摩尔细胞生物学。2000年7月；20(13): 4494–4504.
神经生长因子信号级联中非典型蛋白激酶C的定位：与PC12细胞分化和存活的关系
阿拉巴马州奥本市奥本大学生物科学系细胞和分子生物科学项目
*通讯作者。通讯地址：美国阿拉巴马州奥本市奥本大学生物科学系，331 Funiches Hall，Auburn University，邮编36849。电话：（334）844-9245。传真：（334）844-9234。电子邮件：ude.nrubua.ga@netoowwm网站. 收稿日期：1999年9月21日；1999年10月28日要求的修订；2000年3月20日验收。
摘要
非典型蛋白激酶C（aPKC）参与神经生长因子（NGF）信号传导的途径尚不清楚。我们之前报道过，在PC12细胞中，NGF诱导的分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活独立于经典和非经典PKC亚型，而NGF诱导分化需要PKC亚型别。NGF诱导的PKC-Ⅰ活化依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），并导致PKC-Ⅲ与Ras和Src的共结合。Src（DN2）或Ras（Asn-17）显性阴性突变体的表达削弱了NGF对PKC-Ⅰ的激活。在Raf-1水平上，活化不需要PKC-Ⅰ或PI3激酶；然而，PKC-Ⅰ对MEK的激活作用较弱。PKC-Ⅰ活性抑制剂和PI3K对NGF诱导的MAPK或p38活性没有影响，但降低了NGF刺激的c-Jun N末端激酶活性。Src、PI3K和PKC-Ⅰ同样需要NGF诱导的NF-κB活化和细胞存活，而Ras既不需要存活也不需要NF-κ）B活化，但需要分化。IKK与PKC-ι、Src和IκB以复合物的形式存在。与Src在调节NF-κB活化中的作用一致，Src活性的缺失会损害PKC-Ⅰ向IKK复合体的募集，并显著损害NGF诱导的p65/NF-κB向细胞核的移位。这些发现表明，在PC12细胞中，aPKC包含一个分子开关，用于调节NF-κB下游的分化和存活反应。基于这些发现，Src成为PKC-Ⅰ和NF-κB通路的关键上游调节器。
嗜铬细胞瘤细胞系PC12是研究神经生长因子（NGF）等神经营养因子的常用模型。用NGF处理这些细胞可诱导分化和存活。NGF信号级联始于Src-Ras盒的顺序动作(26)，导致丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化。抑制上游MAPK激酶MEK阻断NGF诱导的分化(43)从而表明MAPK在细胞分化中起着关键作用。然而，PC12细胞的分化并不一定需要MAPK的激活，因为骨形态发生蛋白2可以在没有MAPK激活的情况下诱导分化(18). NGF还导致p38激酶的激活(39)和c-Jun N末端激酶（JNK）(17,38). 此外，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）被激活，是NGF介导分化所必需的(19,22,25). PI3K也需要用于NGF生存信号(59).
蛋白激酶C（PKC）超家族，由11种亚型组成(51)也参与了调节NGF反应。PC12细胞表达所有11种PKC亚型，每种都被NGF激活(56,57)这意味着每一种都在调节NGF反应中发挥作用。鞘氨醇抑制PKC阻断NGF诱导的神经突起生长(16)以及微量注射PKC抗体抑制NGF诱导的神经突起生长和c-Fos表达(三). 然而，通过慢性佛波酯治疗下调PKC，导致经典和非经典PKC（cPKC和nPKC）池的去除，对NGF诱导的神经突起生长没有影响(46)或NGF诱导的MAPK激活(33). 我们证明了NGF分化不需要对佛波酯敏感的PKC亚型（α、β、γ、δ和ɛ），并进一步证明NGF激活了佛波酯敏感性非典型PKC（aPKC(9,56). 此外，只有在没有其他PKC的情况下，去除aPKC才能阻止NGF诱导的PC12细胞分化，这表明aPKC与NGF激活的其他PKC亚型之间存在层级关系(9). 最近，FEZ1（束状生长和延伸蛋白zeta 1），一种脑特异性转录物，是哺乳动物UNC-76的同源物，UNC-76是一种参与轴突生长和束状生长的蛋白质秀丽隐杆线虫已被鉴定为PKC-ζ结合蛋白，其在PC12细胞中的表达可刺激分化(28). 这些发现进一步强调了aPKC在控制神经元反应中的重要性。
aPKCs的过度表达通过NF-κB途径增强NGF反应性和分化细胞的存活(58). 这些发现与aPKC结合IKKβ并直接调节κB通路的能力一致(29). 由iota/lambda和zeta亚型组成的aPKC亚家族成员高度同源。此外，aPKC被沃特曼敏感的PI3K依赖性通路激活(2)涉及PDK1对aPKC的磷酸化(31). 此外，我们最近发现aPKC可以结合Src，导致aPKC的酪氨酸磷酸化(49). 关于aPKC与NGF生存/分化信号通路已知成分之间的精确位置，人们知之甚少。为了拓宽我们对aPKC在这些通路中的位置的理解，我们进行了一项详细的研究，以利用NF-κB作为下游靶点，绘制PKC-Ⅰ与Src-Ras/Raf-1/MAPK、p38和JNK通路成分之间的关系。此外，还研究了PI3K与该信号网络的关系，以及其在激活aPKC、Ras-MAPKs和NF-κB中的作用。我们发现Ras和Src都位于aPKC的上游，由PI3K调节。在PC12细胞中，激活MAPK不直接需要aPKC或PI3K。此外，NGF诱导的NF-κB活化需要Src。我们的发现揭示了两条离散的NGF信号通路是有效的；分化采用Ras-Src/aPKC盒，而存活仅限于Src-PI3K/aPKC途径。非典型PKC-Ⅰ是由一种新的Src激酶途径调节的分化和生存信号通路的一个组成部分。
