摩尔细胞生物学。2000年4月；20(8): 2803–2808.
p53在复制性衰老中的翻译后修饰与DNA损伤诱导的衰老重叠但不同
,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,2和1,*
凯瑟琳·韦伯利
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
简·A·邦德
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
克里斯托弗·琼斯
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
杰里米·布莱德斯
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
阿什利·克雷格
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
特德·赫普
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
大卫·温福德-托马斯
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
威尔士大学医学院病理学系癌症研究运动实验室，加的夫CF14 4XN，1邓迪大学Ninewells医院医学院分子和细胞病理学系，邓迪DD1 9SY，2大不列颠联合王国
收稿日期：1999年9月16日；1999年11月4日要求的修订；2000年1月19日接受。
摘要
人类成纤维细胞的复制性衰老完全依赖于磷酸蛋白p53的功能，并与p53依赖性转录的激活相关。然而，还没有证据表明p53在衰老过程中发生翻译后修饰，这增加了转录活性的变化是由辅激活子上调引起的可能性。通过使用一系列具有磷酸化敏感表位的抗体，我们现在发现衰老与p53 N和C端假定调控位点的主要变化有关，这与丝氨酸-15、苏氨酸-18和丝氨酸-376的磷酸化增加以及丝氨酸-392的磷酸化降低一致。电离和紫外线辐射产生重叠但截然不同的反应，丝氨酸-15磷酸化增加是唯一常见的变化。这些结果支持p53在信号复制性衰老中的直接作用，并与端粒侵蚀产生的信号一致，该信号具有DNA双链断裂的部分但并非全部特征。
正常的人体体细胞（干细胞可能除外）只能进行有限数量的细胞分裂，分裂后会进入一种不分裂但仍能存活的状态，称为复制性衰老(22,55). 这种现象对人类健康的意义是双重的。一方面，它给克隆扩增带来了自然障碍，而克隆扩增可能在限制肿瘤发展方面发挥着至关重要的作用(2,38,59). 另一方面，在一些组织中，尤其是皮肤和血管中，随着年龄的增长，可能会导致进行性功能异常。这可能直接由再生能力丧失引起，也可能间接由衰老相关的生化变化引起，一个很好的例子是老化的皮肤成纤维细胞分泌胶原酶增加，即使只有少数细胞明显衰老，这也可能是显著的(11,34). 因此，了解细胞衰老的潜在机制对癌症和衰老研究都至关重要。
我们和其他人已经证明，介导复制性衰老的一个关键信号通路涉及磷酸蛋白p53，p53因其作为肿瘤抑制因子的作用而被广泛认可，众所周知，它可以调节生长停滞，以响应包括DNA损伤在内的多种细胞应激信号(31,40). 实验性废除p53功能可以阻止成纤维细胞正常进入衰老，确实可以逆转既定的衰老，这表明p53即使不足够，也肯定是这个过程所必需的(5,6,20). 此外，衰老中的生长停滞与p53转录激活功能的启动密切相关，这一点通过报告基因构建物的使用和DNA结合分析揭示出来(1,7,50).
然而，到目前为止，衰老还没有被证明会导致p53蛋白的任何翻译后修饰，从而导致其对其他信号（如DNA损伤）的激活(19). 因此，这就留下了这样一种可能性，即上述数据可能不是通过p53本身的任何初级修饰，而是通过上调p53结合辅激活子来解释的，该辅激活子调节其与私有靶启动子的相互作用能力，其中有几个候选(40)，其中之一，p33ING1型(18)已经证明在衰老的成纤维细胞中过度表达(17). 换言之，尽管p53的存在是必不可少的，但它可能只是在衰老中扮演被动伴侣的角色，而不是积极的生化开关。
过去未能检测到磷酸化的变化可能是由于依赖传统的32P代谢标记，现在被认为是由于自身照射产生DNA损伤信号，其本身可能干扰p53的磷酸化状态，从而掩盖正在寻找的特定变化(8). 最近出现了对其表位磷酸化状态敏感的p53抗体组（磷酸化特异性抗体），这使得我们能够重新检查这个问题，而不会遇到这种伪影。我们现在首次表明，p53确实在衰老的成纤维细胞中受到翻译后修饰，表位反应性的变化重叠，但与DNA损伤剂诱导的变化不同。
