老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2021年10月15日；13(19): 23096–23107.
周氏芪灵汤通过调节SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴抑制去势耐药前列腺癌的多西他赛耐药和糖酵解
曹洪文
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
王丹（Dan Wang）
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
孙鹏（音译）
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
陈雷（Lei Chen）
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
冯一耕
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
高仁杰
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
1中国上海中医药大学龙华医院泌尿外科一科，上海200032
通讯作者。*同等贡献
通信地址：陈雷；电子邮件：chenlei2114@shutcm.edu.cn
通信地址：冯一耕；电子邮件：fengyigeng2410@shutcm.edu.cn
通信地址：高仁杰；电子邮件：高人杰02254@shutcm.edu.cn
2021年7月21日收到；2021年9月20日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可协议（CC BY 3.0），它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。 摘要
一半去势耐受性前列腺癌（CRPC）患者出现多西他赛耐药，阻碍了其长期临床应用。本研究旨在探讨中药周氏芪灵汤对前列腺癌多西紫杉醇耐药的影响，并阐明其潜在的分子机制。在我们的研究中，芪灵显著降低多西他赛耐药（DR）CRPC细胞的存活率和集落形成，并增加其凋亡。齐灵处理的DR细胞表现出葡萄糖消耗、乳酸释放和丙酮酸生成减少。此外，lncRNA SNHG10在CRPC患者的DR组织中上调，并与无进展生存率呈负相关。生物信息学分析表明miR-1271-5p可能是与SNHG10结合的相关miRNA。miR-1271-5p上调显著降低DR细胞中SNHG10的荧光素酶活性。SNHG10敲除显著增加DR细胞miR1271-5p的表达。Targetscan预测TRIM66是miR-1271-5p的下游靶点之一。miR-1271-5p上调显著降低DR细胞中荧光素酶活性和TRIM66的表达。此外，SNHG10的敲除显著抑制了DR细胞中TRIM66的表达。此外，芪灵治疗降低DR细胞的SNHG10和TRIM66，同时增加miR1271-5p。综上所述，芪灵可能通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66途径抑制CRPC的多西紫杉醇抵抗和糖酵解。
关键词：前列腺癌，周氏芪灵汤，多西他赛耐药，华宝效应，SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66
简介
尽管近年来在治疗方面取得了巨大进展，前列腺癌仍是美国男性癌症相关死亡的主要原因之一[1]. 前列腺癌的进展在早期是雄激素依赖性的[2]雄激素剥夺疗法（ADT）是短期治疗晚期前列腺癌的最佳选择。而这些接受ADT治疗的患者中有50%会对ADT产生耐药性，最终导致转移性去势耐受性前列腺癌（CRPC）。目前，多西紫杉醇是转移性CRPC患者的一线化疗药物，而长期使用导致的多西紫杉醇耐药性阻碍了其临床应用[三,4]. 因此，有必要阐明多西紫杉醇耐药的机制，并开发有效的药物来消除CRPC患者的多西紫杉醇耐药。
能量代谢障碍通常发生在恶性肿瘤中[5]. 在物理条件下，细胞可以通过氧化磷酸化代谢葡萄糖。相反，癌细胞更喜欢通过将葡萄糖转化为乳酸（有氧糖酵解）来获得能量。这是一种被称为“Warburg效应”的现象，对癌细胞增殖和患者预后预测至关重要[6,7]. 这种效应也出现在前列腺癌细胞中[8——10].
