多发性骨髓瘤的微小残留病：现状

摘要

背景

多发性骨髓瘤（MM）是一种以恶性浆细胞在骨髓中积聚为特征的血液系统癌症[1]. 在过去的几十年里，自体干细胞移植（ASCT）、蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物的使用革命性地延长了MM患者的总生存期（OS）[2——5]. 最近，新型药物的批准，如CD38靶向抗体和XPO1抑制剂，在MM诊所为患者提供了额外的有益选择[6——10]. 然而，即使疾病管理有了显著改善，MM仍然无法治愈。大多数MM患者（如果不是全部）在治疗后复发[11]. 多轮治疗和复发导致难治性疾病和患者死亡。

越来越多的MM患者通过使用新型药物和联合治疗获得了深度缓解和良好的预后。MM治疗的这种新趋势要求更新治疗效果评估系统[12]. 例如，MM完全缓解（CR）的现行指南包括“血清和尿液免疫固定阴性，软组织浆细胞瘤酶消失，骨髓抽吸物中的浆细胞少于5%”[13]. 通过这种CR评估，尽管一半以上的新诊断MM患者可以实现CR，但大约68%的患者在2年内复发[14]. 为了进一步提高疾病评估的效率，IMWG在2016年将最小残留疾病（MRD）评估作为额外的反应评估[15].

微小残留病（MRD）是指治疗后存活的少量癌细胞。早在20世纪80年代末，MRD一词就被引入MM诊所，以评估治疗效果[16]. 历史上，MM MRD是通过免疫组织化学检测的，这种方法只能模糊地测量患者骨髓活检中残留的浆细胞[17]. 1993年，一个英国小组报告了异基因骨髓移植后MM患者的基于PCR-的MRD检查[18]. 1999年，免疫表型流式细胞术用于MM MRD检测[19]. 根据2016年国际骨髓瘤工作组（IMWG）的定义，骨髓瘤MRD是指完全缓解（CR）患者中极低水平的癌细胞持续存在或重新融合，至少10例患者中约有1个肿瘤细胞⁵正常骨髓细胞[15]. 技术进步旨在为MRD评估提供高度敏感的方法。

MM MRD的临床意义早已被认识；治疗后持续的MRD表明肿瘤细胞尚未完全根除，预计不久就会复发。2008年，一个西班牙团队表明，在ASCT之后，MRD⁺与MRD相比，MM患者的无进展生存期（PFS）和OS较差⁻病人[20]. 到目前为止，独立研究都表明，MRD阴性在各种MM治疗方案中是一个优越的预后因素[21——23]. 令我们惊讶的是，有数百篇与MM MRD研究相关的文章，只有不到五篇论文研究了MM MRD生物学，如突变、细胞遗传学畸变、基因表达特征和细胞信号。因此，在简要回顾MM MRD的临床意义和检测方法的基础上，我们主要关注我们目前对MM MRD生物学的认识。利用有限但开创性的数据，我们对MM MRD的生物学特性进行了概述。

骨髓瘤MRD评估方法

MRD评估的目的是以高灵敏度检测残留肿瘤细胞。目前，还没有标准的MRD检测方法。IMWG建议髓内或髓外MRD检测[15]. 对于髓内MRD检测，来自患者骨髓愿望的细胞接受不同的检测方法，包括等位基因特异性寡核苷酸定量聚合酶链反应（ASO-qPCR）、多参数流式细胞术（MFC）、下一代流式细胞仪（NGF）或下一代测序（NGS）[24——36]. 根据IMWG 2016年的建议，MRD阴性是指在至少10个背景中未检测到癌细胞⁵骨髓外MRD检测主要基于成像技术，如正电子发射断层扫描和计算机断层扫描¹⁸F-脱氧葡萄糖（FEG-PET/CT）或磁共振成像（MRI）[37——40]. 表中总结了每种MRD检测方法的优缺点1一般来说，对于评估敏感性，NGS或NGF>MFC>ASO-qPCR，而对于适用性，MFC或NGF>NGS>ASO-qPCR。ASO-qPCR需要诊断样本来识别患者特异性克隆型序列，以进行引物指定。因此，ASO-qPCR的适用性较低。