材料和方法
细胞和培养条件。
人类新生儿二倍体成纤维细胞（HCA2成纤维细胞；由德克萨斯州休斯顿贝勒学院的詹姆斯·史密斯善意提供）在含有10%胎牛血清（FCS）（Gibco/BRL）的Dulbecco改良Eagle’s培养基（Gibco/BRL）中生长。如前所述(20)衰老的最低标准如下：（i）在最终1:2传代后3周内，尽管定期补饲，仍未能达到融合；（ii）90%以上的细胞表现出特征性的扩大、扁平形状；以及（iii）通过免疫荧光检测，超过90%的细胞在72小时标记期后未能结合溴脱氧尿苷（BrdU）（数据未显示）。
DNA损伤剂。
对于UV照射，移除培养基，将无盖的培养皿置于UVG-11 Mineralight灯（U.V.Products，San Gabriel，CA）下，并暴露于每米25J的UVC2经过25秒的时间，细胞被重新计数。对于γ辐射（IR），将密封烧瓶放置在137Cs源持续约2分钟，总剂量为5 Gy。
以250μg/ml的最终浓度（之前确定为在这些细胞中获得最大生长停滞所需的最低剂量）添加博莱霉素（英国米尔顿·凯恩斯，伦德贝克）1小时，然后用正常培养基清洗细胞并重新培养。
抗体。
小鼠单克隆抗体（作为纯化的免疫球蛋白制剂）是从内部（DO-12、FPS15、FPT18和FPS392）或癌基因科学（PAb421、[Ab-1]、DO-1[Ab-6]）获得的，并在使用前在磷酸盐缓冲液-吐温缓冲液中的0.6%牛血清白蛋白中酌情稀释。
蛋白质印迹分析。
细胞（～106)在含25 mM HEPES（pH 7.6）、5 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.4 M KCl、5 mM-EDTA、10 mM NaF、2μg Pefabloc（Roche Diagnostics）/ml、20μg leupeptin/ml、1μg抑肽酶/ml、2μg/ml胃蛋白酶抑制素、10μg胰蛋白酶抑制剂/ml、，和1 mM苯甲脒，并通过离心清除。在十二烷基硫酸钠–10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳裂解液上清液（每道15μg蛋白质），并用聚偏二氟乙烯（Immobilon-P；Millipore，Watford，United Kingdom）进行印迹。使用浓度为1μg/ml的抗体FPS15、FPT18、DO-1、DO-12、PAb421或FPS392检测免疫反应性p53，然后使用增强化学发光检测系统（Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，United Kingdom）和过氧化物偶联兔抗鼠二级抗体检测。用印度墨水对斑点进行染色，以检查蛋白质含量是否相等。使用运行分子分析软件的GS700成像密度计（英国Hemel Hempstead的Bio-Rad实验室）对信号进行扫描量化。在蛋白质负荷差异超过20%的情况下，通过将增强的化学发光信号归一化为印度墨水信号来调整。所有西方分析均在独立的裂解物上进行了至少三次。引用“对照”的平均相对变化（±标准误差）（必要时校正蛋白质负荷的差异），除非两个样本中的一个没有给出可检测信号。
体外磷酸酶治疗。
细胞裂解物在4°C下，在含有25 mM HEPES（pH 7.6）、5 mM DTT、0.2 M KCl和15%甘油的缓冲液中透析6 h。在含有25 mM HEPES（pH 7.6）、50 mM NaCl、5 mM MgCl的缓冲液中，将蛋白磷酸酶2A（英国普尔Sigma-Aldrich）（0.5 U）添加到含有15μg蛋白质的透析裂解液中21 mM DTT、0.02%Triton X-100、1 mM苯甲脒和10%甘油，并在30°C下培养1 h。处理后的和对照（模拟消化的）裂解物然后通过上述蛋白质印迹法进行分析。
BrdU分析。
在70%乙醇中固定（4°C下30分钟）之前，通过将BrdU（Roche Diagnostics）添加到最终浓度为10μM的溶液中1小时来鉴定正在进行DNA合成的细胞。在用4 M HCl（10 min）和0.1 M硼砂（pH 8.5）预处理（5 min）后，使用小鼠抗BrdU一级抗体（Dako）检测合并的核BrdU，然后使用过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白（Dako），最后使用二氨基联苯胺底物。用苏木精对细胞进行复染后，基于每个数据点>300个细胞的样本量，评估阳性细胞核的比例（BrdU标记指数）。
