哺乳动物端粒的长度由体内平衡机制控制。端粒具有特定物种的长度设置(26)尽管生殖系中的端粒酶活性很高，但这一点在几代人中都是不变的(47). 例如小家鼠保持在20至50kb，而密切相关的小鼠物种马斯普雷图斯端粒束长度更接近人类端粒，通常为5至15kb。同样，尽管端粒酶水平很高，但许多人类肿瘤细胞系的端粒并不生长，而是稳定地维持在每个细胞系的设定特征上(12,13,44). 当通过将端粒DNA的短片段转染到培养细胞中产生新的端粒时，端粒长度稳态也很明显。被转染的端粒束可能被端粒酶拉长，直到其长度与转染细胞中的其他端粒相匹配(三,23,43). 新的端粒可能会招募端粒结合蛋白，从而实现端粒的所有功能，包括特定细胞的长度调节特征。在这种情况下观察到的单个端粒的调节生长表明，细胞可以测量和调节单个染色体末端的端粒重复序列的长度，这意味着顺式-代理监管机制。
人类端粒含有两种相关的TTAGGG重复序列结合因子，即TRF1和TRF2(7,10,11). 这两种TRF蛋白在其羧基末端都有一个Myb样的螺旋-转螺旋结构域和一个中央保守结构域，其中包括负责形成同型二聚体的序列。这两种蛋白质没有异源二聚体，它们在N端有显著差异，在TRF1中为酸性，而在TRF2中为碱性(10). TRF1和-2在其Myb型DNA结合结构域（56%的同一性）中关系最为密切，并且这两种蛋白质都可以在体外结合双链端粒DNA。TRF1的DNA结合位点由两个相同的YTAGGTTR半位点组成，每个半位点与TRF1同源二聚体中的一个Myb结构域结合，由配体的系统进化指数富集（SELEX）确定(6). 两个半站点之间的距离没有限制，站点可以直接或反向绑定。TRF1具有架构特性，包括能够在两个半站点之间循环序列(6)以及配对两个端粒束的能力(20). 尽管TRF2在体外对双重TTAGGG重复序列表现出类似的偏好(4,10)，其DNA结合特征尚未详细确定。
在人类细胞中，TRF1和TRF2主要位于染色体末端，在那里它们有助于保护和维持端粒DNA。TRF1已被证明调节端粒长度(44). 在四环素应答的人类纤维肉瘤细胞系HTC75中TRF1的过度表达导致端粒长度以约10 bp/群体倍增（PD）的速率逐渐下降。相反，TRF1显性负等位基因的表达会将内源性TRF1从端粒中移除，从而导致端粒伸长。在这个系统中，TRF1不影响细胞提取物中可检测到的端粒酶活性，表明TRF1不全面影响细胞中端粒酶的活性。相反，我们建议TRF1在顺式作为每个端粒的负长度调节器。根据目前的模型，端粒长度不当会招募大量的TRF1蛋白，阻止端粒酶介导的特定染色体末端的伸长，从而导致端粒长度的重置顺式提出了一个类似的蛋白质计数模型，用于酵母中端粒长度的动态平衡(31).
一个重要的问题是，沿着端粒长度结合的TRF1如何调节端粒酶，端粒酶是一种作用于端粒末端的酶。在这种情况下可以考虑的一种机制是，端粒末端或其附近存在TRF1会降低端粒酶DNA末端的可及性。最近发现端粒向后折叠，形成一个称为t环的大的双重套索，由此提出了另一个建议(21). 在t环中，TTAGGG重复序列的3′单链端粒重叠部分被折叠在端粒重复序列的双重部分。t环被提议用于将端粒从可能作用于染色体末端的活动中隔离出来，包括端粒酶。体外研究表明，端粒酶需要一个可接近的3′末端(28,30,46)，一种预计在t循环中不存在的结构。因此，t环可以控制端粒酶在单个染色体末端的作用。基于生化研究，t环的形成被认为涉及TRF1和TRF2。TRF1具有诱导双端粒DNA弯曲、环状和配对的能力(5,6,20,21)，能够促进端粒折叠的活动。TRF2可诱导3′单链TTAGGG重复序列尾侵入双端粒DNA，在体外形成t环(21; R.Stansel、T.de Lange和J.D.Griffith，未发表数据）。因此，基于t环的端粒长度调节机制可以预测TRF1和TRF2都是人类端粒长度稳态所必需的。具体来说，该模型预测，与TRF1一样，TRF2也是端粒长度的负调节因子。
TRF2在端粒长度调节中的作用不容易通过抑制其功能来检测。对TRF2活性的干扰会立即导致有害的表型，这可能是由于未折叠的端粒末端不适当地暴露于DNA损伤检查点和修复活动所致。例如，被迫表达TRF2显性负等位基因的细胞迅速启动凋亡途径(24)而缺失TRF2的端粒失去其3′末端并进行共价融合(45; A.Smogorzewska和T.de Lange，未公布数据）。因此，我们研究了TRF2通过全长蛋白的过度表达在端粒长度调节中的作用。结果表明，TRF2是哺乳动物细胞端粒长度的第二个负调控因子，与基于t环的端粒长度稳态机制相一致。
材料和方法
细胞系。
四个克隆HTC75细胞系（P4、P7、P12和P33）表达来自四环素抑制启动子的全长TRF2(45). 两个表达TRF1（TRF1）N末端FLAG标记缺失等位基因的HTC75衍生克隆细胞系（J3和J24）66-439)通过pTetFLAGhTRF1的共转染产生66-439带有新霉素抗性标记的质粒。TRF1的诱导表达66-439用FLAG特异性M2单克隆抗体（Kodak）对24个独立克隆进行间接免疫荧光和免疫印迹试验，这些克隆是在含有400μg/ml G418的培养基中筛选出来的(44). 细胞在添加了我-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、非必需氨基酸、10%牛犊血清（HyClone）和潮霉素（90μg/ml）或G418（150μg/ml）。每隔一周轮换一次药物。当细胞达到80%的汇合时，以1:16传代。未诱导和诱导细胞与强力霉素（Sigma，100 ng/ml）平行生长。来自仓鼠细胞系AHL-1（ATCC CCL 195）、BHK-21（ATCC CC CCL 8544）和CHO-K1（ATCC CCL 61）的细胞在上述补充的DMEM中生长。