材料和方法
材料。
NGF购自Harlan BioProducts for Science（印第安纳州印第安纳波利斯）。p38抑制剂SB203580、MEK抑制剂PD98059、Ras抗体、cPKC的假底物肽和氯螯素来自Calbiochem（加利福尼亚州拉霍亚）。MAPK、JNK和p38的磷酸特异性抗体从马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室获得。Raf-1、MEK、PKC-Ⅰ、IKK和c-Jun（S-63、KM-1）抗体和重组MEK从加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物科技购得。c-Src和p34-Src肽底物的抗体从Upstate Biotechnology获得，纽约州普莱西德湖PKC-Ⅰ假底物肽的肉豆蔻酰化和非肉豆蔻石酰化形式均由列克星敦肯塔基大学高分子结构中心合成。LY294002和沃特曼从BioMol，Indianapolis，Inc.购买。NF-κB寡核苷酸来自Promega（威斯康星州麦迪逊）。巨细胞病毒启动子（Src细胞）和Src控制下过度表达c-Src的PC12细胞−Simon Halegoua（纽约州Stony Brook）善意地提供了细胞（Src DN2表达鸡Src的K295R突变型[激酶死亡]）。Geoffery Cooper（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供了PC12细胞（M-M17-26），其表达干扰正常Ras功能的显性抑制突变RasN17。表达温度敏感性v-Src的PC12细胞由Gordon Guroff（美国国立卫生研究院）提供。Jorge Moscat（西班牙马德里自治大学生物分子中心）善意地提供了PKC结构。JNK和纯化谷胱甘肽的多克隆抗体S公司-与c-Jun的1到79个氨基酸融合的转移酶[GST-cJun（1-79）]是德克萨斯州休斯顿贝勒医学院周贵生赠送的礼物。
细胞培养。
PC12细胞生长在涂有胶原蛋白的塑料培养皿上，培养基为Dulbecco改良的Eagle's培养基，含有10%马血清和5%胎牛血清，如其他地方所述(56–58). 在用NGF治疗之前，细胞在1ml条件培养基和5ml无血清培养基中培养过夜。
aPKC活动。
PC12细胞用NGF孵育不同时间，在裂解缓冲液中提取（50 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，1%Triton X-100，2 mM EDTA，1 mM EGTA，蛋白酶抑制剂），并用亲和纯化的兔多克隆抗体进行免疫沉淀(20). 免疫沉淀物用含有0.5 M NaCl的溶解缓冲液洗涤五次。对于免疫复合物激酶分析，样品重新悬浮在激酶缓冲液中（35 mM Tris-HCl[pH7.5]，10 mM MgCl2，0.5 mM EGTA，0.1 mM CaCl2，1毫米第页-硝基苯基磷酸酯），含有1μg髓磷脂碱性蛋白（MBP）和5μCi（100μM）的[γ-32P] ATP在30°C下30分钟，最终体积为40μl。为了评估PKC-Ⅰ的特异性，在存在或不存在40μM假底物肽（SIYRRGARRWRKL）或不相关对照肽（IETVDNKASTRAY）的情况下进行检测，这两种肽均预培养5分钟。通过添加浓缩样品缓冲液终止反应，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后暴露于X射线胶片，并使用计算机接口密度计进行定量。MBP磷酸化被归一化为每个样品中PKC-Ⅰ的量，因此表达为任意单位的比活性。
PKC-Ⅰ与Ras或Src的免疫共沉淀。
使用的程序基本上与Diaz-Meco等人之前描述的相同(11). 用30 mM HEPES（pH 7.5）、1%Triton X-100、10%甘油、10 mM NaCl、5 mM MgCl的混合物溶解PC12细胞2，1 mM钠三VO（旁白）4、2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、25 mM NaF、1 mM EGTA和蛋白酶抑制剂。通过加入泛Ras抗体对裂解物进行免疫沉淀。通过添加蛋白A-琼脂糖，然后在4°C下培养过夜，恢复免疫复合物。用20 mM Tris-HCl（pH 7.5）–500 mM NaCl–1%Triton X-100–0.1%β-巯基乙醇清洗珠子两次，然后在含有10 mM Tris-HCl（pH7.5）、5 mM MgCl的缓冲液中进行最终清洗2，1 mM EDTA，25 mM NaF，100μM Na三VO（旁白）4leupeptin（20μg/ml）、胃蛋白酶抑制素A（1μg/ml。免疫复合物在12%凝胶上用SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素中，并用PKC-Ⅰ、Ras或Src抗体进行Western印迹；蛋白质通过增强化学发光鉴定。
aPKCs的纯化。
简而言之，用重组病毒感染Sf9细胞。在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM EDTA、43 mMβ-巯基乙醇、1%Triton X-100、PMSF和蛋白酶抑制剂的混合物中溶解细胞。通过10000×离心澄清裂解液克持续30分钟，如前所述纯化aPKC(60).