在过去的几年里，MRD检测技术得到了快速发展，在灵敏度和适用性方面都有了很大的提高。NGS正在成为MRD检测的重要方法，以指导个体化治疗。在基于NGS的MRD评估中，对IgH/IgK/IgL基因座进行测序，以捕获残留MM细胞中Ig基因的重新排列。NGS数据可以进一步解释，以确定MRD阶段的亚克隆、克隆进化和克隆潮[24,25,41]. MM MRD评估的另一个趋势是结合NGF、NGS和PET-CT进行MRD综合检测[42,43]. 由于MM在BM中呈局灶性分布，因此有可能在BM抽吸中未获得病变组织。此外，一些患者在治疗后可能出现髓外残留浆细胞。全身成像，如PET-CT或MRI，能够捕捉到这些残留疾病。最近的一项研究表明，全身弥散加权MRI（WB-DWI-MRI）可能比FDG PET-CT提供更好的MRD评估[44]. 随着此类功能成像技术的可用性，精确评估骨和其他器官MM病变的反应也变得可行。因此，由MFC或NGS确定的髓内MRD阴性，加上髓外WB-DWI-MRI或PET-CT阴性，可以为深度缓解提供更准确的评估。值得注意的是，许多用于MRD评估的新技术，例如矩阵辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-TOF MS）方法[45]、液相色谱-质谱（LC-MS）方法[46]循环无细胞DNA（cfDNA）[47]和单细胞RNA测序（scRNA-seq）[48]目前正在实验室和临床前阶段进行研究。这些新技术可能会在未来显著改变MM MRD评估。

骨髓瘤MRD的临床意义

MM治疗后病情缓解的深度与疾病的预后密切相关[32]. 因此，MRD状态为CR MM患者提供了补充的预后分层。一系列研究[20,32,42,49——64]显示MRD阴性与MM的PFS和OS延长呈正相关（表2). 表的纳入标准2数据为关键词为“最小残留疾病”、“多发性骨髓瘤”和“总体生存率”的出版物，而排除标准为1）meta分析和综述的结果；2） 研究人群少于100人；3） 无生存数据；4） 未报告危险比（HR）或结果无统计学意义。基于MM治疗结果的MRD状态的紧密相关性，IMWG建议对所有达到CR的MM患者进行MRD测试[15]. MRD检测的敏感性影响MRD的预后价值[32]. 用更敏感的方法测定MRD阴性，如NGF或NGS，比用较不敏感的方法（如四色MFC）测定的MRD阴性对预后的预测更好[65]. MRD与其他MM预后因素之间的相关性很复杂，需要更多的研究。新诊断的MM按照修订的国际分期系统（R-ISS）分层为高危（HR）或标准风险（STR）。基于血清β2-微球蛋白和血清白蛋白的国际分期系统（ISS）于2005年发布，用于MM患者的诊断分层[66]. R-ISS以ISS为基础，添加了遗传风险因素和乳酸脱氢酶（LDH）水平，以实现比ISS更准确的MM患者预后分层[67] . 在一项回顾性临床研究中，R-ISS I组、R-ISS II组和R-ISS III组的5年OS发生率分别为82、62和40%[67]. 总的来说，与HR-MM相比，R-ISS分层STR-MM具有更好的OS和PFS[42,65,68,69]. 然而，MRD阴性克服了HR感染MM的不良生存结果；MRD的时间推进（TTP）、OS和PFS⁻HR-MM与STR-MM相似[65,68]. 此外，MRD⁺STR-MM患者获得比MRD更好的OS⁻人力资源经理[42,43,65,68]. 最后，不同的研究表明，只要达到MRD⁻状态，治疗臂很少对MM PFS有影响[54,70]. 总之，这些临床数据可能表明，不仅MRD状态，而且MRD的生物学特征，如MRD的细胞遗传学畸变，都会影响MRD后阶段MM的进展。由于认识到MRD在MM中的重要性，FDA发布了一项指南，帮助赞助商在新药应用的临床试验中使用MRD作为生物标记物，并促进血液肿瘤治疗药物和生物产品的营销[71]. 因此，建议阐述MRD阳性状态在MRD阴性特征之外的意义。

最近，许多临床试验已经将MRD阴性率作为测量结果的读数。具体地说，MRD是标准可评估终点之一，在设计涉及单克隆抗体治疗和移植的临床试验时是必须的。许多临床试验将MRD作为主要终点，并将MRD阴性率的改善作为MM药物批准的替代终点[43]. 使用MRD作为替代终点使研究人员能够在相对较短的时间内获得临床试验结果，从而加快了MM新药的批准。