全细胞提取物。
在直径为10厘米的培养皿中生长的细胞通过刮取5毫升冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）收集，并在1000×克将细胞颗粒重新悬浮在4至6体积（50至200μl）的冰镇缓冲液C（20 mM HEPES-KOH[PH7.9]、420 mM KCl、25%甘油、0.1 mM EDTA、5 mM MgCl）中5分钟2，1 mM二硫苏糖醇[DTT]，0.5 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，0.2%Nonide P-40，1μg leupeptin，pepstatin和抑肽酶/ml），在冰上培养30分钟，在14000×克温度为4°C。将上清液与缓冲液D（20 mM HEPES-KOH[pH7.9]、100 mM KCl、20%甘油、0.2 mM EDTA、0.2 mM EGTA、0.5 mM DTT和0.5 mM PMSF）在4°C下透析2 h，在液氮中速冻，并在−80°C下储存。以牛血清白蛋白为标准，使用Bradford试验（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad）测定蛋白质浓度。
蛋白质印迹。
蛋白质（30μg）在十二烷基硫酸钠（SDS）–9%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过电印迹转移至硝化纤维素。用胭脂红S对膜进行染色，以验证在每个泳道中分离出等量的蛋白质。在含有10%脱脂奶粉和0.5%吐温20的PBS中封闭30分钟后，用抗TRF2抗体508或647或抗TRF1抗体371在4°C下培养斑点12至16小时(44,45; X.-D.Zhu和T.de Lange，未公开数据）或抗细胞周期素D抗体（Santa Cruz），然后在含有0.1%脱脂奶粉和0.1%吐温20的PBS中清洗三次。用辣根过氧化物酶结合的驴抗兔抗体（用于508、647和371）或羊抗鼠抗体（用于细胞周期蛋白D）（Amersham）将斑点培养45分钟，并清洗三次，持续10分钟。使用ECL试剂盒（Amersham）检测二级抗体。
基因组印迹。
从一个直径为15厘米的次级分流培养皿（约10个7细胞）进行胰蛋白酶化，在冷PBS中洗涤，并在1000×克，细胞颗粒在−80°C下冷冻。按照描述分离DNA(15)加入核糖核酸酶A消化步骤，用Hin公司fI和南非兰特一、 并使用Hoechst 33258通过荧光测定法进行定量。在0.7%琼脂糖凝胶中，在0.5×三硼酸盐-EDTA（TBE）中对3微克DNA进行大小分级。如前所述，处理凝胶进行基因组印迹，用TTAGGG探针检测端粒限制片段(14). 在用PhosphorImager扫描后，通过使用ImageQuant软件确定端粒限制性片段的中位长度(44).
TRF1的瞬时表达66-439.
对数生长的HeLa 1.2.11细胞（1070.8 ml HBS[21 mM HEPES，pH 7.05，137 mM NaCl，0.7 mM NaHPO中的细胞4分别用7.5μg pTetFLAGhTRF1电穿孔（960μF/320 mV）66-439和tTA-表达载体pUHD15-1(19)细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高压灭菌盖玻片上生长24小时，然后进行间接免疫荧光处理。
中期扩散的FISH。
将仓鼠细胞与每毫升生长培养基0.5μg秋水仙碱在37°C下孵育30分钟。通过胰蛋白酶法收集细胞，并在37°C下0.075 M KCl中孵育7分钟。随后，将细胞固定在甲醇-乙酸（3:1）中，并将其放在水润湿的载玻片上。如前所述进行荧光原位杂交（FISH）(27)与0.5μg异硫氰酸荧光素结合（C三助教2)三每毫升肽核酸（PNA）探针（Biotech BmpbH）。将细胞包埋在含有90%甘油和10%PBS的混合物中，其中含有1mg第页-每毫升苯二胺（Sigma）和每毫升0.2μg 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）。
免疫荧光和显微镜检查。