长非编码RNA（lncRNAs）长期以来被认为是RNA聚合酶II的转录副产物，没有生物功能[11,12]. 近年来，lncRNAs被认为是癌症发病过程中分化、增殖、凋亡和转移的关键调节因子[13——15]. lncRNA和其他非编码RNA已成为肿瘤诊断和治疗的有前途的分子靶点。据报道，LncRNA SNHG10通过与骨肉瘤中相关miRNA的相互作用促进葡萄糖摄取[16]. 遗憾的是，SNHG10在癌症葡萄糖代谢中的生物学作用尚不清楚。我们小组之前发现，中药周氏芪灵汤通过负向调节TRIM66/HP1γ/AR轴抑制前列腺癌的发展[17]. 本研究旨在探讨芪灵是否影响多西紫杉醇抵抗和有氧糖酵解以及其潜在机制。
材料和方法
齐玲
“芪灵”由苦草（150克）、冬凌草（300克）、生黄芪（150克）、姜黄（90克）、补骨脂（150克）、熟地黄（150克）、益母草（150克）和加工甘草（90克）组成。将其在热水中煮沸3-4个小时，然后再倒入1L。
细胞培养
PC3和DU145是两种人类前列腺细胞系，购自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯市，美国）。细胞保存在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（Gibco）的RPMI-1640培养基中，37°C，5%CO2多西他赛耐药（DR）细胞系（PC3-DR和DU145-DR）是通过将单层培养的细胞暴露于递增浓度的多西他塞（溶解于DMSO中；美国密苏里州圣路易斯Sigma），按照上述方法成功建立的[18,19]. 建立的DR细胞在含有多西紫杉醇（10 nM）的培养基中定期培养。
临床样本
人体研究由上海中医药大学龙华医院批准。所有患者在手术前签署同意书。简言之，在前列腺切除术期间，从前列腺癌患者中收集了56个不含多西他赛（DR）和44个DR组织。
细胞存活分析
通过集落形成和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定确定细胞存活率。根据制造商的说明，使用相应的检测试剂盒（中国海门Beyotime）进行CCK-8检测。简言之，在48小时多西紫杉醇处理前24小时以5至400 nM的浓度接种等量的DR细胞。添加CCK-8试剂，孵育3 h以测量450 nm处的吸光度。对于集落形成分析，在用10 nM多西紫杉醇处理前24小时，每孔（在6孔板中）接种1000个细胞。培养10天后，用无菌磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，用4%多聚甲醛固定，然后用结晶紫染色。人工计数各组形成的菌落。
定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
使用TriZol试剂提取总RNA（Invitrogen，Waltham，MA，USA）。使用PrimeScript RT试剂（中国大连TaKaRa）进行cDNA转录。使用SYBR Green PCR试剂盒（TaKaRa）在ABI 7300系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆应用生物系统公司）上进行qRT-PCR。引物的使用如下（5′至3′）：SLC2A1型、ATTGGCTCCGTATCGAAC（正向）、GCTCAGATAGATCCAGGGTA（反向）；PFKP公司、CGCCTACCTCACACGACGTGGTG（正向）、ACCTCCAGAACGAGTCCC（反向）；PKM公司、ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA（正向）、TGGGTGTGAATCAATGTCCA（反向）；LDHA公司、ATGGCAACTAAAGGATCAGC（正向）、CCAACCAACACTGTAATCT（反向）；SNHG10系列、CCAGCTTAGATTCATTGATTCC（正向）、TTAAGTGCACCAGATGCTG（反向）；TRIM66系列，GCCCTTGTGCTACTTACTC（正向），GCTGGTTGGGTTACTCTC（反向）；miR-1271-5p，CAGCACTTGGCACTAGCA（正向），TATGGTGTTCCTCTCTCTC（反向）；6号机组，GCTTCGGCAGCACATATAAAAT（正向），CGCTTCACGAATTTGCGTCATAT（反向）；β-肌动蛋白、CGTCACTCCCTGCTTGCTG（正向）、GTACGCCAACACAGTGCTG。使用2-ΔΔCt方法6号机组作为miR-1271-5p的内部对照β-肌动蛋白对于其他基因。