结果
衰老成纤维细胞中p53的翻译后修饰。
我们使用一组小鼠单克隆抗体寻找翻译后修饰的证据，这些单克隆抗体在我们的实验室中有广泛的特征，针对被怀疑在调节p53转录激活中起重要作用的磷酸化位点。
在N末端，我们使用抗体DO-1(51)结合一个表位（氨基酸20至25），重叠p53的反式激活和mdm2结合域(9,32,46)最近我们发现丝氨酸-20的磷酸化对其有抑制作用(8,13)以及两种新的内部抗体FPS15和FPT18，我们已经证明它们对丝氨酸-15磷酸化的p53具有特异性(13)和苏氨酸-18(14)分别是。
在C末端，我们使用抗体PAb421，它识别一个表位（氨基酸372到382）(46)含有多种丝氨酸，其中至少一种丝氨酸-376的磷酸化被证明可以阻断结合(53). 对于氨基酸392的假定酪蛋白激酶II位点，我们使用了一种新的内部单克隆抗体FPS392（J.P.Blaydes、H.M.Ball、N.J.Traynor、N.K.Gibbs和T.R.Hupp，提交出版），该抗体针对与人类p53的氨基酸378至393相对应的肽，包括丝氨酸-392的磷酸化残基。在体外酪蛋白激酶II磷酸化前后使用重组人p53进行的蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附试验证实，FPS392在变性条件下或固相分析中对其表位的磷酸化形式具有特异性（Blaydes等人，提交）。
最后，为了控制总p53蛋白水平的变化，我们还使用了针对中心核心结构域（氨基酸256-270）的抗体DO-12(三,52)，其在体内不被磷酸化。
蛋白质斑点（图。a） 使用“年轻”人二倍体成纤维细胞（PDL）在～35倍的群体倍增水平（PDL≈65）下的裂解液，从相同的传代细胞库中制备，直到达到复制性衰老（PDL约65），如前所述(20).
衰老、DNA损伤剂和静止对人二倍体成纤维细胞p53免疫反应的影响。如图所示，使用单克隆抗体FPS15、FPT18、DO-1、DO-12、PAb421和FPS392对全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。（a） 衰老（S）与年轻（PDL≈35）（Y）成纤维细胞的比较；（b至d）与模拟处理对照组相比，紫外线辐射、IR和博莱霉素分别对年轻成纤维细胞的影响（+）；（e） 与增殖对照组相比，低血清浓度（Q）诱导的静止效应（C）；（f） 与模拟治疗对照组相比，IR（+）治疗96小时后观察到长期生长停滞的效果。印迹用印度墨水染色，以检查每对通道中总蛋白转移的等效性（仅显示在面板a的下部图像中）。通过与重组p53标准品的比较来验证p53迁移的位置（结果未显示）。请注意，文中引用的值是指至少三次西方分析的平均值，因此，对于一些成对样品，并不完全对应于此处显示的单个示例。
当归一化为细胞总蛋白时，与年轻成纤维细胞相比，使用抗体DO-12，在衰老的裂解液中未发现p53蛋白总量的变化。同样，抗体DO-1没有观察到变化，表明丝氨酸-20磷酸化没有变化(8). 相反，与年轻细胞裂解物相比，衰老过程中观察到以下变化。（i） 在N末端，FPS15的结合增加了3.8-±0.2倍（平均值±标准误差），FPT18的结合诱导更显著，这与丝氨酸-15的磷酸化增加和苏氨酸-18的从头磷酸化一致。（ii）C末端定向抗体PAb421和FPS392的结合显著减少（分别为5.7-±0.4倍和5.4-±0.1倍）。鉴于磷酸化对这两种抗体的结合具有已知的相反影响，这一结果与PAb421表位内磷酸化的增加（很可能在丝氨酸-376处）一致，但FPS392表位的磷酸化减少（丝氨酸-392处）。
在Western分析之前，用蛋白磷酸酶2A对体外裂解产物进行预处理，消除了所有上述差异（图。)证实它们是磷酸化改变的结果，而不是其他可能的共价修饰。FPS392（和FPS15）表位的某些结合持续存在，几乎可以肯定地反映出使用体外磷酸酶的纯催化亚单位从某些位点完全去除磷酸盐的已知困难，而不是反映出缺乏抗体特异性，我们已经在Western blot上显示出这种特异性极高(13; Blaydes等人提交）。
