分析了不同时间点的细胞周期曲线，如图所示。A.γ辐射诱导U2OS、SW480和HeLa培养物中DNA含量为4N的细胞随时间增加。γ射线照射前MKK6（A）的表达显著降低了G2U2OS细胞中出现的阻滞（左侧面板）；MKK6（A）对G的抑制作用2在HeLa细胞（中间板）中也可以看到阻滞，但比U2OS细胞少。使用U2OS、HeLa和SW480细胞进行了类似的实验，但在单个时间点分析了三份样品（右侧面板）。MKK6（A）表达干扰γ辐射诱导的G2在所有三个细胞系中被捕。MKK6（A）对γ-辐射诱导的G的抑制作用2观察到MKK6（A）的表达在没有γ射线照射的情况下对正常细胞周期没有明显影响，这进一步支持了这种抑制（图。A） 而Ad.GFP感染细胞对经γ射线照射或未经处理的细胞的细胞周期进程均无影响。MKK3（A）表达对γ射线诱导的G2逮捕经过测试。尽管MKK3（A）和MKK6（A）的表达具有可比性，但MKK3A的表达对γ射线诱导的G2逮捕（数据未显示）。这些数据表明MKK6活性对G是必要的2γ射线照射引起的阻滞。
MKK6对于γ辐射诱导的G是必要的2逮捕。（A） U2OS或HeLa细胞以2×10接种5/感染Ad.GFP（对照）或Ad.MKK6（A）24小时后，再接受6 Gyγ辐射治疗。然后在指定的时间点收集细胞，并使用PI染色和流式细胞仪（左侧和中间面板）分析周期曲线。U2OS、HeLa或SW480细胞接种于2×105/感染Ad.GFP（对照）或Ad.MKK6（A）24小时后，再接受6 Gyγ射线（IR）治疗。然后在γ射线照射后16 h收集细胞，并使用PI染色和流式细胞术分析周期曲线（右侧面板）。带误差条的数据是三份样品的平均值±标准误差。（B） U2OS细胞感染指示形式的Ad.MKK（A）24h，然后用6Gyγ射线照射；辐照后24小时，G2对逮捕进行了分析。（C） 不同非活性MKK（A）对内源性MKK的抑制作用。用编码GFP（对照）、MEK1（A）、MEK5（A），MKK6（A）或MKK7（A）的重组腺病毒感染U2OS细胞。感染后12小时，用无血清培养基替换细胞。然后用β-半乳糖苷酶表达载体pCMVβ、报告质粒pG5E1bluc或与ELK1、MEF2C、ATF2或c-Jun的反式激活域融合的GAL4 DNA结合域表达载体共同转染感染细胞。使用空载体pcDNA3将总DNA归一化为每次转染1μg。转染后24 h用20%胎牛血清或肿瘤坏死因子α（100 ng/ml）刺激细胞12 h。测量细胞裂解物中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值表示为平均值±标准偏差(n个= 3).