蛋白质印迹
收集不同组的细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲液进行裂解。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶（10%）装载和分离等量的蛋白质，然后转移到聚偏氟乙烯膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。在室温下用牛血清白蛋白（5%）封闭2小时后，在4°C下用相应的一级抗体（检测TRIM66（1:1300；美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）和β-肌动蛋白（1:2400；美国加利福尼亚州圣克鲁斯）孵育细胞膜过夜。在室温下与相应的马萝卜过氧化物酶结合二级抗体（1:2500；美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯）孵育2小时后，使用ECL试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher）观察斑点。
细胞凋亡
通过检测DNA片段和caspase-3活性来评估细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性使用商用半胱氨酸蛋白酶3/7检测试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）进行测定。使用微板读取器（Berthold，Calmbacher，德国）检测发光。根据推荐说明，通过使用ELISA细胞死亡检测试剂盒（德国曼海姆罗氏）评估各组细胞质组蛋白相关DNA片段的水平，进行DNA片段分析。
葡萄糖消耗量、丙酮酸和乳酸生成量的测定
检测前测定不同组的细胞数。收集细胞，使用商业检测试剂盒（Sigma）分析丙酮酸水平。采集培养基，测量不同处理后的乳酸水平和葡萄糖。使用检测前测定的细胞数对乳酸生成或葡萄糖消耗进行标准化。
细胞转染
为了抑制SNHG10的表达，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）瞬时转染两种SNHG10-特异性siRNAs，即si-SNHG10-1（GCAACCGCTTTGTTAGTTAAT）和si-SNHG20-2（GCGCGCGATTCTCTAGA）或阴性对照（si-NC，ACATGACTGTCTAGT）。如前所述，通过将SNHG10的cDNA插入pcDNA3.1载体，通过转染pcNDA3.1/SNHG10载体，SNHG10-过度表达[20]. 商业miR-1271-5p模拟物和阴性对照物（miR-NC）由GeneWiz（中国苏州）提供。转染48小时后制备细胞裂解物以进行进一步分析。
RNA下拉分析
从SNHG10-敲除细胞中收集的裂解物与生物素化RNA探针孵育。miR-1271-5p序列被生物素化，带有生物素标记的无义RNA序列作为阴性对照。RT-qPCR检测靶RNA的富集情况。
荧光素酶报告试验
通过插入不同的野生型（WT）或突变型（MUT）序列构建荧光素酶报告质粒。靶序列如下：SNHG10-WT（正向）CCTTCTCGAGAGCCTCCATCCTACTGCTT，（反向）CCTTGCGGCCATTTGGAAGTTTAA；SNHG10-MUT（正向）CTGAGCAGCGGCGCGATCGCCC，（反向）GGCGATCCGCGCCGGCTCAG；TRIM66-WT，（正向）CCTTCTCGAGGAGCCAAAGGAGACTGGGC，（反向）CCTTGCGGCCTCTTGGTAAAGAAAGTGGTGTT；TRIM66-Mot（正向）CAGTGACTGCCCAGTTCCACAT，（反向）ATGTTGGAACTGGCAGTCACTG。上述质粒分别与阴性对照或miR-1271-5p模拟物共转染。使用萤光素酶报告基因测定法（Promega，Madison，WI，USA）测量萤光素酶活性。