骨髓瘤MRD的突变和细胞遗传学特征

MM MRD的细胞遗传学特征在很大程度上尚不清楚。2020年，一个中国小组首次报道了包括MM MRD在内的细胞遗传学研究[72]. 他们回顾性分析了193例MM患者，这些患者在诊断时至少有一种细胞遗传学异常（CA），并在4-6个疗程后达到PR或以上。用MFC检测残余浆细胞，用间期荧光原位杂交（iFISH）检测浆细胞的细胞遗传学畸变。根据他们的数据，从诊断到MRD，MM表现出不同的细胞遗传学动态模式，包括获得新的CA或某些CA成为优势，不同先前存在的CA的不平衡下降，不同先前已经存在的CA均匀下降，不变的CA模式，以及CA丢失（无法检测）。大约34%的分析患者属于前两个CA动力学组，这两个组被认为是治疗诱导的克隆选择，而其他患者从诊断到MRD的细胞遗传学已经改善或稳定。MRD阶段未进行克隆选择的患者的TTP比进行克隆选择者长，这种关联忽略了HR-CA对诊断的影响。该组没有显示MRD阶段HR-CA是否与较差的患者预后相关。但MRD中未检测到CA的患者具有更好的OS。总之，他们提供了MRD阶段克隆进化的证据。从诊断到MRD的细胞遗传学改变动态与患者的预后相关。

最近，西班牙小组发表了另一项MM MRD研究，包括突变和基因表达谱[73]. 在这项研究中，MRD状态由NGF测定，剩余的浆细胞被分类，以便随后进行分析。对40例配对患者进行全基因组测序，检测诊断MM细胞和MRD的突变情况。与CA动力学一样，他们的数据也表明，从诊断MM到MRD的突变和拷贝数改变（CNA）表现出不同的变化模式。诊断性HR-MM在治疗后可能在残留浆细胞中获得新的突变，而可操作的突变，如KRAS和BRAF，在MRD阶段仍然持续存在。相比之下，许多STR-MM在治疗后降低了MRD细胞的突变负荷和CNA。作者提出基因组不稳定性可能有助于获得HR-MM的新突变。总的来说，结果支持MM的诊断风险分层预测MRD的细胞遗传学和突变特征。

骨髓瘤MRD基因表达谱

很少有研究调查MM MRD的基因表达谱（GEP）。2015年，Paino等人报道了一项关于MM克隆异质性的研究[74]. 他们通过MFC免疫表型检查了10个MRD样本，并通过计算生成了23个标记基因表达谱。他们的工作表明，从诊断阶段到MRD，肿瘤细胞表现出标记基因表达的改变。2016年血液出版物报道了第一次MM MRD的基因组研究[68]. 在研究中，MRD由MFC测定。用微阵列检测7对配对患者的血浆细胞、诊断MM和MRD肿瘤细胞的GEP。从诊断到MRD，大约1300个基因（倍数变化0.1-2.7）受到差异调节。在这些基因中，作者发现MRD中活化的白细胞粘附分子（ALCAM）下调可能导致MRD耐药。ALCAM是一种与CD6相互作用的粘附分子，可介导细胞间粘附和迁移[75,76]. 药物治疗诱导的ALCAM^低RPMI-8226细胞在体外的积累。值得注意的是，患有ALCAM的患者^低MM有优越的OS。因此，他们通过MRD细胞分析鉴定了MM中的功能基因。

2021年，又一次血液该出版物使用RNA测序分析了诊断MM细胞和MRD肿瘤细胞[73]. MRD来源于HR-MM(N个=14）和STR-MM(N个=26）表现出不同的GEP特征和途径富集。从诊断浆细胞到MRD肿瘤，STR-MM组的差异调节基因数量是HR-MM组的两倍。在STR-MM组与HR-MM组中，只有少数基因（不到20%）被确定为MRD诊断过程中常见的解除调控基因。此外，通路富集分析表明，STR-MM组与HR-MM组中解除调控的基因属于不同的细胞信号通路。活性氧（ROS）途径在HR-MM基因集中特异性富集。因此，即使对于具有相同治疗反应的患者，CR、诊断HR-MM和STR-MM也可能有不同的演变模式。

上述两个GEP数据集为我们提供了MRD前景的宝贵原始数据。对这些数据的分析表明了MRD监管的一些有趣方面，以及数据和方法的局限性（数据访问和分析在补充信息). 首先，诊断性MM和MRD MM细胞具有多样的基因表达模式。在两个数据集的维数降低后，我们发现一些MRD模块中的基因表达值是多样化的（图1A） ●●●●。研究数据血液2016年[68]基因表达模式的变化比血液2021年[73]. 多种原因可能会导致这种差异。由于前一份出版物只包含了七个配对样本，没有进行风险分层，我们不知道这两项研究在诊断时是否与患者特征相匹配。值得注意的是，这两个数据集中的患者接受了不同的治疗方案。第一项研究中的患者接受VMP（硼替佐米、美芬、泼尼松）或VMP加Rd.（来那度胺和地塞米松）方案，而第二项研究中患者接受VRD、自体干细胞移植（ASCT）、美芬方案。不同的药物可能会对MM细胞产生不同的选择应激，导致具有不同GEP改变的MRD。最后，这两项研究使用了不同的方法进行基因表达谱分析；前者使用微阵列，后者使用RNA测序。其次，在两个数据集中，从诊断到MRD的差异调节基因只有少量的共同基因（图1B） ●●●●。我们假设这两个数据集中的共同基因可能包含MRD生成和功能的核心基因改变。因此，我们使用共同差异调节基因进行KEGG途径富集。从诊断到MRD（图1C） ●●●●。这些通路表明了细胞代谢和肿瘤微环境在MRD发展中的潜在作用。需要进一步的证据来验证结果。