标记为TRF1的FLAG66-439用抗FLAG单克隆抗体M2（Sigma）检测，用抗体371C2检测内源性全长TRF1(44)，并使用抗体508检测内源性TRF2(45). M2用异硫氰酸荧光素结合羊抗鼠抗体（Jackson）检测，371C2和508用四甲基罗丹明-异氰酸酯结合驴抗兔抗体（Jacxson）检测。二级抗体没有交叉反应，如省略任一一级抗体的对照实验所示。DNA用DAPI复染。仓鼠、HeLal.211和HeLall细胞端粒上的内源性TRF1和TRF2(39,45)分别使用亲和纯化的兔多克隆抗体371和647进行平行检测(44; X.-D.Zhu和T.de Lange，未发表数据）和四甲基罗丹明-异氰酸酯结合驴抗兔二级抗体（Jackson）。为了分析长和短HeLa端粒上TRF1和TRF2的相对丰度，所有照片的曝光时间为1.0 s，图像显示时没有改变设置。照片是用安装在蔡司Axioplan2显微镜上的Photometrix SenSyn相机拍摄的，该显微镜带有IPLab软件（Scanalytics，Inc.）。
RNA分离。
按所述分离总RNA(2). 简言之，将细胞在PBS中洗涤，在3M LiCl-6M尿素中裂解，超声处理，并在冰上孵育6小时。通过以14000×克在4°C下用蛋白酶K（50μg/ml）在200μl含有10 mM Tris-HCl[pH7.5]、10 mM EDTA、100 mM NaCl和1%SDS的溶液中处理20分钟，在37°C下处理10分钟，用酚氯异戊醇（24:24:1）萃取，并在0.2 M醋酸钠（pH5.5）存在下用异丙醇沉淀。
RNase保护。
hTERT序列是从pCl-Neo-hEST2-HA（R.a.Weinberg的礼物）中亚克隆的(32)进入pcDNA3（Invitrogen）。纯化了一个包含部分hTERT序列（核苷酸[nt]3229至3452）和侧翼载体序列的Styl片段，并将其用于含有5μlα-32P] UTP（800 Ci/mmol，10 mCi/ml）。hTR RNase保护探针的模板同样通过消化pGRN78制备(25)带有Xba公司一、 β-actin探针取自Ambion。通过用冷UTP稀释放射性标记的UTP，β-actin探针的比活性比hTERT和hTR探针低200倍。使用来自直接保护裂解物核糖核酸酶保护检测试剂盒（Ambion）的溶液进行RNase保护反应，其中含有20μg总RNA（如上所述分离），而不是细胞裂解物。
人类端粒酶的部分纯化。
HeLa细胞核提取物(16)对照缓冲液A-100进行透析（20 mM HEPES[pH7.9]，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，10%甘油，100 mM KCl，0.5 mM PMSF，0.5 mM-DTT），并应用于精胺琼脂糖柱（Sigma）。用250mM KCl和缓冲液A中的500mM KCl清洗柱。用含有1M KCl的缓冲液A洗脱端粒酶活性。将活性组分合并，对照缓冲液A-100进行透析，并加载到在缓冲液A-100中平衡的肝素Cl-6B柱（法玛西亚）上。用含有220 mM KCl的缓冲液A清洗柱，用500 mM KCl分步洗脱活性端粒酶。将活性组分合并，如上所述进行透析，并应用于MonoQ快速蛋白质液相色谱柱（Pharmacia），与缓冲液a-100平衡。用含有300 mM KCl的缓冲液A洗涤柱，并在缓冲液A中以0.3到1 M盐的线性梯度洗脱端粒酶。活性端粒酶的峰在500 mM KCl洗脱。汇集的活性组分显示出特定的端粒酶活性比传统端粒酶分析测定的输入物质高100倍(34).
端粒酶反应。
在含有25 mM醋酸三钠（pH 8.2）、50 mM醋酸钠（pH 8.3）、1 mM氯化镁的溶液中进行端粒酶反应2、1 mM EGTA、5 mM dATP、5 mM-dTTP、4.5μM冷dGTP、0.165至0.825μM标记dGTP（1至5μl的[α32P] dGTP，3000 Ci/mmol，10 mCi/ml；NEN）、0.1μl RNasin和1 mM亚精胺（可选），体积为20μl，通常使用1至2μl端粒酶组分。引物浓度为10 nM。杆状病毒表达的TRF1或TRF2蛋白(5,17)或牛血清白蛋白（BSA）作为对照，在室温下与DNA在端粒酶反应缓冲液中孵育30分钟。随后，添加端粒酶组分，并在30°C下培养反应1 h，然后通过添加20μl h停止反应2O和50μl的10 mM Tris（pH 8.0）、5 mM EDTA和0.1 mg RNase/ml，并在45°C下培养10分钟。然后，添加50μl 10 mM Tris（pH值8.0）和含有0.3 mg蛋白酶K/ml的1%十二烷基硫酸钠，并将样品在45°C下培养10 min。样品用200μl苯酚-氯仿-异戊醇提取，并通过加入50μl 3M乙酸钠（pH 5.2）、2.5μg tRNA和500μl乙醇沉淀，并在冰上培养15分钟。样品在室温下离心10分钟，去除乙醇。将颗粒溶解在4μl甲酰胺负载染料中，并将全部或一半样品加载到6%聚丙烯酰胺（19:1丙烯酰胺-双丙烯酰胺）凝胶上，该凝胶含有7 M尿素和20%（体积/体积）甲酰胺（1×TBE）。凝胶在40至55 W，约50至60°C外部温度下运行。在聚丙烯酰胺-7 M尿素凝胶上对寡核苷酸进行凝胶纯化，并在含有10 mM Tris（pH 7.5）、1 mM EDTA和100 mM NaCl的溶液中通过煮沸5分钟和从80°C缓慢冷却（几个小时以上）至室温进行退火。
使用末端标记的DNA进行凝胶位移分析，以监测TRF1和TRF2与端粒酶底物的结合。结合条件与端粒酶分析完全相同，只是省略了脱氧核苷三磷酸。样品在0.6%琼脂糖、0.1×TBE、130 V下运行约45分钟(4).