统计分析
数据以平均值±标准偏差表示。除非另有规定，否则实验重复三次。使用SPSS 16.0进行统计分析，并使用Student’st吨-测试、单向、双向方差分析以及适当的事后测试。当第页数值小于0.05。
结果
齐灵损害多西他赛耐药性
如所示和PC3-DR细胞经多西紫杉醇处理48 h后，细胞存活率较高，该细胞系对多西紫杉醇的IC50值明显高于对照组。另一种细胞系DU145-DR的表现与PC3-DR相似(和). 在成功构建多西他赛耐药细胞株后，我们接下来应用芪灵治疗，观察其对多西他塞的反应是否会改变。在多西紫杉醇治疗的相同情况下，齐灵治疗的多西紫杉醇耐药细胞系的细胞活力显著降低，如和芪灵治疗后DR细胞系对多西他赛的IC50值显著降低(和). 与未经处理的对照细胞相比，在低剂量多西他赛的情况下，芪灵治疗组多西他xel-resistant细胞的集落也明显减少，这表明芪灵抑制了多西他塞耐药CRPC细胞的增殖(). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性和DNA片段分析显示，用多烯紫杉醇处理后，齐灵处理的多西他赛耐药细胞出现明显的凋亡水平(和). 总之，齐灵治疗的多西他赛耐药CRPC细胞在多西他赛治疗方案中表现出增殖减少和凋亡增加，表明齐灵增强了CRPC细胞对多西他塞的敏感性。
芪灵降低CRPC细胞对多西他赛的耐药性。(A类和B类)将亲代PC3细胞和DOC抗性对应物（PC3-DR）置于指定浓度的多西他赛（0-400 nM）中48小时，通过CCK-8测定多西他赛的细胞活力和IC50值。(C类和D类)将亲代DU145细胞和抗DOC的对应物（DU145-DR）置于指定浓度的多西紫杉醇（0-400 nM）下48 h，通过CCK-8分析测定细胞活力和多西紫杉醇的IC50值。(E类和F类)PC3-DR细胞在正常培养基（ctrl）或补充齐灵（QL-treaction）的培养基中培养48 h，用指定浓度的多西紫杉醇（0-400 nM）处理，通过CCK-8分析测定细胞活力和多西紫杉醇的IC50值。(G公司和H（H）)将DU145-DR细胞培养在正常培养基（ctrl）或补充齐灵（QL-treaction）的培养基中，用指定浓度的多西紫杉醇（0-400nM）处理48 h，通过CCK-8分析测定细胞活力和多西紫杉醇的IC50值。(我)集落形成实验显示，PC3-DR和DU145-DR细胞在正常培养基（ctrl）或添加齐灵（QL-treaction）的培养基中培养，并用多西紫杉醇（10nM）处理。(J型和K（K）)通过DNA片段化和Caspase-3活性测定，检测在正常培养基（ctrl）或补充齐灵（QL-treaction）的培养基中培养的PC3-DR和DU145-DR细胞在多西紫杉醇（10nM）治疗下的细胞凋亡。数值为平均值±SD。**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
芪灵调节CRPC细胞的Warburg效应
鉴于Warburg效应是肿瘤发生发展过程中的基本现象，我们推测芪灵可能影响前列腺癌细胞的糖酵解。正如预期的那样，与对照组相比，芪灵治疗显著降低了CRPC细胞的葡萄糖消耗、乳酸释放和丙酮酸生成(——). 同时，与对照组相比，芪灵治疗组糖酵解相关基因SLC2A1、PFKP、PKM和LDHA的表达显著下降(和). 这些发现符合我们的期望，即齐灵调节CRPC细胞的Warburg效应。
芪灵调节CRPC细胞的Warburg效应。相对葡萄糖消耗(A类)，丙酮酸浓度(B类)和乳酸生成(C类)在PC3-DR和DU145-DR细胞中进行评估。(D类和E类)用qRT-PCR检测PC3-DR和DU145-DR细胞糖酵解组分（SLC2A1、PFKP、PKM和LDHA）的mRNA水平。数值为平均值±标准差。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01.