MEK-1的体外磷酸化。
使用免疫沉淀的Raf-1进行甲乙酮的磷酸化反应，在其中添加不同浓度的纯化PKC-Ⅰ。在存在或不存在PKC-Ⅰ抑制剂假底物肽（SIYRRGARRWRKL）的情况下进行反应。在30°C下，在50μl该缓冲液中用10μCi的[γ]进行激酶反应30分钟-32P] ATP，含或不含1μg天然底物MEK1。通过添加SDS样品缓冲液终止反应，并在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
Raf-1蛋白激酶活性。
用NGF刺激PC12细胞，并在含有10mM Tris-HCl（pH 7.4）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mM Na的缓冲液中溶解三VO（旁白）4、0.2 mM PMSF、1%Triton X-100、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂。通过离心澄清裂解液，并用25μl蛋白A-Sepharose预处理两次，每次1h。通过在4°C下添加Raf-1抗体和倒置末端结束1 h来免疫沉淀Raf-1，然后再添加30μl抗羊抗体再持续1.5 h。免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤三次，在哌嗪中洗涤两次-N个,N个′-双（2-乙磺酸）（管道；pH 7）–10 mM MnCl2–1μg抑肽酶/ml。在30°C下，在50μl该缓冲液中用10μCi的[γ-32P] ATP，含或不含1μg天然底物MEK1(48,53). 通过添加SDS样品缓冲液终止反应，并在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
激活Raf-1、p38、MAP和JNK。
Raf-1活化的测量也通过电泳迁移率变化分析（EMSA）进行测定，并通过Western blotting进行可视化，表明Raf-1磷酸化和活化(53). p38、MAP和JNK用磷酸特异性抗体免疫印迹法测定。通过添加0.1 M甘氨酸（pH 2）剥离印迹，然后中和，并用p38、MAP和JNK抗体重制。另外，JNK的活性也可通过免疫复合物激酶试验进行测定，如之前所述，以GST-cJun（1-79）为底物(17,37). 用计算机接口密度计扫描放射性蛋白带，以确定底物磷酸化的相对变化。
NF-κB EMSA。
在高盐洗涤剂缓冲液中制备细胞提取物（Totex；20 mM HEPES[PH7.9]，350 mM NaCl，20%[vol/vol]甘油，1%[wt/vol]NP-40，1 mM MgCl2，0.5 mM EDTA、0.1 mM EGTA、0.5 mM二硫苏糖醇[DTT]、0.1%PMSF、1%抑肽酶）(58). 通过离心收集细胞，在冰镇磷酸盐缓冲液中洗涤，再悬浮在4体积的Totex缓冲液中，在冰上培养30分钟，然后在13000×克温度为4°C。测定上清液的蛋白质含量，并将等量的蛋白质（20μg）加入到含有20μg牛血清白蛋白、2μg聚（dI-dC）、2μl缓冲液D+（20mM HEPES[pH 7.9]、20%甘油、100mM KCl、0.5mM EDTA、0.25%NP-40、2mM DTT、0.1%PMSF）的反应混合物中，4μl缓冲液F（20%Ficoll 400，100 mM HEPES，300 mM KCl，10 mM DTT，0.1%PMSF）和100000 cpm32P标记的寡核苷酸（5′AGTTGAGGGACTTTCCCAGGC 3′），最终体积为20μl。样品在室温下孵育25分钟。对于超移分析，向蛋白质中添加2至5μg抗体，并允许孵育过夜，然后将其纳入分析。过量AP-1（5′CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA 3′）或NF-κB寡核苷酸作为阴性对照。样品在6%三甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上溶解。将凝胶干燥并暴露于X射线胶片24至72小时。
IκB、Src和PKC-ι的共沉淀。
先前定义的(1)采用共沉淀法。简言之，PC12细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤，并在冰冷裂解缓冲液（20 mM Tris[pH7.8]，150 mM NaCl，1 mM CaCl）中溶解2，0.2%脱氧胆酸，0.2%NP-40，1 mM Na三VO（旁白）4，蛋白酶抑制剂）。将裂解产物与抗IKK和蛋白A孵育，并用裂解缓冲液广泛清洗含有复合物的小球。
Src活性测量。
如前所述(1)，Src在激酶溶解缓冲液（1.5%NP-40，150 mM NaCl，25 mM Tris[pH8]，25 mM-NaF，100 mM NaVO）中进行免疫沉淀和洗涤三)然后用15 ml激酶反应缓冲液（25 mM HEPES[PH7.4]，150 mM NaCl，5 mM MnCl）预培养2，100μM NaVO三)，在22°C下保持10分钟。激酶反应是通过添加5μCi的[γ-32P] ATP（6000 Ci/mmol）、5μM ATP和1μg p34 c-Src，并在2分钟后通过添加等量的2×SDS样品缓冲液终止；将混合物煮沸、干燥并暴露于X射线胶片。
细胞存活和分化。
为了评估细胞死亡或分化，对PC12细胞进行电镀，并在3天后用无血清培养基冲洗5次(59). 在每毫升有或无100 ng NGF的情况下处理培养物。48小时后，收集细胞及其培养基。添加台盼蓝检查细胞活力。对等分的细胞进行计数，并测定台盼蓝阳性染色细胞的百分比。或者，在添加NGF后6天，通过对神经突起生长的评分来确定PC12分化。拥有神经突的细胞百分比是通过三次计数处理来确定的。在一个治疗组中，至少有500个细胞被计数。具有神经突的细胞百分比是根据单个细胞具有一个突起，突起的长度大于两个细胞直径来计算的。成群细胞不包括在评分过程中。
结果
激活aPKC需要Ras、Src和PI3K。
从Santa Cruz获得的PKC-Ⅰ抗体先前已证明不会与其他PKC亚型或高度同源的PKCζ发生交叉反应(40). 为了验证免疫复合物激酶分析准确测量PKC-Ⅰ活性，采取了几种方法。以前，我们已经证明，使用原位分析，NGF诱导的PKC-Ⅰ激活导致aPKC活性大约增加两倍(56). 同样，在用NGF刺激PC12细胞后，免疫复合物激酶测定中测得的PKC-Ⅰ活性增加了约两倍（表). 因此，使用该测定法对NGF激活的PKC-ι的测量与使用单独方法的先前发现相似。aPKC缺乏C2结构域，因此不结合，也不受佛波酯的下调(51). 长时间使用佛波酯-肉豆蔻酸酯（PMA）处理导致PC12细胞缺乏cPKC和nPKC亚型(56). 在NGF刺激前，用1μM PMA处理PC12细胞48小时，未能改变PKC-Ⅰ活性水平。与假底物区互补的肽以前被证明是特异性PKC亚型的高度竞争性选择性抑制剂(30). 为了进一步验证PKC-Ⅰ的测定，用假底物肽处理细胞，在假底物多肽中添加了N-末端肉豆蔻酸，以促进其通过质膜的扩散。用假底物肽对cPKC亚型细胞进行处理不能抑制NGF刺激的PKC-Ⅰ活性的恢复，而用假底物质肽对非典型PKC-Ⅲ进行处理则会降低NGF刺激免疫复合激酶的活性。最后，在免疫沉淀之前，将PKC-ι抗体与肽抗原预孵育。在这种情况下，NGF刺激的PKC-ι的恢复被肽的包含所阻断。总之，这些发现验证了免疫复合物激酶测定PKC-Ⅰ活性的方法。