结果
TRF2影响端粒长度。
为了解决TRF2在端粒长度调节中的作用，我们在人类纤维肉瘤细胞系HTC75中使用了一个先前建立的四环素诱导表达系统(45). 虽然HTC75细胞表达端粒酶，但其端粒的长度稳定地维持在一个部分受TRF1调控的环境中(44). TRF1的过度表达导致端粒DNA的逐渐和进行性丢失。这里我们探讨TRF2长期过度表达的影响。建立了四个克隆细胞系（称为P系），通过去除生长介质中的多西环素可以诱导表达高水平的TRF2。对这些细胞的初步短期（9天）分析显示，由于TRF2表达增加，没有显著的表型(45)而同一研究记录了TRF2的两个截短等位基因对细胞增殖的快速抑制。P细胞系的长期生长使我们能够评估TRF2表达升高对端粒稳态长度的影响。
细胞系在培养基中加入或不加入强力霉素维持124个PDs，并通过基因组印迹法评估其端粒长度。除了一个例外（P4），细胞系显示出一致的端粒长度变化，这依赖于TRF2诱导（图。). P4细胞系的端粒长度出现了意料之外的波动，这与培养基中强力霉素的存在无关（数据未显示）。其他三种P细胞系显示出一种复杂的双相端粒长度变化模式，以响应TRF2水平的增加。在P7细胞系中，当TRF2被诱导时，端粒最初以每PD 82 bp的速度缩短（计算从PD 0到PD 28的生长期）（图。A） 。出乎意料的是，在PD 48左右，端粒的动力学发生了变化。在培养的这一点上，端粒变长，在PD 88时达到最初的长度。在整个实验过程中，非诱导培养物的端粒长度相对稳定。在P33细胞系中也观察到类似的事件过程，其中端粒长度的初始下降为每PD 47 bp（生长窗口，PD 0至PD 40），随后端粒适度伸长，开始于PD 72。第三细胞系（P12）在TRF2诱导后的前8个PD中，端粒缩短率为51 bp/PD，随后端粒长度迅速增加，最终长度设置超过起始值（数据未显示）。总的来说，TRF2的过度表达导致了端粒长度的最初下降，并在端粒伸长后最终停止这种下降。这些结果表明，TRF2和TRF1一样，影响端粒的维持。
TRF2的过度表达导致端粒缩短。（A） 将两个表达TRF2的HTC75细胞系（P7和P33）在含有（非诱导）或不含（诱导）多西环素的培养基中培养124 PD，并在指定的PD处分离基因组DNAHin公司fI和南非兰特一、 在琼脂糖凝胶上进行大小分级，并进行印迹。使用端粒特异性TTAGGG重复探针检测端粒限制性片段。凝胶左侧显示了分子量标准。端粒缩短和生长的时期在这些车道下面被强调。（B） 诱导和非诱导条件下P7和P33细胞中TRF2表达的免疫印迹分析。在等量（30μg）全细胞提取蛋白的免疫印迹中用抗体508检测TRF2。在这些条件下，内源性TRF2低于检测限。
复杂的端粒动力学与TRF2表达缺失相关。
虽然P细胞系中端粒长度变化的双相性出乎意料，但三个独立细胞系中的端粒动力学模式相似，这一事实表明，这种表型是诱导HTC75细胞表达高水平TRF2的固有特性。为了进一步了解这种表型的分子基础，我们分析了TRF2的表达水平。免疫印迹显示，尽管外源TRF2蛋白的初始表达非常高，但随着PD的增加，每个细胞系中TRF2的水平都下降（图。B、 比较诱导状态下PDs 8和124的车道）（P12未显示数据）。通过Western分析检测到的稳态TRF2蛋白水平的下降是由于表达TRF2的细胞数量减少，以及从免疫荧光染色推断出的单个细胞的表达水平减少。例如，免疫荧光染色阳性细胞的百分比从PD2时的100%下降到PD48时的0%（P12），从PD2的100%下降至PD76时的21%（P7）。
先前有报道称，在转染细胞的长期生长过程中，转染基因的表达缺失，通常归因于转基因的从头甲基化。然而，与同一系统中TRF1的稳定表达相比，TRF2表达的快速丢失（见下文）表明，下调TRF2的表达可能会赋予细胞选择性优势。在这方面，我们注意到诱导培养物含有许多核形态异常的细胞（多叶核）（数据未显示）。畸变核的出现往往与TRF2表达的丢失相一致。我们还注意到，每种诱导培养物的生长都比未诱导的对照慢一些。例如，对照组在大约40天后达到PD40，而诱导培养组在4天后达到。虽然我们无法确定核形态的改变是否与表达TRF2的细胞逐渐消失有关，但结果与TRF2过度表达（可能与端粒缩短有关）抑制细胞生长的可能性一致。
全长TRF1和TRF1的长期过度表达66-439.