芪灵抑制SNHG10并与CRPC的多西紫杉醇耐药性相关
值得注意的是，在最近的一份报告中，骨肉瘤中葡萄糖摄取增加和细胞增殖与lncRNA SNHG10增强相关[16]. 我们首先探讨了芪灵是否能影响CRPC细胞中SNHG10的表达。表明芪灵治疗后两种DR细胞株的SNHG10均显著下降，提示芪灵显著纠正了SNHG11表达异常增加在体外。第个结果，共个在体外实验表明，与相应的对应细胞系相比，这两种DR细胞系均表现出明显的SNHG10 mRNA表达增强(和). 然后我们假设SNHG10可能与CRPC细胞的耐药性有关。我们分析了临床诊断的前列腺癌患者无DR组织和DR组织中SNHG10的差异，结果表明，与无DR组织相比，DR组织显著增加(). 相关分析显示CRPC患者无进展生存率与SNHG10表达呈负相关(). 临床和在体外这些发现共同表明，SNHG10可能与CRPC细胞的多西紫杉醇耐药性有关，因为其在DR组织和DR细胞系中异常增加。
芪灵对SNHG10有抑制作用，并与CRPC的多西紫杉醇耐药性有关。(A类)用qRT-PCR检测PC3-DR和DU145-DR细胞中SNHG10的RNA水平。(B类和C类)采用qRT-PCR检测SNHG10在PC3和DU145细胞或其DOC耐药对应物（PC3-DR和DU145-DR）中的表达水平。(D类)采用qRT-PCR方法检测56例无多西他赛（DR-free）和44例DR患者组织中SNHG10的RNA水平。(E类)SNHG10表达与CRPC患者无进展生存期相关性的Kaplan-Meier分析。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
SNHG10通过海绵miR-1271-5p上调TRIM66
通过生物信息学分析探索SNHG10的下游基因。miR代码(http://www.mircode.org/mircode/)miR-1271-5p被预测为可能与SNHG10结合的miRNAs。另一个在线软件(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnanixid网站)用于预测可能与SNHG10结合的位点。还进行了位点突变(). 其次，miR-1271-5p转染显著降低了携带SNHG10-WT的DR细胞的荧光素酶活性，而当DR细胞携带SNHY10-Mut时，没有观察到明显的变化(和)，证明了SNHG10和miR-1271-5p之间的结合。SNHG10敲低使DR细胞中miR1271-5p的表达急剧增加，这表明SNHG10通过与CRPC细胞的结合负调控miR-1271-5p(和). 使用Target Scan预测miR-1271-5p的下游靶点，其中一个我们特别感兴趣的基因TRIM66就在其中(). 荧光素酶报告物分析表明，miR-1271-5p转染显著降低了PC3-DR和DU145-DR细胞中TRIM66-WT组而非TRIM66-MUT组的荧光素酶活性，揭示了miR-1271~5p与TRIM66的结合(和). 此外，miR-1271-5p转染显著降低了PC3-DR和DU145-DR细胞中TRIM66的mRNA和蛋白表达，表明miR-1271-5p对TRIM66的负调控(和). SNHG10的敲除显著降低了两种DR细胞株中TRIM66的表达(和)提示SNHG10对CRPC细胞中TRIM66的正向调节。总之，SNHG10通过海绵miR-1271-5p上调TRIM66的表达，以阻断其对TRIM66负调控，这可能是CRPC细胞多西他赛耐药的分子机制。
SNHG10通过海绵miR-1271-5p上调TRIM66。(A类)SNHG10中的miR-1271-5p结合位点和位点突变。(B类和C类)PC3-DR和DU145-DR细胞中的荧光素酶活性。(D类和E类)用qRT-PCR检测转染抗SNHG10（si-SNHG10-1和si-SNHG20-2）或阴性对照siRNAs（si-NC）的PC3-DR和DU145-DR细胞中SNHG10-miR-1271-5p的RNA水平。(F类)TRIM66 3'UTR中的miR-1271-5p结合位点和位点突变。(G公司和H（H）)PC3-DR和DU145-DR细胞中的相对荧光素酶活性。(我和J型)用qRT-PCR和Western blot检测转染miR-1271-5p模拟物或模拟物阴性对照（miR-NC）的PC3-DR和DU145-DR细胞中TRIM66的mRNA和蛋白水平。(K（K）和L（左）)通过qRT-PCR和Western blot检测转染抗SNHG10 siRNAs（si-SNHG10-1和si-SNHG20-2）或阴性对照siRNA（si-NC）的PC3-DR和DU145-DR细胞中TRIM66的mRNA和蛋白水平。数值为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01.