测试G的累积2-阻滞细胞是所有MAP激酶途径的一般功能特征，我们检测了抑制ERK、JNK和ERK5/BMK途径对γ辐射诱导的G2逮捕。编码MEK1、MEK5和MKK7非活性形式的腺病毒分别用于阻断ERK、BMK和JNK通路。病毒感染24小时后，用6Gyγ射线照射U2OS细胞，24小时后收获细胞进行细胞周期分析。如图所示。B、 MEK1（A）、MKK7（A）或MEK5（A）的表达不影响G2γ辐射引起的阻滞。这些突变体的表达及其干扰各自MAP激酶通路的能力已经被证实(12,28). 报告基因转录分析用于证明在这些实验中获得了对内源性基因的约50%抑制（图。D） ●●●●。因此，我们的数据表明在γ辐射诱导的G中不需要MEK1、MKK7或MEK52细胞周期阻滞，并支持MKK6（A）对G的抑制作用的假设2逮捕是具体的。
γ辐射激活了p38的四种亚型（图。). 因此，我们研究了γ辐射诱导的G需要哪些p38亚型2逮捕。不同p38亚型的失活形式，其中磷酸化位点TGY突变为AGF（AF突变），如上所述使用腺病毒介导的递送系统表达。通过Western blotting（图。A、 顶部面板）。这些突变体抑制内源性p38 MAP激酶的能力通过免疫复合物激酶分析测定，如图所示。A.在U2OS细胞中观察到大约50%的内源性p38s活性抑制。病毒感染后24h，用6Gyγ射线照射细胞，并在不同时间分析DNA含量。如图所示。B、 只有Ad.p38γ（AF）能够减弱γ辐射诱导的G2逮捕。感染表达GFP的对照病毒或表达p38α、-β或-δAF突变体的病毒没有效果。我们还使用p38α/β抑制剂SB203580来测试这两种p38亚型在γ辐射诱导的G2逮捕。SB203580对G无影响2即使在非常高的浓度（50μM）下也会发生阻滞。总之，我们的数据将p38γ作为MKK6的下游激酶介导G2逮捕。
p38γ参与γ辐射诱导的G2逮捕。（A） U2OS细胞被Ad.GFP（对照）或腺病毒感染，如图所示，腺病毒表达p38的非活性形式，24小时后接受γ射线照射。G中的细胞百分比2/在照射后的指定时间对M期进行分析。带误差条的数据为三次观测的平均值±标准误差；获得了两个结果相似的实验数据。（B） p38α、p38β、p38γ或p38δ表达对内源性p38活性的抑制作用。如图所示，U2OS细胞感染了Ad.GFP（对照）或Ad.p38；24小时后，用γ射线（IR；6Gy）照射细胞。p38（AF）突变体的表达通过使用抗标记抗体M2（顶面板）的Western blotting分析测定。Ad.GFP（对照）或Ad.p38α（AF-以GST-ATF2（1-109）为底物，照射6h后用免疫复合物激酶检测感染细胞。
p38γ的激活依赖于ATM。
人们认为，DNA损伤是γ辐射诱导细胞反应的关键引发剂。ATM被认为通过激活包括G2细胞周期阻滞。因此，我们测试了p38γ的激活是否与ATM有关。自动取款机+/+或ATM−/−用6Gyγ射线照射人成纤维细胞，用免疫复合物激酶法测定p38γ的活性。p38γ亚型在ATM中被激活+/+信元，但不在ATM中−/−电池（图。A） ●●●●。紫外线诱导的p38γ活化在ATM中是正常的−/−细胞（数据未显示），类似于ATM中观察到的γ辐射和紫外线对JNK的激活+/+和ATM−/−单元格(55). 因此，γ辐射激活p38通路是ATM的下游。