在过度表达TRF2的细胞中观察到的复杂端粒动力学以及对高水平TRF2明显的选择，提出了一个问题，即在长期过度表达TRF1期间是否会发生类似事件。先前对几个全长TRF1过度表达的HTC75细胞株的分析表明，端粒逐渐进行性缩短，转染的TRF1基因没有受到抑制(44). 然而，对这些细胞系的初步分析并没有提供有关端粒广泛缩短后事件的信息。因此，分析过度表达TRF1的细胞端粒的长期动力学是相关的。
为此，我们选择了一个克隆表达TRF1的细胞系D4，并对其端粒长度进行了304PD以上的监测。A、 该细胞系显示先前记录的端粒逐渐缩短，这种缩短持续到大约1.5 kb的端粒DNA丢失（PD 200）。在那个阶段，端粒长度变得稳定，当培养物再生长100 PD时，没有观察到进一步的变化。没有观察到对生长速度的总体影响，并且TRF1表达没有改变（数据未显示）。事实上，TRF1的过度表达是维持端粒稳定、短、长的必要条件，正如在生长介质中添加强力霉素时观察到的端粒快速延长所示（图。A） ●●●●。
全长TRF1和TRF1的长期过度表达66-439导致端粒进行性缩短。（A） TRF1过度表达导致端粒在短时间内的稳定。D4，一种在缺乏强力霉素的情况下过度表达TRF1的HTC75细胞系(44)在诱导条件下维持304PD，通过基因组印迹法测定端粒长度，如图所示。图中表示诱导生长期间端粒长度的平均值（填充圆圈）。在PD 208，将多西环素添加到平行培养物中，并在非诱导条件下监测端粒长度的变化（开圈）。（B） 1号机房66-439定位于端粒，在那里它取代TRF1而不是TRF2。1号机房66-439转染HeLal.2.11细胞，用抗FLAG抗体M2间接免疫荧光法测定其亚细胞定位。该TRF1等位基因对内源性TRF1的影响是用针对TRF1 N末端的抗体（371C2；右上图）测定的，该抗体不检测TRF166-439突变体。用抗体508（右下面板）评估TRF2的亚核定位。箭头表示转染细胞。（C） 1号机房66-439诱导端粒进行性缩短。J24，一种表达TRF1的HTC75细胞系66-439，在诱导和非诱导条件下保持，端粒长度的变化如图图例所示进行评估。答：。
此外，我们还没有发现缺乏NH的TRF1蛋白过度表达的有害影响2-末端酸性结构域（TRF166-439). 这种截短的蛋白质定位于端粒，如间接免疫荧光所示（图。B、 左面板），并用TRF1酸性结构域（371C2）特异性抗体降低免疫荧光信号，从而将全长内源性TRF1蛋白从端粒中移除(44)（图。B、 右上面板）。TRF1过度表达66-439与之前的结果一致，对端粒上TRF2的相对丰度只有中等影响(45)（图。B、 右下面板）。正如全长TRF1所观察到的那样，表达TRF1的细胞66-439端粒逐渐缩短。在图。C、 在124个PD中，每PD下降11 bp，而第二个细胞系（J3）的端粒缩短更快（44 bp/PD）（数据未显示）。这两种细胞株均未表现出在TRF2过度表达细胞株中观察到的复杂端粒动力学。因此，端粒的双相动力学和转基因表达的快速消失似乎只与TRF2的过表达有关。
染色体末端TRF1和TRF2的积累与端粒长度相关。
与高水平TRF2表达相关的端粒缩短表型表明该因子在端粒长度内稳态中发挥作用。与TRF1类似的一种可能性是，TRF2通过与双端粒重复序列结合来测量端粒长度。事实上，根据带移分析，TRF2与双端粒重复序列结合(4,10). 然而，电子显微镜分析表明，当TRF2与t环结构中的端粒DNA相关时，它优先位于t环连接处或附近，而不是沿着端粒束(21). TRF1没有观察到这种对t环连接的偏爱，即使DNA处于t环结构，TRF1也显示出与双端粒DNA的广泛结合。因此，有必要确定TRF2是否能在体内与双链端粒DNA结合，或者这种蛋白质在染色体末端的存在是否反映了对端粒结构特征的偏好。
我们通过询问TRF2是否与染色体内部位点的端粒序列相关来解决这个问题。这种情况是由某些仓鼠染色体所代表的，这些染色体具有与其着丝粒相关的端粒重复DNA序列。与TTAGGG重复序列相关的着丝粒周围卫星序列存在于叙利亚仓鼠细胞系BHK-21和中国仓鼠细胞株CHO-K1的多条染色体中，但不存在于亚美尼亚仓鼠细胞系统AHL-1的任何染色体中(1,33)（图。). 由于TRF2高度保守(10)，我们能够用针对人类TRF2氨基末端肽（508）的多克隆抗体检测叙利亚、亚美尼亚和中国仓鼠细胞中的TRF2(45)（图。A） 。通过在BHK和AHL细胞的中期染色体上使用该抗体进行间接免疫荧光，我们检测到了先前在其他哺乳动物中观察到的TRF2的预期端粒染色模式。此外，一些BHK染色体显示出显著的TRF2中心周围信号。使用第二个独立的多克隆抗体（647）（X.-D.Zhu和T.de Lange，未发表数据）在CHO染色体上进行间接免疫荧光，进一步证实了TRF2在着丝粒周围部位的染色体内部积累（图。B） ●●●●。AHL细胞中没有这种间质信号，这与这些细胞中缺乏广泛的中心周围端粒相关DNA一致。这些数据表明，TRF2具有与染色体内部端粒相关序列结合的能力，表明TRF2的结合并不依赖于t环结构中的DNA。与TRF1保守性差一致(9)，我们无法用针对全长人类TRF1的多克隆抗体或针对小鼠TRF1肽的多克隆疫苗检测仓鼠TRF1。然而，人TRF1转染BHK细胞表明，TRF1和TRF2一样，可以定位于端粒相关序列的间质部位（数据未显示）。