芪灵通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴抑制CRPC细胞多西紫杉醇抵抗和糖酵解
将两株DR细胞株分别分为对照+载体（ctrl+载体）、齐灵治疗+载体（QL-治疗+载体）和QL-治疗+SNHG10-OE组。芪灵治疗显著降低DR细胞SNHG10和TRIM66的表达，同时增加miR-1271-5p(和). 而SNHG10的过度表达显著纠正了齐灵治疗引起DR细胞上述三个因子的变化，进一步验证了SNHG11在该轴的上游位置。这些发现表明，芪灵影响DR细胞中SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴的表达，SNHG10过度表达可以纠正芪灵对该轴的影响。该轴下游因子TRIM66的蛋白水平变化与各组的mRNA表达谱一致(). SNHG10的过度表达也将DR细胞的存活率、IC50至DOC的降低以及芪灵治疗诱导的集落形成调节至对照水平(——)这表明SNHG10在抑制芪灵对CRPC细胞的作用中发挥了关键作用。和QL-treaction+SNHG10-OE组DR细胞caspase-3活性和DNA片段水平下降，表明SNHG10在芪灵促进CRPC细胞凋亡中起关键作用。在芪灵处理的DR细胞中，葡萄糖摄取、乳酸释放、丙酮酸产生紊乱以及糖酵解相关基因表达减少，也通过SNHG10过表达几乎被修饰到对照水平(——). 结合上述SNHG10作为上游因子并通过海绵miR-1271-5p降低TRIM66的研究结果，可以得出结论：芪灵通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴抑制CRPC细胞的多西紫杉醇抵抗和糖酵解。
芪灵通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴抑制CRPC细胞的多西紫杉醇抵抗和糖酵解。(A类——我)用空载体转染PC3-DR和DU145-DR细胞并在正常培养基中培养（ctrl+载体），用空载体转染并在补充有芪灵的培养基中培养（QL处理+载体），或用SNHG10过表达质粒转染并在补充有芪灵的培养基中培养（QL处理+SNGG10-OE）。(A类和B类)用qRT-PCR检测SNHG10、miR-1271-5p和TRIM66的RNA水平。(C类)蛋白质印迹法测定TRIM66蛋白水平。(D类——G公司)采用CCK-8法和集落形成法测定细胞活力和多西紫杉醇的IC50值。(H（H）和我)细胞凋亡采用Caspase-3活性测定和DNA片段分析。(J型——N个)用空载体转染PC3和DU145细胞，并在正常培养基（ctrl+载体）中培养，用空载体进行转染，并在补充齐灵（QL-treaction+载体）的培养基中培养，或用SNHG10过表达质粒转染，然后在补充齐陵（QL-traction+SNHG10-OE）的培养液中培养。相对葡萄糖消耗(J型)，丙酮酸浓度(K（K）)和乳酸生成(L（左）)在PC3和DU145细胞中进行了评估(M（M）和N个)用qRT-PCR检测PC3和DU145细胞糖酵解组分（SLC2A1、PFKP、PKM和LDHA）的mRNA水平。数值为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
讨论
在这项研究中，我们发现芪灵损害了多西紫杉醇抵抗并调节了CRPC细胞的Warburg效应。LncRNA SNHG10在DR组织中上调，与患者生存率呈负相关。SNHG10通过海绵miR-1271-5p上调TRIM66，这可能是CRPC细胞对多西他赛耐药的分子基础。最后，我们发现芪灵可能通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66轴抑制CRPC的多西紫杉醇抵抗和糖酵解。
当临床医生为晚期癌症患者制定治疗策略时，化疗耐药性是主要关注点之一，并最终导致癌症进展和不良预后[21]. 近年来，据报道，从中药中提取的化合物是一种新佐剂，可以通过抑制增殖、促进凋亡以及调节癌细胞代谢来降低甚至逆转耐药性[22]. Zou J等人指出，人参皂苷Rg3抑制吉西他滨耐药胰腺癌细胞的生长并促进细胞凋亡[23]. Yang L等人证明，Oblongifolin C通过下调Src来削弱吉西他滨诱导的胰腺癌耐药[24]. Wang X等人证明了蜂毒素通过下调胆固醇途径逆转胰腺导管腺癌细胞对吉西他滨的耐药性[25]. 最近的一项研究指出，扶正抑瘤汤增强了多西紫杉醇在CRPC小鼠模型中的抗癌疗效[26]. 同样，我们发现芪灵汤显著降低了CRPC细胞对多西紫杉醇的耐药性在体外.