表1
| 治疗一 | PKC-Ⅰ的平均相对活性（%）±SD |
|---|
| NGF公司 | 100 |
| PMA+NGFb条 | 100 |
| cPKC PP+NGFc（c） | 98 ± 3 |
| aPKC PP+NGFc（c） | 50 ± 2 |
| 肽+神经生长因子d日 |
| 1:1 | 10 ± 3 |
| 1:2 | 0 |
| cPKC聚丙烯e（电子） |
| 25μM+NGF | 98 ± 5 |
| 50μM+NGF | 88 ± 6 |
| 100μM+NGF | 100 |
| aPKC聚丙烯e（电子） |
| 25μM+NGF | 42 ± 4 |
| 50μM+NGF | 22 ± 5 |
| 100μM+NGF | 8 ± 2 |
先前的研究表明，磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）是aPKC激活所必需的(41). 在PC12细胞中，NGF快速激活PI3K，从而产生PIP3(45). 因此，我们假设PI3K活性的消除可能会消除NGF诱导的PKC-Ⅰ活化。为了进一步确定PI3K在NGF激活PKC-Ⅰ中的作用，PC12细胞被沃特曼或LY294002预处理，沃特曼是PI3K的强效和特异性抑制剂(22). 另一方面，已证明白屈菜红碱氯化物是aPKC的一种有效且特异的抑制剂(30)因此被用作抑制PKC-Ⅰ活性的手段，并在这些实验中用作对照。NGF诱导的PKC-Ⅰ活化对PI3K敏感（图。)，并且PC12细胞的氯螯合剂预处理同样抑制NGF诱导的aPKC活性。在所有三种抑制剂的较高剂量下，aPKC活性显著降低。因此，NGF诱导的aPKC活化对氯氰菊酯和PI3K都敏感。
药物对aPKC活性的影响。在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50、100或200 nM）、LY294002（Ly；25、50或100μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3、6或9μM）预处理PC12细胞1小时。使用MBP作为底物的免疫复合物激酶分析法对PC12细胞裂解物（400μg）进行三次aPKC活性分析。所示数据为三个独立实验平均值的平均值±标准误差。N、 NGF公司。
由于NGF响应由Ras-Src盒式磁带组成(26)据报道，aPKC与Ras结合(11)并与Src互动(49)，我们初步确定NGF是否会刺激Ras和Src与PKC-Ⅰ的共结合。免疫共沉淀研究表明Ras和Src都与PKC-Ⅰ结合（图。A） ●●●●。PKC-Ⅰ和Src之间存在高度的基础相互作用；然而，NGF刺激的PKC-Ⅰ增加与Ras和Src复合，尽管刺激程度对Ras更为剧烈。由于PKC-Ⅰ结合了这两种蛋白，因此同样研究了Ras或Src在NGF诱导的PKC-Ⅱ激活中的需求。如图所示。B、 Ras或Src活性的缺失对NGF刺激的PKC-Ⅰ产生了深远的影响，每种活性都降低了PKC-Ⅱ对NGF的反应动力学。PKC-Ⅰ活性的测量标准化为分析中PKC-Ⅱ的量；此外，所有三种细胞株均表达等量的PKC-Ⅰ。因此，PKC-Ⅰ的量与活化程度的差异无关。有趣的是，在没有Src或Ras的情况下，只观察到PKC-Ⅰ活性的部分抑制，这表明可能还有其他因素也有助于PKC-Ⅲ的调节。
PKC-Ⅰ与Ras和Src共伴生。（A） 如指示，用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至15分钟。制备细胞裂解物（500μg），并用Ras或Src抗体免疫沉淀（IP），然后用PKC-Ⅰ抗体免疫印迹（WB）。作为标准加入分析的是PC12细胞全细胞裂解物（WCL；70μg）。作为阳性对照，用Ras、Src或PKC-Ⅰ抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物（50μg）。（B） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至60 min，然后用MBP为底物的免疫复合物激酶分析法分析三份aPKC活性。该实验重复了另外两次，结果相似。
Raf-1由Ras独立于Src和PKC-Ⅰ进行调节。
为了进一步剖析aPKC信号通路，研究了Src/Ras和PKC-Ⅰ与NGF诱导的Raf-1活化的关系。研究表明，Raf-1的过度表达可刺激PC12细胞的突起生长(54)，证明了Raf-1在分化反应中的过度表达需求的充分性。此外，NGF激活Raf-MAPK级联(55). 据报道，通过共转染方法，aPKC可以独立于Raf-1激活MEK(48)表明也存在Raf-1非依赖性途径。因此，我们采用多种方法探讨PKC-Ⅰ对NGF诱导的Raf-1活化的调控。作为对照，在缺乏Ras或Src活性的细胞中验证了NGF对Raf-1的激活（图。A） ●●●●。Raf通过磷酸化激活；因此，p74Raf-1在SDS-PAGE上的迁移率的超移可以用作Raf-1活化的指标。由PC12、Src制备的细胞裂解物−，或Ras−用EMSA分析NGF刺激的细胞对Raf的激活（图。A） ●●●●。NGF诱导的Raf-1活性依赖于Ras而不依赖于Src，因此通过凝胶位移验证了Raf-1的活性测定，并解释了这些PC12细胞克隆变体的任何可能差异。抑制aPKC活化的药物（图。)对NGF诱导的Raf-1的活化几乎没有影响（图。B） ●●●●。通过转染具有显性阴性表型的PKC-Ⅰ或PKC-ζ突变体，进一步证实了aPKC不能调节Raf-1(5,6). 从NGF刺激的转染细胞获得的细胞裂解物被证实具有降低的aPKC活性水平（数据未显示）。缺乏aPKC活性对NGF诱导的Raf-1活化没有影响（图。C） ●●●●。此外，aPKCs的过度表达未能增强NGF诱导的Raf-1活化(58). 这些发现（图。B和C）同样通过使用MEK作为底物的免疫复合物激酶测定中的Raf-1活性进行验证：aPKC或PI3激酶抑制剂对Raf-1激酶几乎没有影响（数据未显示）。总的来说，这些发现表明，aPKC并不直接影响NGF诱导的PC12细胞MAPK信号级联中Raf-1节点的激活，并且与之前将MEK定义为调控关键点的工作一致(48).