TRF2可以与间质端粒重复序列结合。（A） HeLall细胞和三个仓鼠细胞系（BHK-21、CHO-K1和AHL-1）的全细胞提取物的免疫印迹显示TRF2的表达。用抗体508检测TRF2。杆状病毒衍生人类TRF2（Bac-hTRF2）蛋白用作阳性对照(4). （B） BHK-21和CHO-K1染色体中TRF2的间质结合。左图：利用PNA探针对所示仓鼠细胞系的中期染色体进行TTAGGG重复序列的FISH分析。箭头表示一些BHK和CHO染色体具有显著的间质端粒相关序列。右侧面板：TRF2抗体508或647的间接免疫荧光（如图所示）。箭头突出显示BHK和CHO染色体中心间质部位的TRF2。在AHL细胞中未观察到间质TTAGGG信号或TRF2的染色体内结合。DNA用DAPI染色。
如果TRF1和TRF2在端粒上的结合主要发生在端粒的双重部分，那么可以预计较长的端粒会吸收更多的蛋白质。相反，如果TRF2与t环的结构特征特异性结合，或者通常需要与DNA末端接近才能结合，则其在单个端粒的丰度不应取决于其长度。因此，我们比较了两个紧密相关的HeLa亚克隆中的TRF1和TRF2免疫荧光信号，这两个亚克隆在端粒重复束长度方面存在差异。HeLal.211的端粒约为15至40kb(21)而HeLall的端粒较短，从3到6.5 kb不等（中位数为6 kb）(39). 通过免疫印迹法（图。A） 。端粒较短的细胞中TRF1和TRF2的丰度稍高。
人类长端粒上TRF1和TRF2的相对丰度更高。（A） 免疫印迹显示TRF1和TRF2在两种端粒长度不同的HeLa细胞株的全细胞提取物中的表达。用抗体371检测TRF1；用抗体647检测TRF2。Cyclin D用作加载控制。在前两个通道中，装载来自相同数量细胞的蛋白质。根据蛋白质量（30μg）对第二个通道进行标准化。（B） 在两个具有指定端粒长度的HeLa细胞系中TRF1和TRF2的间接免疫荧光信号。两种细胞系的免疫荧光染色并行进行，处理相同，图像显示无需任何调整。对于细胞系和抗体的每一种组合，细胞核都有两个放大倍数。DNA用DAPI染色。
间接免疫荧光法检测间期端粒TRF1和TRF2的明显丰度。我们选择在间期细胞中解决这个问题，因为较高水平的中期染色质浓缩可能导致错误的染色强度。为了检测TRF1，我们使用了一种亲和纯化的多克隆抗体（371C2），该抗体对N-末端酸性结构域具有特异性（参考文献44和数据未显示）。同样，为了检测TRF2，我们使用了一种亲和纯化的多克隆血清，该血清针对全长TRF2（647），对TRF2高度特异（X.-D.Zhu和T.de Lange，未发表的数据）。使用这些血清，我们平行检查了两个HeLa细胞系，并在完全相同的条件和设置下捕获和复制了免疫荧光图像（图。B） ●●●●。将端粒点的强度与TRF1特异性371C2血清进行比较，发现两种HeLa细胞系之间存在明显差异。端粒较长的细胞（HeLal.2.11）显示出点状图案，通常比端粒较短的细胞更明显（HeLall）。虽然无法对免疫荧光信号进行直接定量解释，但其强度差异非常明显，且具有高度的重现性。同样，与端粒较短的细胞相比，其他端粒较长的细胞系在我们的TRF1血清中产生了更明亮的点状图案（数据未显示）。当对细胞进行TRF2染色时，也发现长端粒与短端粒的免疫荧光强度存在显著差异（图。B） ●●●●。尽管TRF2染色通常会导致较高的总体核质信号，但点状免疫荧光信号强度与端粒长度之间的相关性仍然很明显。此外，在AHL细胞中，仓鼠中期染色体端粒处的TRF2信号更大，与其他两个仓鼠细胞系相比，AHL细胞在染色体末端的TTAGGG重复次数更多（图。B） ●●●●。这些结果表明，TRF1和TRF2与端粒的双重部分结合，它们在染色体末端的积累受端粒重复束长度的影响。
体外缺乏TRF1和TRF2对端粒酶的直接作用。
先前的研究表明，TRF1和TRF2的过度表达或抑制不会影响端粒酶的表达水平，正如用表达全长或截短蛋白的细胞株提取物进行的半定量TRAP分析所检测到的那样(44,45). 同样，在过度表达TRF2的细胞中，我们也未能检测到hTERT mRNA或端粒酶hTR成分表达水平的变化（图。A） 。我们也未能通过免疫沉淀或甘油梯度检测到端粒酶和TRF1之间的关联，杆状病毒产生的TRF1蛋白的添加在TRAP分析中没有影响端粒酶活性（数据未显示）。最后，在永生化人类细胞系中，TRF1或TRF2的表达与端粒酶活性的表达之间没有相关性（数据未显示）。