通过磷酸酶处理逆转衰老诱导的磷酸特异性抗体结合的变化。显示了用蛋白磷酸酶2A（+PP2A）与未消化裂解物（−PP2A”）进行体外处理后的年轻（Y）或衰老（S）培养物裂解物的Western blot分析。
我们使用因人类端粒酶催化亚单位（hTERT）的强制表达而避免衰老的成纤维细胞重复上述分析。这些是在我们的实验室中通过将hTERT cDNA克隆到pBABEpuro中构建的逆转录病毒载体感染现有HCA2成纤维细胞而获得的(57)和Bodnar等人的原始实验所预期的一样(4)到目前为止，已达到150多人口的两倍，超过了预期的衰老点，增长率没有下降。蛋白质斑点（图。)使用我们的磷酸特异性抗体对这些假定的永生化成纤维细胞的裂解物进行检测，结果显示磷酸化特征（除了FPS392结合部分减少外）与正常年轻成纤维细胞非常相似，表明hTERT稳定端粒长度足以阻止与衰老相关的几乎所有磷酸化变化。
hTERT表达永生化成纤维细胞中p53磷酸化衰老相关变化的消除。对年轻（Y）或衰老（S）成纤维细胞的裂解物进行Western blot分析，并与通过强制表达端粒酶催化亚单位hTERT而避免衰老的人群（T）进行比较，结果显示，在正常增殖寿命之外约80倍的人群中进行了分析。对于显示衰老相关变化的四个表位中的每一个，数字表示针对蛋白质负载的任何差异校正的p53条带的强度（上图）（下图）。注意T和Y值之间的总体相似性。
衰老和DNA损伤诱导的翻译后修饰的比较。
同样的抗体组也用于评估DNA损伤剂在年轻成纤维细胞中的作用，其剂量如前所示，可导致p53介导的转录激活(7)和生长停滞(56).
为了评估“巨大”损伤（如嘧啶二聚体）的影响，将成纤维细胞暴露于紫外线照射（25 J/m2)16小时后制备裂解物用于Western blot分析（图。b） ●●●●。出乎意料的是，使用抗体DO-12检测不到p53蛋白总水平的变化。然而，观察到磷酸特异性抗体结合的主要变化。在N末端，FPS15结合增加（6.3-±0.8倍），与衰老相似。然而，与后者不同的是，FPT18结合没有变化，这仍然无法检测到，但DO-1结合增加了（3.0-±0.1倍），与丝氨酸-20的去磷酸化作用一致。在C末端，PAb421结合减少了3.9-±0.1倍，与衰老中观察到的相似，但与后者形成鲜明对比的是，与FPS392的结合增加了12.0-±0.9倍。
为了评估DNA链断裂损伤的影响，成纤维细胞暴露于IR（5 Gy）或博莱霉素（250μg/ml）中，并在4小时后进行分析（图。c和d）。再次，未观察到DO-12结合的变化。在N末端，这些变化与衰老中的变化相似，包括FPS15和FPT18结合增加，（与紫外线的影响相反）与DO-1的结合没有变化。然而，在C末端，与衰老和紫外线的影响形成了鲜明对比，FPS392结合没有变化，与PAb421结合的减少相反，与之结合的增加（IR和博莱霉素治疗后分别是6.5-±0.5-和2.1-±0.1倍）。
沉默对p53翻译后修饰的影响。
在上述比较中，一个可能的混淆影响是所分析的培养物的生长状态。特别是，在衰老的培养物中，与IR后4小时的年轻培养物相比，基本上所有细胞都失去了周期，其中很大一部分仍处于S期，这增加了观察到的这两种状态之间磷酸化的一些差异，尤其是PAb421表位的相反变化的可能性，具有误导性。
为了解决这一问题，我们首先通过在低血清浓度（0.2%FCS）中培养72小时来检测诱导年轻成纤维细胞生长停滞的效果，不受DNA损伤的影响，在此之前，通过1小时的BrdU标记评估，只有3%的细胞处于S期，相比之下，在10%的FCS中增殖的对照培养物中为45%。在N末端，与10%FCS的对照培养物相比，仅观察到磷酸特异性抗体结合的微小变化（FPS15和DO-1的结合增加<1.5倍）。然而，在C末端，PAb421结合显著减少，其幅度甚至比衰老时更大（10.0-±0.7倍）（图。e） ●●●●。
作为对生长状态次要影响的进一步测试，我们还利用了公认的发现(16,33)在5-Gy IR后，绝大多数人成纤维细胞最终处于类似衰老的不可逆生长停滞状态。在照射后96小时对培养物进行研究，此时BrdU标记证实接近总生长停滞（标记指数，<1%）。与照射4小时的细胞相比，FPS15结合的增加较低（2.5-±0.3倍，而4.8-±0.2倍），FPT18没有检测到结合（图。f） ●●●●。此外，在第4小时观察到的PAb421结合的增加在第96小时不再明显。然而，这些假衰老细胞中磷酸特异性表位反应性的结果与真正衰老的未辐照细胞的结果仍然明显不同（图。; 表).