Ras、Src和aPKC相对于Raf-1的定位。（A） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至30 min。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。（B） 在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50或100 nM）、LY294002（Ly；25或50μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3或6μM）预处理PC12细胞1小时。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。C、 控制；N、 NGF公司。（C） 用对照构建体、突变体PKC-ι（I多用途终端)或突变PKC-ζ（Z多用途终端). 此后，如图所示，用NGF（100 ng/ml）刺激细胞0或15分钟。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。根据NGF刺激Raf-1过度磷酸化/活化的能力（如相对分子量增加或凝胶位移（–––）所示），对样品进行+评分。这些实验重复了另外两次，结果相似。右侧显示了66 kDa的频带。
由于以前的研究表明aPKC可能能够直接激活MEK(6,48)，我们进行了一项分析，以探讨aPKC对PC12细胞中MEK自身的调节。在体内-体外激酶试验中，观察到aPKC直接磷酸化MEK（图。A） ●●●●。aPKC假底物肽的加入以剂量依赖的方式阻断了aPKC诱导的MEK磷酸化。此外，aPKC与Raf-1协同刺激MEK磷酸化。为了探讨aPKC和PI3激酶在MEK激活中的位置，评估了NGF刺激的MEK活性（图。B） ●●●●。我们观察到NGF刺激的MEK活性依赖于PI3K、aPKC和Src。总之，这些发现支持aPKC独立于Raf-1对MEK的调节(48).
PKC-Ⅰ激活MEK。（A） 用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞15分钟，然后用Raf-1免疫沉淀（IP），并进行体外激酶反应，如[γ]所示-32P] 1μg重组MEK1存在下的ATP。样品通过SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分离，然后进行放射自显影。显示了自磷酸化的PKC-Ⅰ和磷酸化的MEK1。尺寸以千道尔顿表示。（B） 如前所述，使用免疫复合物激酶分析测定MEK1活性(48). 活性的相对变化被归一化为NGF处理的相对变化。在其他两个实验中也得到了类似的结果。N、 NGF公司。
aPKC和PI3K不能调节p38、MAPK或JNK。
在其他系统中，据报道aPKC位于MAPK的上游(5,6)以及JNK(58). PC12细胞中aPKCs过度表达可轻微增强MAPK，显著增强NGF激活的JNK(58). 此外，aPKC能够直接激活JNK，从而将aPKC定位在JNK的上游。使用补充药理学方法，我们绘制了Ras、Src和aPKC与p38、MAPK和JNK下游激活的关系。NGF已被证明能刺激所有三种激酶，JNK、MAPK和p38的激活(19,22,39). NGF对MAPK的激活依赖于Ras，与Src稍有无关，而p38的激活则独立于Ras和Src（图。A） ●●●●。由于NGF诱导的aPKC活性对氯氰菊酯和PI3K敏感（图。)这些抑制剂被用于探索aPKC与p38、MAPK和JNK的相对位置。用这些抑制剂预处理PC12细胞未能减少NGF刺激的MAPK或p38活性（图。B） 与之前报道的PI3K对NGF刺激的MAPK活性缺乏影响的研究一致(25). 由于用磷酸化JNK抗体获得的印迹质量较差，因此使用GST-cJun（1-79）作为底物的免疫复合物激酶检测法来检测aPKC抑制剂对NGF刺激的JNK激酶活性的影响。NGF刺激的JNK激活约2倍，与之前报道的类似(17). NGF对JNK的激活依赖于Ras、Src、aPKC和PI3K。此外，v-Src的结构性活化对JNK的活性有着深远的影响（表). 通过测量S63处活化的c-Jun磷酸化，证实了这些观察结果（数据未显示）。JNK上游aPKC的定位与我们之前使用遗传方法的发现类似(58).
Ras、Src和aPKC相对于MAPK和p38的定位。（A） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至30 min。裂解后，用SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白（70μg），然后用抗磷酸-MAPK或-p38抗体进行免疫印迹。剥离印迹，并用MAPK或p38的非磷酸特异性抗体进行复制。（B） 在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50或100 nM）、LY294002（Ly；25或50μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3或6μM）预处理PC12细胞1小时。裂解后，用SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质（70μg）然后用抗磷酸-MAPK或-p38抗体进行免疫印迹。这个实验重复了三次，结果相似。C、 控制；N、 NGF公司。
表2
Src、Ras、aPKC和PI3K对JNK活性的调节一
| 治疗 | JNK活性（折叠刺激） |
|---|
| PC12控制 | 1 |
| PC12+NGF | 2.8 ± 0.4 |
| Ras公司−+NGF公司 | 1.5 ± 0.3 |
| Src公司−+NGF公司 | 1.2 ± 0.4 |
| v-Src公司 | 4.2 ± 0.6 |
| PC12+麦汁+NGF | 1.1 ± 0.3 |
| PC12+LY+NGF | 1.3 ± 0.4 |
| PC12+CH+NGF | 1.1 ± 0.3 |