γ辐射对p38γ的激活是ATM依赖性的。（A） 两台ATM+/+和ATM−/−将人成纤维细胞接种到直径为6 cm的培养皿中，并用6 Gy的γ射线照射。照射后在指定时间点收集的细胞裂解液中免疫沉淀出p38γ。在以GST-ATF2（1-109）为底物的激酶分析中测量p38γ活性。使用抗p38γ抗体的Western blotting证实了γ辐照样品中p38γ的等效载量。（B） 两台ATM+/+和ATM−/−将人成纤维细胞接种到直径为6cm的培养皿中，并在接种后24小时以10000IFU/细胞感染Ad.GFP（对照）或Ad.MKK6（E）。感染后24小时，对细胞进行或不进行γ射线（IR）处理。如材料和方法所述，在照射后24小时测定有丝分裂指数。带误差条的数据是三份样品的平均值±标准误差。
由于MKK6-p38γ级联在γ辐照后似乎是ATM的下游，我们测试了G2ATM中可以诱导逮捕−/−MKK6（E）表达的细胞。自动取款机+/+和ATM−/−用6Gyγ射线照射人成纤维细胞，并预先感染或不感染Ad.MKK6（E）。G公司2如图所示，通过有丝分裂指数分析确定阻滞。B.γ辐照诱导的G2ATM中的逮捕+/+信元，但不是ATM−/−而MKK6（E）在这两种细胞类型中都导致细胞周期阻滞。这一结果支持了MKK6-p38γ在ATM下游介导G2逮捕。
MKK6-p38γ级联的激活间接影响Cds1活性。
关于p38γ的功能有一些报道(11,23,33,35,40). 然而，关于p38γ的现有数据提供的有关p38γ调节G的机制的信息很少2逮捕。酵母细胞周期检查点控制的遗传学研究确定Chk1是γ辐射诱导G的必要成分2逮捕(57)，DNA复制检查点需要Cds1(44). 在哺乳动物细胞中，Chk1和Cds1都被认为参与G2γ辐照后的停堆(5,38,54). 为了确定Cds1是否是激活的p38γ的下游靶点，我们检测了感染构成活性MKK6或显性非活性p38γ细胞中Cds1的激活情况。Cds1自身磷酸化被激活以响应γ辐射(5,38)，我们使用该分析系统来确定Cds1是否被MKK6（E）激活。Cds1在感染Ad.MKK6（E）或对照病毒Ad.GFP 24小时后从U2OS细胞或γ射线照射1小时后从细胞免疫沉淀。如图所示。A、 Cds1的增强自磷酸化表明，γ射线和MKK6（E）都激活了Cds1。HeLa细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。当U2OS细胞在γ射线照射前用Ad.p38γ（AF）预感染24小时，Cds1的活化显著减弱（图。B） ●●●●。表达GFP的对照病毒没有效果。这些数据表明，MKK6-p38γ级联参与了γ辐射对Cds1的激活。
MKK6（E）在体内激活Cds1。（A） 在腺病毒感染后24小时，或在用6Gyγ辐射（IR）处理后1小时，收集U2OS细胞并裂解。（B） 如图所示，U2OS细胞在γ射线照射前24小时首次感染腺病毒。使用[γ-32P] ATP，SDS-PAGE显示。从三个独立的实验中获得了类似的结果。
γ辐射诱导人Chk1的修饰，可在SDS-PAGE上检测到其电泳迁移率的增加(54). 为了确定Chk1是否也受到MKK6（E）表达的调节，用血凝素标记的人Chk1 cDNA转染U2OS细胞，然后感染Ad.MKK6E或Ad.GFP。Western blotting显示重组Chk1蛋白。在MKK6（E）表达上未观察到Chk1带移位（数据未显示），表明Chk1可能不受MKK6-p38γ级联调节。
由于显性活性MKK6表达导致Cds1活性上调，因此Cds1可能直接位于MKK6-p38γ途径的下游。为了检验这种可能性，我们测试了p38γ是否可以直接调节Cds1活性。制备了重组His标记的人Cds1、p38γ、nd-MKK6（E），并用MKK6(7). 在反应混合物中加入MKK6（E）以激活p38γ，肽是Cds1的底物。尽管p38γ活性很强（使用GST-ATF2作为底物进行测量[数据未显示]），但未检测到Cds1活性的显著增加。细菌和杆状病毒表达的Cds1均获得了类似的结果。由于重组Cds1对Cdc25C具有可测量的基础活性，因此阴性结果可能不是由于重组蛋白的错误折叠所致。因此，p38γ对Cds1的体内激活可能是间接的。