TRF1和TRF2对端粒酶缺乏直接作用。（A） TRF2的过度表达不会影响hTERT mRNA或hTR RNA的表达。用强力霉素诱导9天后，从指示的HTC75细胞系中制备总RNA。进行RNase保护试验以确定hTERT mRNA和hTR RNA的相对丰度。β-肌动蛋白作为对照（如材料和方法中所述）。（B） 面板C中使用的端粒酶底物示意图。SB2包含TRF1和TRF2的最佳结合位点。TS不绑定TRF1或TRF2。（C） TRF1和TRF2对端粒酶体外活性缺乏影响。用TS分析部分纯化的人类端粒酶（见材料和方法）(25,35)或SB2作为底物，在存在过量杆状病毒衍生的TRF1和TRF2的情况下，或BSA作为对照。该试验使用[α-32P] dGTP转化为端粒酶产物（常规测定）。星号表示SB2底物的标记形式，仅在杆状病毒衍生蛋白存在时才能观察到。
如果TRF1和TRF2对端粒长度的调节发生在顺式.一个顺式-其作用机制可能是含有TRF蛋白的端粒不是端粒酶的最佳底物。因此，我们开发了一个体外系统来测试TRF1或TRF2在3′DNA末端附近的存在是否影响端粒酶在该末端的作用。该系统使用的DNA是TRF1和TRF2的结合底物，也可以作为端粒酶介导的TTAGGG重复序列添加的引物。该DNA称为SB2，是一种折回型寡核苷酸，其序列GGTT的3′末端位于具有最佳TRF1结合位点的双链片段两侧（TTAGGGTTAGTTAG[4，6]）（图。B） ●●●●。使用适用于端粒酶测定的缓冲液建立SB2底物被TRF1或TRF2蛋白饱和的条件（数据未显示）。同时，用TS进行对照反应，TS是端粒酶的单链最佳底物(25,35)缺少TRF1和-2的站点。在存在或不存在TRF1或-2（分别为50 nM TRF1和35 nM TRF2）的情况下，将HeLa细胞中部分纯化的端粒酶与TS或SB2孵育，条件是发现端粒酶活性与引物浓度近似线性相关（数据未显示）。端粒酶的酶活性通过掺入[32P-α]dGTP进入端粒酶产物的典型6-nt阶梯（图。C） 。我们设计了一个生态RI位点进入SB2的双链部分，使我们能够验证端粒酶添加的TTAGGG重复到正确折叠的底物。事实上，端粒酶产物的断裂生态RI和变性凝胶上随后的粒径分级表明，产品阶梯预计下降约40 nt（数据未显示）。
当将TRF1或TRF2蛋白添加到以TS为底物的端粒酶反应中时，未发现对标记前体的整体结合或产物的大小分布有任何影响（图。C） 。这一结果与在TRAP分析中添加TRF1对端粒酶活性没有影响的观察结果一致。同样，当SB2用作底物时，无论是否存在饱和量的TRF1或TRF2，产物看起来都是相同的（BSA用作对照）。因为延伸产物分布在凝胶上的大范围分子量上，并且由于未合并的[32P-α]dGTP，未尝试定量端粒酶产物。然而，重复实验(n个=7）允许我们排除在这些条件下端粒蛋白对端粒酶活性的主要影响。实验之间只观察到微小的变化。两个悬液，5′GTTAGGGTT3′和5′GGTT3′，在试验中进行了测试，结果相同。在存在25倍以上的TRF1和TRF2（1.25μM TRF1和0.877μM TRF2）的情况下也进行端粒酶分析。尽管在这些条件下结果显示出更大的可变性，可能是因为蛋白质聚集，但没有观察到任何一种蛋白质对端粒酶的明显影响（数据未显示）。因此，在这些条件下，TRF1或TRF2在端粒酶底物位点附近的结合不会干扰酶活性。我们的实验没有解决其他问题顺式-作用机制，我们不能在此阶段排除TRF1或TRF2影响端粒长度维持反式通过影响端粒酶以外的限制因素。
讨论
端粒酶对人类端粒的维持是由体内平衡机制调节的。此前，TRF1被鉴定为负反馈环的一个组成部分，它限制端粒的伸长并导致稳定的端粒长度。在这里，我们报道了相关端粒结合蛋白TRF2的过度表达也会导致端粒缩短，这表明TRF2是端粒长度的第二个负调控因子。最简单的解释是TRF1和TRF2都沿着双端粒重复序列的长度结合，并具有测量端粒长度的功能。我们一致发现，这两种蛋白质在体内都与双链端粒DNA结合，并且它们在端粒的积累依赖于端粒长度。
TRF1和TRF2相对于端粒长度调节的蛋白质计数模型。
我们的观察结果可以在端粒长度调节的蛋白质计数模型的背景下进行解释(31,40,44). 根据这个模型，端粒可以以两种状态存在，一种是允许端粒酶延长端粒的“开放”状态，另一种是酶无法访问或延长端粒末端的“封闭”状态。这两种状态之间的转换被认为是由人类细胞中的端粒结合蛋白TRF1和TRF2控制的，它们通过促进闭合状态发挥负调控作用。当端粒被端粒酶拉长时，它们将结合更多的负调控因子，增加转换到闭合状态的机会。在转换到闭合状态后，端粒将随着每个细胞分裂而逐渐失去序列，从而导致较少数量的结合负调控因子，并提高了转换回开放状态的机会。因此，每个端粒将接近由端粒酶活性、TRF1和TRF2的表达水平以及其他调节因子（例如tankyrase）决定的稳态长度[42]).