由于aPKC在其他系统中位于MAPK上游，而PC12细胞中的过度表达未能显著增强NGF诱导的MAPK激活(58)，采用多种替代方法进一步探讨aPKC与MAPK的关系。首先，瞬时转染激酶头PKC-ζ或PKC-Ⅰ未能抑制NGF刺激的MAPK。其次，用肉豆蔻酰化的假底物处理aPKCs的细胞不能抑制NGF刺激的MAPK。最后，向PC12细胞输送反义或正义寡核苷酸也未能抑制NGF刺激的MAPK（数据未显示）。总之，这些发现进一步证明了aPKC对PC12细胞MAPK通路的直接调控。这些发现与替代JNK激酶途径对aPKC的调节一致(58)（表). 综上所述，这些结果表明aPKC、Src和PI3K是新定义的通路的组成部分，与经典的Ras-MAPK信号级联不同。
NGF诱导的NF-κB活化依赖于PKC-Ⅰ、Src、JNK和PI3K，而与Ras无关。
aPKC位于NGF信号通路中NF-κB的上游(58)，与它在其他信号范例中的位置一致(5,10,12). 激活NF-κB的一个重要步骤是通过IKKα或IKKβ磷酸化IκB。此外，aPKC位于IKKβ的上游，通过磷酸化调节激酶(29)从而记录了aPKC和NF-κB途径之间的直接相互作用。为了进一步分析aPKC与下游转录靶点的关系，我们检测了Ras或Src对NGF诱导的NF-κB活化的需求。NGF诱导的NF-κB活化以前被描述为延长(29). 观察到NGF激活NF-κB需要Src而不是Ras（图。A） ●●●●。与Src要求一致，Src的过度表达增强了基础NF-κB水平。为了确定JNK、MAPK或p38激酶的需求，用靶向这些信号转导通路的特定药物对PC12细胞进行预处理。姜黄素特异性抑制JNK(8)PD98059抑制MEK和MAPK(43)，p38被SB202190抑制(39). 评估这些药物损害NGF诱导的NF-κB活化的能力。抑制JNK可显著抑制NGF诱导的NF-κB（图。B） ●●●●。NF-κB的激活对MEK敏感，对p38相对不敏感。PI3K在介导NGF诱导的NF-κB中的作用也同样被检测（图。C） ●●●●。LY294002或沃特曼宁（PI3K的有效抑制剂）预处理导致NGF诱导的NF-κB活性的剂量依赖性抑制。
Ras、Src和aPKC相对于NF-κB的定位。（A） PC12，Ras公司−，高级−或用NGF（100 ng/ml）刺激过度表达c-Src的细胞0至6 h。裂解后，等量蛋白等分样品进行EMSA分析。（B） 用姜黄素（Cu；5或20μM）、PD98059（PD；15或60μM）或SB202190（SB；5或20μM）预处理PC12细胞，然后加入NGF（100 ng/ml）3小时。裂解后，对相等的蛋白质等分试样进行EMSA分析。（C） 在添加NGF（100 ng/ml）3 h之前，用沃特曼（Wort；25至200 nM）或LY294002（Ly；12.5至100μM）预处理PC12细胞1 h。裂解后，等分蛋白质进行EMSA分析。这个实验重复了两次，结果相似。
为了确定PI3K相对于Src的位置，我们还研究了沃特曼或LY294002对NGF诱导的Src激酶活性的影响。PI3K抑制剂均未阻断Src活性（数据未显示）。因此，Src独立于PI3K调节aPKC。这一发现与PI3K对Src-介导的PKC-Ⅰ酪氨酸磷酸化缺乏影响一致（M.L.Vandenplas、M.L.Seibenhener和M.W.Wooten，提交发表）。因此，aPKC由Src和PI3K独立调制。
先前的研究表明，NGF促进PC12细胞在无血清环境中的存活，而不依赖于Ras(59)但依赖于PI3K。也有人认为，调节NGF功能需要两条不同的非重叠途径(24)Ras通路是分化的主要调节器，而PI3K调节PC12细胞中的一条单独的生存信号通路。另一方面，aPKC已被证明可以阻断PC12细胞的分化(9)而aPKC的过度表达显著提高了生存和分化(58). 这些发现支持存在两种途径，一种与另一种的成分重叠。因此，研究人员绘制了Ras-Src、PKC-Ⅰ、PI3K、p38、MAPK和JNK的位置图，以确定PC12细胞中分化途径的哪些元素与生存途径的成分重叠（表). 如前所述(59)，Ras是分化所必需的，但不是生存所必需的。另一方面，Src是生存和分化所必需的。此外，Src的过表达增强了PC12细胞在无血清环境中的存活。生存和分化都依赖于PI3K。通过PMA下调去除cPKC或nPKC对存活或分化几乎没有影响。相比之下，通过肉豆蔻酰化假底物肽或螯合菊酯氯化物处理去除aPKC可阻断存活和分化反应。抑制MAPK或p38对存活率没有影响，但需要分化。另一方面，抑制JNK阻碍生存，类似于去除aPKC。总的来说，这些发现揭示了Ras-MAPK通路和Src-aPKC-PI3K通路是分化所必需的，而存活仅限于Src通路的组成部分，独立于Ras-MAPK盒。
表3
Src、Ras、PKC和PI3K对PC12细胞存活和分化反应的影响一
| 治疗 | %生存 | %差异化 |
|---|
| PC12−NGF | 48 ± 4 | 0 |
| PC12+NGF | 74 ± 6 | 60 ± 6 |
| Ras公司−−天然气 | 49 ± 5 | 0 |
| Ras公司−+NGF公司 | 48 ± 7 | 0 |
| Src公司−−天然气 | 8 ± 2 | 0 |
| Src公司−+NGF公司 | 29 ± 6 | 38 ± 6 |
| Src公司哦−天然气 | 66 ± 4 | 0 |
| Src公司哦+NGF公司 | 84 ± 8 | 75 ± 6 |
| LY，50μM | 12±4 | 0 |
| LY+NGF | 48 ± 3 | 0 |
| W、 100毫微米 | 22 ± 7 | 0 |
| W+NGF公司 | 52 ± 6 | 0 |
| PMA，1μM | 47±5 | 0 |
| PMA+NGF | 85 ± 6 | 79 ± 8 |
| aPKC，50μM | 5 ± 1 | 0 |
| aPKC+NGF | 24 ± 3 | 30 ± 4 |
| cPKC，50μM | 23 ± 3 | 0 |
| cPKC+NGF | 59 ± 6 | 54 ± 5 |
| CH，6微米 | 2 ± 1 | 0 |
| 频道+NGF | 42 ± 6 | 32 ± 8 |