表1
衰老、静止和DNA损伤剂对人成纤维细胞中单克隆抗体与p53结合的影响
| 治疗 | 更改一绑定：
|
|---|
| DO-12号文件 | 浮式生产储油船15 | 第18页 | DO-1公司 | PAb421型 | FPS392系列 |
|---|
| 衰老 | → | ↑ | ↑ | → | ↓ | ↓ |
| 紫外线辐射 | → | ↑ | → | ↑ | ↓ | ↑ |
| 红外（+4小时） | → | ↑ | ↑ | → | ↑ | → |
| 博莱霉素 | → | ↑ | ↑ | → | ↑ | → |
| 静止（0.2%FCS） | → | [↑]b条 | → | [↑]b条 | ↓ | → |
| 红外线（+96小时） | → | ↑ | → | → | → | → |
表中总结了在所有上述条件下抗体结合的变化和图。.
维恩图强调了衰老、紫外线辐射和红外对人类二倍体成纤维细胞中磷酸特异性p53表位的影响之间的主要相似性和差异性。
讨论
我们的数据首次表明，正常人成纤维细胞的复制性衰老与磷酸特异性抗体与p53 N端和C端潜在调节位点结合的主要变化有关。
这些变化是在变性电泳后观察到的，因此必须反映共价修饰，而不是p53结合蛋白掩盖表位。虽然在C末端，除了磷酸化之外，还发生了修饰，尤其是乙酰化(21,42)和O糖基化(43)考虑到所用抗体的特异性和磷酸酶治疗的结果，可以合理假设表位反应性的观察到的变化反映了以下情况：（i）在N端，丝氨酸-15和苏氨酸-18的磷酸化增加，以及（ii）在C端，丝琳-392的磷酸化降低，PAb421表位的磷酸化增加，很可能是丝氨酸-376(53).
我们只能推测，在之前的研究中，由于技术原因，这些变化被忽略了，这反映了通过以下方式无意中诱导了混杂的DNA损伤反应32P标签(8)和/或所用方法缺乏解决方案(1,29).
为了深入了解这些变化的功能意义以及可能的上游信号线索，我们比较了衰老细胞中磷酸表位反应性的模式与DNA损伤后p53激活的特征更好的模型中的模式。在N末端，UV和IR（以及辐射模拟剂博莱霉素）都导致FPS15的结合增加，其程度与衰老时相似。连续观察到丝氨酸-15磷酸化对DNA损伤剂的反应(39)有强有力的证据表明，它通过构象变化和mdm2结合的破坏，在p53的激活和稳定中发挥作用(44). 几种候选激酶已被鉴定(19)尤其是ATM相关蛋白、ATR和（更具争议的）DNA依赖性蛋白激酶(26,54)有证据表明，不同形式的DNA损伤在反应中起着不同的作用。例如，对IR的早期响应需要ATM(45)而对IR和UV的延迟响应需要ATR(48). 另一方面，据我们所知，之前没有关于苏氨酸-18磷酸化的报道，这是在IR和衰老时观察到的。然而，最近的体外研究表明，它在干扰p53-mdm2相互作用方面可能更有效(10,14)因此，这是一个非常合理的额外p53激活机制。
与衰老效应和N端IR效应的相似性相反，IR导致PAb421在C端的结合增加而不是减少。Waterman等人之前曾报道过IR后PAb421表位的揭开(53)他提供了证据，证明它是由丝氨酸-376磷酸酶的ATM依赖性激活引起的，并通过允许其与14-3-3蛋白结合来激活p53。然而，尚不清楚这如何与以前的证据相一致，尽管主要来自体外研究，相反的变化，即PAb421表位的掩蔽（通过磷酸化或抗体结合）也可以导致DNA结合和转录因子活性的激活(20,23–25,37,47). 有趣的是，紫外线辐射虽然引起了IR后丝氨酸-15的相同变化，但却导致PAb421位点表位的掩蔽增加，从而类似于衰老，而不是IR。这伴随着IR后未发现的其他两个变化，即DO-1结合增加，反映出丝氨酸-20磷酸化降低，FPS392结合增加，表明丝氨酸-392磷酸化增加；这两种情况都曾在其他细胞模型中报道过(三,13,27,35).