MKK6激活导致Cdc2上的磷酸化增强。
Cdc2细胞周期蛋白B复合物的激活是控制G2/M过渡。G公司2停搏需要抑制Cdc2的酪氨酸磷酸化(6,27). 因此，测定了受γ射线照射或Ad.MKK6（A）或Ad.KK6的感染细胞中Cdc2的磷酸化状态。两种γ射线照射（图。A） 和MKK6（E）（图。B） 根据磷酸化Cdc2特异性抗体的测定，增加了Cdc2的磷酸化水平。MKK6（E）的组成活性可以维持Cdc2的磷酸化阶段数天（图。B） ●●●●。相反，MKK6（A）表达后，未观察到Cdc2磷酸化增加（图。B） ●●●●。
γ辐射和MKK6（E）都会导致Cdc2磷酸化。U2OS细胞受到6Gyγ辐射（A）或感染Ad.MKK（E）或Ad.MKK6（A）（B）。在处理后的指定时间收集细胞，用抗磷酸化（p）-Cdc2抗体进行Western blotting检测Cdc2的磷酸化水平。剥离印迹物，并用抗Cdc2抗体重制，以确认蛋白质载量相等。
γ辐射和MKK6活化下调Cdc25C水平。
为了评估MKK6活化与有丝分裂诱导剂Cdc25C之间的关系，通过Western blotting检测Cdc25C蛋白水平。γ射线照射后，观察到Cdc25C蛋白水平显著降低（图。A和B）。γ射线照射后Cdc25C还原的动力学与Cdc2的磷酸化增强相关（图。A） 和G2制动（图。A） ●●●●。表达MKK6（E）的细胞也是如此。MKK6（A）的表达对Cdc25C水平没有影响。因此，Cdc25C水平的降低与MKK6-p38或γ辐射的激活有关，而不是受感染细胞中非特异性代谢变化的结果。为了确定Cdc25C减少的原因，我们测量了Cdc25CmRNA水平和蛋白质稳定性。如图所示。C、 Northern印迹显示γ射线照射后稳态Cdc25C mRNA水平随时间而降低，这可能是蛋白质表达变化的原因。根据脉冲相位标记实验，经γ辐射处理的细胞中Cdc25C蛋白的稳定性也降低（图。D） ，表明Cdc25C稳定性的降低也可能有助于MKK6-p38γ级联激活引起的Cdc25C的降低。照射后4小时，Cdc25C水平下降。因此，它可能有助于维护G2最初因Cdc25失活或隔离而停止的细胞中的阻滞(5,52).
γ射线照射或MKK6（E）表达后Cdc25C水平降低。用6Gyγ射线（A）或Ad.MKK6（E）（B）处理U2OS细胞，并在处理后的指定时间点用Western blotting分析Cdc25C水平。剥离印迹，并用抗凝集素抗体进行复制，以显示均匀的负载。（C） 在琼脂糖凝胶上分离经6 Gyγ辐射处理的U2OS细胞20μg等分总RNA，并用Northern印迹法检测Cdc25C mRNA水平。28S rRNA水平显示为均匀加载。（D） U2OS细胞预先标记有[35S] Cys-Met照射1h和γ照射。然后用过量的未标记Met-Cys追踪细胞达指定时间，然后从细胞裂解液中免疫沉淀标记的Cdc25C并通过SDS-PAGE进行可视化。使用非特定拉下的带子作为加载控制。实验重复了三次，结果相似。
阻断MKK6-p38γ级联使细胞对辐射诱导的细胞杀伤敏感。