| PD，60μM | 60 ± 4 | 0 |
| PD+NGF | 79 ± 6 | 0 |
| SB，20微米 | 69 ± 6 | 0 |
| SB+NGF | 73 ± 6 | 0 |
| 铜，20μM | 0 | 0 |
| 铜+NGF | 56 ± 6 | 37±4 |
Src调节IKK–PKC-ι复合物的形成，并介导NF-κB生存信号通路的上游部分。
aPKC可以与IKK形成复合物，使激酶磷酸化，从而激活NF-κB通路(29). 此外，Src通过增加其酪氨酸磷酸化状态和调节酶活性来调节aPKC(49; Vandenplas等人提交）。自Src−细胞不能激活NF-κB，我们假设Src可能通过调节酪氨酸磷酸化PKC-Ⅰ与IKK的相互作用，在aPKC与NF-κ）B通路的偶联中发挥作用。为了验证这个想法，IKK在NGF刺激后从对照组和Src的等效蛋白中免疫沉淀−PC12电池（图。). IKK与PKC-Ⅰ、Src和IκB构成相关，而在Src中−尽管两组免疫沉淀物的Src/IκB水平相似，但观察到细胞与IKK复合的PKC-Ⅰ的恢复急剧减少（对比图。). 用金雀异黄素（一种有效且选择性的酪氨酸激酶抑制剂）预处理PC12细胞，同样减少了与IKK络合的PKC-Ⅰ的数量（数据未显示）。因此，IKK与PKC-Ⅰ的相互作用依赖于两种独立方法测定的Src酪氨酸激酶活性。NF-κB的激活先于信号诱导的IκB降解。NGF治疗后，PKC-Ⅰ与IκB分离（图。A） 在与PKC-Ⅰ激活和Src诱导的PKC-Ⅱ酪氨酸磷酸化以及NF-κB平行激活相一致的时间范围内(58; 范登普拉斯提交）。为了测试在这个过程中对Src活性的需求，在Src中检测PKC-Ⅰ/IκB的相关性−细胞和TrkA细胞（图。B） ●●●●。用NGF处理细胞后，PKC-Ⅰ从IκB复合物中分离出来（图。A和B）。然而，在缺乏Src的细胞中，没有观察到这种分离；相反，PKC-Ⅰ和IκB之间的基础共结合水平较低，这与在缺乏Src活性的IKK复合体中观察到的PKC-Ⅲ/IκB的数量一致（图。). 金雀异黄素治疗同样阻断PKC-Ⅰ/IκB的分离。这些结果表明，Src酪氨酸直接参与PKC-Ⅰ与NF-κB通路的偶联。此外，Src活性需要刺激p65/NF-κB向细胞核的移位（图。C） ●●●●。最后，在Src中检测IκB的降解−细胞。NGF未能刺激Src中IκB的降解−与TrkA（74%）细胞相比（图。D） ●●●●。总之，IKK/PKC-ι的解偶联（图。)与缺乏NGF刺激的NF-κB活化类似（图。和C、 和D） Src中观察到PKC-Ⅰ活性降低−电池（图。). 这些数据表明，Src酪氨酸激酶在调节IKK和PKC-ι之间的相互作用中发挥作用，而Src活性的缺失消除了信号诱导的PKC-ι和IκB的解离。因此，PKC-ι/IκB相互作用的调节将解释先前在缺乏Src活性的PC12细胞中观察到的NF-κB DNA结合的缺失（图。A） ●●●●。
Src调节IKK与aPKC的关联。PC12细胞，亲代或Src−，用NGF（100 ng/ml）处理指定时间，用抗IKK免疫沉淀裂解物（500μg）。免疫沉淀物（IP:IKK）或裂解物（50μg）作为阳性对照，用PKC-Ⅰ、Src和IκB抗体进行免疫印迹（WB）。这个实验重复了两次，结果相似。
PKC-Ⅰ/IκB共结合需要Src。（A） 用NGF（100 ng/ml）处理PC12细胞指定的时间，并用抗IκB免疫沉淀（IP）裂解物。沉淀用PKC-Ⅰ抗体进行免疫印迹（WB）。（B） PC12细胞、用染料木素（Gen；20μM）或Src预处理的细胞−用NGF（100 ng/ml）处理细胞达到指定时间，用抗PKC-Ⅰ免疫沉淀裂解物。沉淀用IκBα印迹。（C） PC12或Src−将细胞暴露于NGF（100 ng/ml）30 min。分离细胞核并用抗p65/NF-κB抗体进行免疫印迹。（D） PC12或Src−将细胞暴露于NGF（100 ng/ml）30 min。制备全细胞裂解物（50μg）并用IκB抗体进行免疫印迹。对印迹进行扫描，IκB强度的相对变化如括号所示。
总的来说，这些发现表明aPKC、PI3K和Src是生存信号通路的主要组成部分，与NF-κB的调节相耦合，NF-κ子B通过JNK与分化途径的元件相互作用（图。). 我们的发现支持存在一种分化途径，该途径包含不同生存信号级联的要素。
说明aPKC在NGF信号级联中的相对定位以促进生存和分化的模型。aPKC可以激活MEK并位于JNK的上游。Ras和Src都位于aPKC的上游，PI3K也是如此，而aPKC位于NF-κB的上游，直接与IKK相互作用。分化需要Src和Ras途径的组成部分。分化途径与通过Src、aPKC和PI3K的生存途径的组成部分重叠。生存信号传导与Ras无关，但依赖于PI3K、Src、aPKC和NF-κB。我们的研究结果支持一个模型，即aPKC占据一个关键节点，能够通过MEK和JNK的调节以及NF-κB上游与Ras-MAPK相互作用。NGFR，NGF受体。
讨论
在这项研究中，我们表明PKC并不作为Ras-MAPK通路的一个组成部分存在，而是一个平行的、不同的信号通路的组成部分。我们的数据表明，c-Src以一种新的方式调控这一途径。研究表明，Src和Ras都能诱导类似NGF的神经突起延伸(4,42,50). 微注射研究最初提出了一种用于NGF信号传导的Src-Ras信号盒，其中Src位于Ras的上游(26). Ras-Raf-MAPK通路的持续激活不足以维持PC12分化(52). 此外，pp60 Src的激活也是PC12分化所必需的(26). 代替线性Src-Ras级联，这些数据支持存在并行Src级联，这对于PC12分化非常重要。H19-7细胞也支持这种并行级联，这些细胞是大鼠E17海马细胞，用表达温度敏感性猿猴病毒的逆转录病毒载体有条件地永生化(27). 在非许可温度下，当T抗原失活时，细胞分化。在这些条件下，未检测到v-Src激活Ras-Raf-MAPK。在本研究中也进行了类似的观察，即v-Src未能诱导MAPK途径，但显著增强了JNK活性。因此，Src和Ras似乎激活了两条离散的通路，JNK和MAPK。由于Ras和Src通路都是分化所必需的，因此观察MEK的抑制和神经突起生长的消除(43)这意味着MEK可能是两条路径重叠的会聚点。v-Src和活化的MEK协同诱导神经突起生长，将支持存在一条单独的途径，该途径可以在MEK水平上进行交叉对话，以支持PC12细胞的分化。我们的发现与之前在其他系统中的工作一致(6,48,53)证明aPKC可以调节MEK。因此，作为MEK激酶的aPKC可能直接充当Ras/MAPK和Src/JNK通路的汇合点。