在此对该模型的几个预测进行了测试。首先，该模型预测，负调控因子是沿着端粒的双重部分结合的蛋白质。尽管先前的结果表明TRF1和TRF2与人类和小鼠端粒相关，但无法区分它们与端粒的双重部分或端粒结构的其他特征（例如端粒末端或t环的结构成分）的结合。通过使用间接免疫荧光，我们发现TRF2与端粒相关序列结合，这些序列出现在一些仓鼠染色体的染色体内部位点。假设这些间质序列以双链DNA的形式存在，这一结果表明TRF2可以在体内与双链TTAGGG重复域结合。间接证据表明，TRF1也与间质端粒DNA结合。
该模型的第二个预测是，TRF1和TRF2在端粒的积累反映了双端粒束的长度。事实上，端粒较长的细胞对这两种蛋白都有更强烈的免疫荧光信号。虽然无法对免疫荧光信号进行直接定量解释，但数据与蛋白质计数模型预测的端粒越长，吸引更多TRF1和TRF2的观点一致。
根据蛋白质计数模型，很短的端粒不能结合足够数量的TRF1或TRF2来创建闭合状态。在此阶段，端粒将再次伸长，防止端粒DNA的完全丢失，并导致端粒在短时间内的稳定。这种情况与本文中关于TRF1长期过度表达的数据一致。在端粒缩短的初始阶段后，尽管TRF1水平仍然很高，但端粒仍稳定在缩短的长度上。事实上，TRF1的过度表达继续决定着短长度的设置，正如外源性TRF1被抑制后端粒快速伸长所证明的那样。总之，HTC75细胞中的端粒动力学响应TRF1和TRF2水平的变化，与这两种蛋白质在端粒长度调节的蛋白质计数模式中作为端粒长度负调节器的功能一致。
TRF1和TRF2调节端粒长度的可能机制。
端粒长度调节的蛋白质计数模型没有定义开放和闭合状态的性质，也没有指定TRF1和TRF2通过什么机制影响这些状态之间的转换。该模型唯一具体的预测是事件发生在顺式调节单个染色体末端端粒酶的作用。与此预测一致，我们发现无论是端粒酶组分的表达还是酶的整体活性都不受TRF1或TRF2表达变化的影响。当这些因子位于底物的3′端或附近时，我们也没有发现TRF1或TRF2对端粒酶的直接影响。
最近对人类端粒结构的研究表明，t环可能代表闭合构象。在t环中，端粒末端隐藏在双端粒重复序列中，因此端粒酶很可能无法访问。TRF2可以在体外将端粒DNA重塑为t环，TRF1具有多种生物化学活性，有望促进t环的形成，这表明这两种蛋白都有助于端粒在体内重塑为t循环。目前的数据与这一建议一致，因为TRF1和TRF2都是端粒长度的负调控因子，如果这两种蛋白都促进了闭合t环状态的形成，这一点是可以预料的。
根据目前的数据，新出现的观点是，长端粒吸收更多的TRF1和TRF2。这些蛋白质在较长的端粒上的丰度更高，有助于端粒重塑为t环。在t环状态下，端粒酶将不再能够拉长端粒末端，导致细胞分裂序列丢失。最终，这种序列丢失将导致TRF1和TRF2与端粒的结合减少，从而以较低的速率（或降低的频率）形成t环。由此产生的未折叠端粒（端粒酶的底物）（暂时性）持续存在，将再次导致端粒伸长。通过评估TRF1和TRF2如何调节体内t环的形成，以及通过研究体内外端粒酶与t环的相互作用，可以测试该模型。
酵母中端粒稳态的比较。
酵母中出现了端粒长度控制的综合观点酿酒酵母遗传、分子遗传和生物化学方法揭示了端粒染色质组分（包括Rap1p、Rif1p、Rif2p和Cdc13p）之间的相互作用，反式-作用因子（如端粒酶[Est2p/TLC1]）、端粒染色质相关蛋白（Est1p和Est3p）以及其他介质，如Ku、Rad50-Mre11-Xrs2复合物(8,36,38)、Tel1p和Stn1p（有关审查，请参阅参考资料37和41). 相比之下，哺乳动物端粒长度稳态的分离尚处于初级阶段，只有少数参与者可用，其中大多数与酵母基因没有相似性。例如，TRF1和TRF2在Myb型DNA结合折叠外与Rap1p缺乏显著同源性。然而，出现了一个强烈的共同主题，即两个系统中都可能涉及蛋白质计数机制(31,44). 确定酵母和哺乳动物中的端粒复合体之间可能存在的结构相似性，特别是在t环的存在方面，将是很有意义的。在这方面，Li和Lustig(29)提出了一种结合链侵入的瞬时环回机制的有趣可能性，以解释他们在酵母端粒上观察到的快速缺失。从端粒沉默的研究中发现了有利于酵母t环的其他线索（参考文献综述22)Rap1p和TRF2在与端粒环相关的生化活动中表现出有趣的相似性(17,18,21). 对单细胞和多细胞生物体端粒长度动态平衡的进一步平行分析应揭示这一常见调控问题解决方案的多样性。