由于我们已经证明阻断MKK6-p38γ级联可以阻止γ辐射诱导的细胞周期阻滞，因此我们测试了抑制MKK6或p38γ是否会使细胞对γ辐射敏感。在进入有丝分裂前未能修复受损DNA的细胞可能会出现染色体断裂，并在随后的细胞周期中遭到破坏。这反映在它们无法形成殖民地。在γ射线照射前，用感染了Ad.GFP、Ad.MKK6（A）或Ad.MEK1（A）的细胞进行集落存活试验。培养连续稀释的细胞，直到菌落足够大，可以计数（每个菌落>50个细胞）。γ辐射以剂量依赖性的方式减少了形成的菌落数量，显示出其细胞毒性作用。然而，与模拟感染细胞或Ad.GFP或Ad.MEK1（A）细胞相比，感染Ad.MKK6（A）的细胞显著减少了γ射线照射后形成的菌落数量（图。A） ●●●●。在没有γ射线照射的情况下，腺病毒感染对集落形成没有影响。用Ad.p38γ（AF）阻断感染细胞中的p38γ活性也会使细胞对γ辐射的杀伤效应敏感，如图所示。B；4 Gyγ射线对Ad.p38γ（AF）感染细胞的细胞毒作用显著高于Ad.p38α（AF，Ad.p38β（AF。这些数据清楚地表明，干扰MKK6-p38γ级联可使肿瘤细胞对γ辐射敏感。
抑制MKK6-p38γ途径可增强γ辐射诱导的细胞死亡。U2OS细胞连续稀释接种，在暴露于指示剂量的γ辐射（B组中为4 Gy）之前，不使用任何物质（−）、Ad.GFP（对照）、Ad.MKK6（A）或Ad.MEK1（A）（A），或使用Ad.p38α（AF）、Ad.p38β。培养细胞，计数大于50个细胞的菌落。通过与未辐照细胞的存活率（取100%）进行比较来计算存活率。所示数据为三次观测的平均值±标准误差。
讨论
MKK6-p38γ级联在G信号传导中的重要作用2逮捕。
在本报告中，我们表明MKK6-p38γ级联被γ辐照激活（图。)并且这种激活不仅是必要的（图。和)但也足够了（图。)对于G2DNA损伤后被捕。因此，MKK6-p38γ级联形成了导致G的信号通路的重要部分2逮捕。虽然MKK6似乎是γ射线照射细胞中激活p38的主要MKK，但MKK3的适度激活可能会对p38群成员的激活产生附加效应。最近有报道称，显性阴性MEK2而非MEK1的表达导致G2/γ射线照射后M停止，实质上无法通过G2辐射照射恢复后立即停止(1). 我们还表明，G不需要MEK12制动（图。B） ●●●●。然而，据报道，G需要MEK12/正常细胞周期进程中的M转变(60). MEK1和MEK2是密切相关的同源物。MEK1和MEK2在细胞周期调节中的功能差异类似于p38α和p38γ在纺锤体组装和G中的各自作用2/M检查点控制。尽管没有数据表明MEK2激活是否足以满足G2阻滞，显性负MEK2对γ辐射诱导G的影响2逮捕表明在这个过程中还涉及其他MAP激酶。这将有助于研究MKK6-p38γ级联和MEK2之间的关系。ERK级联反应独立于p38通路；因此，MKK6-p38γ和MEK2不太可能处于同一级联中。然而，不能正式排除相声的可能性。
MKK6活化产生G的能力2p53缺陷细胞的阻滞表明p53对MKK6-p38γ介导的G2逮捕。然而，p53参与MKK6-p38γG表达的可能性2无法排除响应。虽然在不同的生理条件下，关于MKK6-p38γ级联激活的信息很少，但有证据表明，这种级联可以被多种刺激激活。然而，并非所有激活MKK6-p38γ的刺激都能导致细胞在G2/M相。MKK6-p38γ级联的长时间激活可能是区别γ辐射诱导激活与其他刺激的一个特征。
MKK6-p38γ级联与DNA损伤检查点机制的相互作用。
哺乳动物细胞中的DNA损伤检查点控制机制需要几种蛋白质。G需要ATM2γ辐照后的停堆和其他检查点组件，如Cds1，位于ATM的下游。由于p38γ激活依赖于ATM，而MKK6-p38γ级联的激活导致Cds1激活，我们认为MKK6-p38γ响应位于ATM和Cds1之间。示意图如图所示。.MKK6-p38γ位于ATM下游，以应对γ辐射诱导的DNA损伤。Cds1以MKK6-p38γ和ATM依赖方式激活，并与Chk1一起通过直接磷酸化下调Cdc25C活性。Cdc25C活性的降低和随后Cdc2磷酸化的增加导致细胞周期停滞在G2虽然我们的数据表明MKK6-p38γ位于Cds1激活的上游，但该模型并不排除其他途径也调节Cds1活性的可能性。