先前研究表明，aPKC的过度表达可以调节JNK通路，而使用全长反义结构去除aPKC可以阻断NGF诱导的JNK活性(58). 与这些发现一致，通过药理操作抑制aPKC同样阻断了NGF诱导的JNK激活。因此，在PC12细胞中，aPKC将自身定位在JNK的上游。此外，NGF对JNK的激活受PI3K的影响，因为沃特曼和LY294002均削弱了NGF的作用，这与Src而非Ras调节NGF诱导的JNK活性的能力一致。这一发现与v-Src表达增强JNK激活的能力一致，同时形成轴突。虽然JNK在应激信号方面的研究较为普遍，但它也被表皮生长因子激活(34). 以前的研究(25)结果表明，PI3K的过度表达导致JNK的激活，而不是MAPK的激活。我们的发现将PI3K定位在JNK的上游。我们得出结论，Src、PI3K、aPKC和JNK是新定义的信号级联的组成部分，与JNK调节神经突起生长的能力一致(23)以及NF-κB的存活和激活(32). 衔接蛋白Crk也参与TrkA信号传导(36). 与v-Src调节JNK的能力一致，v-Src对JNK的激活被Crk的显性阴性突变体阻断(13). 基于这些发现，我们提出存在Src–PI3K–aPKC–JNK–NF-κB通路，包括PC12细胞中的生存信号级联。
虽然存活率与Ras无关，但证实了其他人的观察结果(59)，生存反应需要Src。为了与Src在细胞生存中的作用保持一致，我们观察到Src的过度表达可以提高细胞在无血清环境中的生存，其程度与PKC-Ⅰ的过度表达一样(58). 此外，Src过度表达导致NF-κB的结构性激活。此外，只有去除Src或aPKC才能显著促进细胞死亡。这些结果表明，NF-κB的激活可以模拟神经保护作用，而NFκB抑制可以降低细胞活性。在这方面，抑制PI3K可阻断细胞存活和NGF诱导的NF-κB活化。这些结果强烈支持NGF激活NF-κB的途径，该途径涉及PI3K、Src和aPKC，它们协同提供神经保护功能。这一发现与NF-κB的结构性激活相一致，NF-κ子B能够促进对凋亡的抵抗(15)以及NF-κB活化促进其他系统存活的能力(21). 与MAPK或p38相比，JNK对NF-κB通路的NGF诱导有着深刻的影响，因此，与MAPK和p38的改变相比，PC12细胞中JNK的调节对生存的影响可能更直接。事实上是这样的，因为JNK的抑制消除了NGF诱导的κB活性，同样也阻止了细胞存活和分化。因此，我们假设Src-PI3K-aPKC-JNK通路任何元件的过度表达都会促进NF-κB活性的增加和细胞存活。
先前的研究表明，aPKC在κB依赖性转录中起着关键作用。最近的研究表明，aPKC在体内外直接调节IKK(29). 此外，去除aPKC同样可以阻止NGF诱导的NF-κB活化，而过度表达aPKC可以增强NF-κ）B活性和PC12细胞在无血清环境中的存活(58). 本文的结果进一步定义了Src在NF-κB激活中的关键作用，并将Src和PKC-Ⅰ置于共同的信号级联调节NF-κ的B中。这与该实验室最近的观察结果一致，证明Src与aPKC结合，同样是酪氨酸磷酸化的(49; Vandenplas等人提交）。此外，aPKC的酪氨酸磷酸化由Src独立于PI3K介导（Vandenplas，提交出版）；同样，PI3K调节aPKC活性独立于对Src的影响。因此，尽管PI3K与通过aPKC调节NF-κB有关，但PI3K位于与Src不同的途径。此外，本文提供的证据支持Src诱导的aPKC调节有助于调节IKK/aPKC、NF-κB和细胞存活之间的耦合。在缺乏Src活性的情况下，aPKC不能与IKK偶联，同样通过抑制IκB休息复合物的分离来阻断NF-κB的激活，从而直接影响存活和分化。因此，Src成为PKC-Ⅰ与κB通路偶联所必需的关键调节因子。在这方面，Src的过度表达类似于PKC-Ⅰ的过度表达(58)，增强NF-κB活性和生存反应性。
在其他细胞中，aPKC与κB通路的关联通过p62（aPKC结合蛋白）发生(44)，将PKC-ι定位于受体复合物(47). 由于Src调节aPKC与IKK的相互作用，因此Src也可能在指导p62与受体复合物的结合方面发挥作用。目前正在进行研究，以解决这种可能性。FEZ1，另一个最近发现的PKC结合蛋白(28)，可能通过分化途径为NGF受体的关键元件提供支架，因为该蛋白与UNC-76同源，UNC-76是一种参与轴突生长和神经束形成的蛋白秀丽线虫两种结合蛋白p62和FEZ1之间的差异及其与NGF反应的关系值得考虑，因为特定信号级联的支架以及调节这些相互作用的因素可能对指导信号特异性至关重要。每个结合蛋白的作用可能是将aPKC构建到特定的信号通路。
Src家族激酶先前与成骨细胞发生的调节有关(1)，T细胞功能(14)和记忆障碍(35). 与本文的观察结果类似，小鼠骨髓巨噬细胞中NF-κB的肿瘤坏死因子诱导同样由Src介导，通过在IκB和Src之间形成长寿复合物(1). 在T细胞中，v-Src能够激活NF-κB(14). 此外，Src家族成员Fyn的缺失与海马发育异常、长期增强缺陷和记忆受损有关(35)，与aPKC激活耦合的过程。因此，通过Src介导的酪氨酸磷酸化对aPKC的调节可能对许多其他系统是常见的。
总之，我们的研究揭示了由一种新的Src激酶途径调控的aPKC在NF-κB活化中起着关键作用。由于aPKC所处的位置，它在调节分化和生存信号通路中发挥作用。因此，我们的观察结果与aPKC在调节PC12细胞NGF反应中发挥关键作用相一致。
致谢
我们感谢为本研究提供cDNA、试剂和细胞系的众多研究人员。我们感谢实验室成员进行了富有成果的讨论。
本研究由NINDS拨款RO2-NS33661和奥本大学生物赠款项目资助。
参考文献
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