我们认为，PAb421位点的对比结果可能反映了这样一个事实，即与更早的时间点（4小时）相比，紫外线照射后16小时的衰老和细胞周期阻滞更彻底用于研究对IR的反应（这些时间是根据文献中报道的最大p53功能反应决定的）。事实上，Milner和Watson的工作长期支持这一观点，他们发现PAb421结合缺失与DNA损伤无关的静止相关(36). 因此，我们检测了血清剥夺诱导的细胞周期停滞的影响（我们和其他人已经证明这是p53独立的），并且确实发现PAb421结合的显著减少，其幅度甚至比衰老时更大，并且在N末端只有最小的变化。作为解决生长状态可能产生的混淆影响的进一步方法，我们还分析了IR后的稍后时间（96小时）的细胞，当时绝大多数细胞经历了不可逆的生长停滞，其特征类似于衰老(16,33,41). 尽管有证据表明在N末端有持续修饰，但在4小时时观察到的PAb421表位结合的初始增加在此时已完全恢复到对照水平。
对这些数据的最简单解释是，生长停滞导致PAb421表位的磷酸化增加，这在衰老和紫外线照射的细胞中是“未被对抗的”，但通过持续的去磷酸化反应在IR处理的细胞中有效抵消。这与红外光谱显示的假定丝氨酸-376磷酸酶依赖ATM激活的证据一致(53)以及ATM在应对紫外线方面缺乏参与(12,28,45). 紫外线和衰老之间的相似性反过来表明后者也可能是ATM独立的。事实上，这与ATM缺乏的人成纤维细胞的衰老没有延迟，并且与p53 DNA结合活性的正常诱导有关的观察结果是一致的(50). 正如最近提出的那样(30,48)不同的基因组应激刺激可能通过重叠但不同的磷脂酰肌醇3-激酶相关超家族激酶组合向p53发出信号。因此，有必要确定是否与紫外线一样(48)是ATR激酶，而不是ATM，它在衰老中起着重要作用。
总之，这些数据确定了衰老和DNA损伤时p53氨基酸磷酸化的重叠但不同的特征，其中两种，丝氨酸-15和苏氨酸-18，根据其已知的生物效应，作为激活修饰物是非常合理的。衰老时激活的p53候选转录靶点包括p21waf1其在衰老成纤维细胞中的诱导被针对p53的N末端反式激活域的抗体阻断，如我们小组之前所示(20); 然而，有趣的是，通过对衰老成纤维细胞的Western blot分析，我们未能检测到另一个主要p53靶点mdm2的诱导作用（K.Webley和D.Wynford-Thomas，未发表的数据）。
现在有非常有力的证据，无论是观察还是实验，表明触发衰老的潜在细胞分裂“时钟”是基于染色体端粒的逐渐侵蚀(4). 我们的发现是，在通过端粒酶的强制表达而永生化的细胞中，衰老时p53磷酸化的变化几乎完全被消除，这表明这些修饰不仅是对时间或培养中细胞分裂数量的非特异性反应，而且是端粒侵蚀的特定结果。我们和其他人(15,49,58)有人认为，一个或多个极短的端粒可能通过端粒结合蛋白的丢失而产生自由端，这实际上被视为双链断裂，从而通过与DNA损伤反应共享的途径向p53发出信号。我们的数据为这种模型提供了进一步的支持，尽管它们也表明所涉及的信号通路存在显著差异。
据我们所知，这里描述的这组变化也代表了对正常原始人类细胞DNA损伤后p53磷酸化的最全面研究，避免了先前存在的潜在混淆影响，未知的p53修饰信号，可能存在于先前用于此目的的大多数转化细胞系模型中(三,44,45,48,53).
致谢
我们感谢詹姆斯·史密斯（德克萨斯州休斯顿贝勒学院）为我们提供了人体成纤维细胞，感谢特蕾莎·金为我们准备了手稿。我们感谢朱莉娅·斯金纳提供表达hTERT的成纤维细胞。
我们感谢癌症研究运动的资助。
参考文献
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