以有氧糖酵解增强为特征的Warburg效应是癌细胞的重要生化特征，意味着癌细胞对葡萄糖的依赖性[27]. Warburg效应与肿瘤的发生有关，在化疗耐药的发展中起着关键作用[28]. 据报道，许多中药可以使耐药癌细胞对化疗药物重新敏感。黄芩素，一种从黄芩据报道，其通过抑制胃癌细胞的糖酵解来逆转低氧诱导的5-氟尿嘧啶抵抗[29]. 在本研究中，我们发现芪灵汤显著抑制CRPC细胞的Warburg效应，这可以合理地将芪灵逆转多西紫杉醇耐药性与降低Warburk效应联系起来。
SNHG10作为肝癌中过度表达的致癌lncRNA发挥作用，并积极调节致癌和转移[30]. 据报道，SNHG10通过增加miR-218的甲基化参与骨肉瘤的葡萄糖代谢[16]. 然而，SNHG10在前列腺癌中的作用尚未被提及。在本研究中，我们发现SNHG10在多西他赛耐药的CRPC组织中上调，并与低存活率相关，这丰富了SNHG10-上调预测预后不良的发现[30]. 生物信息学分析提出与SNHG10相关的候选miRNA，即miR-1271-5p，在被环状RNA circMBOAT2海绵化后也参与前列腺癌的进展[31]. 我们之前证明TRIM66促进前列腺癌细胞的恶性行为，包括增殖、迁移和侵袭[32]. 最近，我们还描述了齐灵对TRIM66/HP1γ/AR轴的负调控[17]. 本研究一方面重新验证了齐灵对TRIM66的负调控作用，并进一步探讨了齐灵调控TRIM66上游因子。我们研究中的发现尚未得到证实体内我们还将进行动物实验，以使我们的发现在未来更加可靠。
结论
总之，芪灵通过SNHG10/miR-1271-5p/TRIM66途径抑制CRPC的多西他赛耐药和糖酵解。本研究首次揭示了芪灵对CRPC细胞多西他赛耐药和糖酵解的抑制作用。此外，本研究揭示了芪灵对前列腺癌的抗肿瘤活性，为其他中药的化疗和化疗敏感性研究提供了实验依据。
脚注
贡献者作者贡献：曹洪文、王丹、孙鹏、陈雷、冯一耕、高仁杰进行了实验，收集了数据，并撰写了手稿；曹洪文、王丹、孙鹏对数据进行了分析；陈雷、冯一耕、高仁杰构思了这项研究；陈雷监督了这项研究。
利益冲突：作者声明没有与本研究相关的利益冲突。
基金：本研究由上海市科学技术委员会上海市自然科学基金项目（19ZR1458200）资助；国家自然科学基金面上项目（82174199）；上海市卫生委员会中医药研究专项（2020JQ002）；上海中医药大学龙华医院国家中医临床研究基地龙医学者（苗圃计划）（LYTD-56）；上海中医药大学龙华医院第三批青年中文姓名培训项目（RC-2017-01-14）。
参考文献
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