MKK6-p38γ途径参与DNA损伤检查点。有关详细信息，请参阅文本。
Cdc25C作为DNA损伤检查点控制中的核心调节器，是Cds1和Chk1的靶点(5,16,38,52,54). 针对DNA损伤的Cdc25C调节的当前模型是，通过Chk1和/或Cds1磷酸化Cdc25C允许14-3-3结合，这有助于从细胞核输出Cdc25Cs(37). 还报道了Cds1和Chk1磷酸化对Cdc25C的灭活(5,15). 我们发现，在γ射线照射或MKK6-p38γ活化后，Cdc25C水平降低（图。). Cdc25C蛋白水平的这种变化与Cdc2磷酸化增加相关（图。)表明该蛋白的丢失也有助于控制Cdc2活性。据报道，Cdc25在哺乳动物细胞和裂变酵母中降解(4,45)并被认为是细胞周期进展的重要调控机制。G中Cdc25C蛋白水平变化的作用2/此前尚未有M人被捕的报道。虽然导致Cdc2失活的直接事件是Cdc25C磷酸化和失活，但Cdc25C的蛋白减少可能是一种增强细胞周期检查点的加性机制。
p38组MAP激酶成员在细胞周期调控中的不同功能。
已发表的数据表明p38组的一个成员参与了细胞周期的进展。据报道，p38α在体细胞周期的纺锤体组装检查点中具有重要作用(56). 也有报道称，微量注射p38α可预防G1/S转换(42). 在这里，我们为p38γ在γ辐射诱导的G中的作用提供了证据2逮捕。尽管γ射线照射细胞中所有的p38亚型都被激活，但p38γ的作用似乎是显著的，因为只有激活p38γ才能诱导G2-相阻滞独立于p38组其他成员。然而，p38α在G中的作用1和/或纺锤装配检查点不能从γ射线照射的细胞中排除，因为一些细胞不可避免地逃逸G2检查点。因此，其他p38组成员也可能参与γ射线照射细胞，以在多个检查点保护细胞。p38激酶组的不同成员在正常或应激状态下的功能可能不同。据观察，SB203580对p38α/β的抑制显著延缓了细胞增殖（未发表的观察结果），p38α的过度表达抑制了细胞生长(21)这表明p38α参与了正常的细胞周期进程。然而，没有证据表明p38γ在细胞周期的正常进展中发挥作用。通过过度表达p38γ（AF）抑制p38γ活性对MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化]测定的细胞增殖没有检测到影响（数据未显示），表明p38γ可能主要参与将应激刺激传递给细胞周期机制。
MKK6-p38γ级联反应是放射治疗增敏剂的潜在靶点。
放射治疗广泛应用于癌症治疗，但由于肿瘤细胞的放射抗性，往往不成功(58,59). 电离辐射诱导的细胞死亡已经在许多不同类型的细胞中进行了研究，其机制和时间进程似乎是可变的。G的长度2/M期阻滞与细胞的放射抵抗呈正相关(三). 迫使细胞通过G的药物，如咖啡因2/DNA损伤后的M块是有用的，因为它们会增加细胞死亡(31). 我们在本报告中显示，干扰MKK6-p38γ级联显著增强γ辐射介导的细胞杀伤（图。). 由于p38γ在正常条件下是不活跃的，抑制p38γ不会影响正常细胞增殖，因此该途径中的分子可以被视为辐射增敏的潜在靶点。自从发现针对不同激酶的特定药理抑制剂以来，已经取得了巨大成功(14,34)p38γ或该途径中另一激酶的特异性抑制剂的开发是可能的。因此，了解p38γ调节G的机制2逮捕可能有助于制定改进放射治疗的新策略。