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图1

多发性骨髓瘤MRD的Omics数据分析。A类使用降维{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE70398”，“term_id”：“70398“}}通用电气70398（7个配对样本）和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE147165”，“term_id”：“147165”}}GSE147165（40个配对样本）数据集；B类维恩图，第页<0.05，两个数据集的logFC>1；C类KEGG途径富集

未来展望

越来越多的证据表明，MRD评估比传统的基于反应的评估更准确地评估MM的预后。MRD的临床意义表明了MRD生物学在MM进展中的重要性。我们在本文中回顾的研究进一步表明，从诊断到MRD的动力学也具有临床意义。MRD细胞是在抗MM治疗后存活下来的耐药肿瘤细胞。MRD细胞是如何逃避治疗的，目前尚不清楚。克隆选择和进化发生在疾病的MRD阶段。在一定程度上，基因改变和转录调控都会导致MRD耐药性。MRD生物学研究，尤其是HR-MM-衍生MRD的研究，是揭示MRD耐药性的迫切需要，也是发展MRD靶向治疗的基础。此外，研究不同疗法的MRD可能会很有趣，这些MRD是否具有相同的遗传特征和GEP。答案可能表明了筛选MRD的机制。此外，不同治疗后MRD阳性率可能表明不同药物筛选耐药MRD细胞的能力。最后，研究导致MM进展的MRD阴性后阶段的分子基础是另一个有趣的话题。严格治疗结束后残留的肿瘤细胞表现如何？什么是根除残留肿瘤细胞的合适方法，什么时候是合适的时间？

在MM中开展MRD的基础研究有很多困难。首先，MRD肿瘤细胞的数量太少，无法用大多数实验方法进行研究。出于伦理考虑，禁止大规模收集MM患者的MRD细胞。有限的MRD组学数据可能会受到偏差和错误结果的影响。其次，MM缺乏用于MRD研究的体外和体内研究模型。MRD是一小部分患者经治疗诱导克隆选择后存活下来的耐药MM细胞。目前使用的MM细胞系和MM小鼠模型很难模拟MRD的异质性。特别是，在实验环境中无法再现诊断MM到MRD的动力学。第三，MRD相关基因研究的策略可能需要重新考虑。盈亏模型广泛用于癌症细胞系和动物模型中基因功能的研究。此外，基因表达的相关性，通常在诊断和预后阶段之间，是一个强有力的指标，表明该基因在MM发病机制或治疗反应中发挥一定作用。然而，由于我们对多发性骨髓瘤MRD的认识才刚刚开始，我们还不知道在该病MRD阶段的所有关键参与者是否在整个疾病过程中表现出恒定的功能。基于盈亏实验的MM细胞系可能无法反映残留肿瘤细胞内的真正调控。

结论

MRD是MM治疗的关键阶段，在此期间，患者的耐药肿瘤细胞数量最少。MRD状态和诊断到MRD转变的动力学对MM有预测价值。从诊断到MRT，肿瘤细胞内的大量基因表达和信号通路发生改变。每个个体都可能产生不同的诊断-MRD转换动态模式。克隆进化可能发生在MM的MRD阶段，并与较差的长期预后相关。诊断风险分层影响疾病的MRD阶段；高危和标准风险MM衍生的MRD可能具有多种基因表达谱。

关于MRD的许多问题仍然没有答案。更多的探索性实验将有助于演示MM MRD。

补充信息

致谢

缩写

作者的贡献

YZ和LZ选择了课题并设计了研究。HD进行了基于数据的分析。YZ、HD和LZ准备了手稿。作者阅读并批准了最终稿。

基金

本研究得到了国家自然科学基金项目Y.Z.（81870157号和82070219号）和四川大学教师创业基金的资助；国家自然科学基金（No.81800207）和四川省卫生委员会（No.18PJ357）资助J.H。

数据和材料的可用性

不适用。

声明

脚注

参与者信息

李章，电子邮件：nc.ude.ucs@ilgnahz公司。

郑玉环，电子邮件：nc.ude.ucs@nauhuygnehz。

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