Deciphering genes associated with diffuse large B-cell lymphoma with lymphomatous effusions: A mutational accumulation scoring approach

Sina Abdollahi; Seyedeh Zahra Dehghanian; Liang-Yi Hung; Shiang-Jie Yang; Dao-Peng Chen; L. Jeffrey Medeiros; Jung-Hsien Chiang; Kung-Chao Chang

doi:10.1186/s40364-021-00330-8

生物标记研究。2021; 9: 74.

2021年10月9日在线发布。数字对象标识：10.1186/s40364-021-00330-8号

预防性维修识别码：项目管理委员会8504051

PMID：34635181

解读与弥漫性大B细胞淋巴瘤伴淋巴瘤积液相关的基因：一种突变累积评分方法

西纳·阿卜杜拉希,¹ Seyedeh Zahra Dehghanian公司,^#² 梁一鸿,^#^三，^4,^5,^6,⁷ Shiang-Jie Yang先生,^#⁸ 陈道鹏,^#⁹ L.杰弗里·梅德罗斯,¹⁰ 蒋正贤（Jung-Hsien Chiang）,^1,¹¹和龚超常^12,^13,^14,¹⁵

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关联数据

补充资料: 附加文件1。
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数据可用性声明: 支持本研究结果的数据可向相应作者索取。WES数据可在国家生物技术信息中心获得(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov网站/)。

摘要

介绍

早期研究表明，弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的淋巴瘤性渗出与预后极差相关，甚至比非渗出相关性IV期患者的预后更差。我们假设某些基因异常与淋巴瘤渗出有关，这将有助于确定相关通路、致癌机制和治疗靶点。

方法

我们比较了涉及实体器官（n=22）和涉及积液（n=9）的DLBCL样本的全基因组测序。我们设计了一种基于突变累积的方法来对每个基因进行评分，并使用突变解释程序来识别与淋巴瘤渗出相关的候选致病基因。此外，我们从流出相关与非流出相关DLBCL病例的微阵列比较中进行了基因集富集分析，以提取相关通路。

结果

我们发现，在基于渗出的DLBCL病例中，参与已确定途径或具有高累积分数的基因与迁移/侵袭相关。我们验证了DLBCL细胞系和临床样本中8个选定基因的表达：MUC4、SLC35G6、TP53BP2、ARAP3、IL13RA1、PDIA4、HDAC1和百万平方米，并验证了3种蛋白（MUC4、HDAC1和MDM2）在有（n=31）和无（n=20）淋巴瘤积液的DLBCL患者的独立队列中的表达。我们发现HDAC1和MDM2的过度表达与淋巴瘤性渗出的存在相关，而HDAC1的过度表达则与最差的预后相关。

结论

我们的研究结果表明，与淋巴瘤性渗出相关的DLBCL可能与TP53-MDM2通路和HDAC相关染色质重塑机制有关。

补充信息

在线版本包含补充材料，请访问10.1186/s40364-021-00330-8。

关键词：弥漫性大B细胞淋巴瘤，淋巴瘤积液，全外显子组，测序，生物信息学，HDAC1，预后

介绍

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是侵袭性淋巴瘤最常见的形式，约占台湾所有淋巴瘤病例的40%[1]以及全球约33%的病例。DLBCL患者的结果是可变的，因此将其分为低风险组和高风险组有助于制定治疗计划。DLBCL患者体腔积液的发展通常是一个重要病理过程的迹象[2]先前的研究表明，恶性淋巴瘤相关积液（直接浸润或远处转移）对DLBCL患者的生存率有不利影响[三,4]. 其他人报告称，患有肿瘤性积液的DLBCL患者的预后比没有积液的IV期患者更差[4]. 体腔浆液在壁血管和内脏血管之间循环；因此，淋巴瘤细胞在体液中的发展突出了淋巴瘤细胞获得侵袭性转移的能力，包括迁移、侵袭和增殖的能力。

传统上，癌症行为和癌症亚型的识别是通过利用基因表达的特征来实现的。随着全基因测序和全基因组测序的出现，用于识别癌症行为的生物特征列表已大大扩展。在许多研究中，其他人整合了各种DLBCL活检样本的全基因组测序数据，以区分DLBCL的遗传亚型[5,6]. 此外，已经发表了几项基于下一代测序（NGS）的研究，以破译DLBCL亚型的基因突变谱[7——9]. 然而，在DLBCL中出现淋巴瘤性积液的分子机制尚不清楚。

体细胞突变的积累在癌症进展中起着关键作用[10]. 提取不同癌症亚型突变特征的信息量最大的特征集之一是区域突变密度（RMD）[11]. Zhang等人计算了RMD（即每名患者每千个碱基对的突变数），以研究其与不同癌症亚型的关系。他们发现，全基因组RMD图谱代表了黑色素瘤和乳腺癌亚型之间的不同模式[10]. 其他研究表明，兆碱基规模的突变变异与从来源肿瘤细胞获得的功能基因组数据之间存在联系，包括染色质的可及性和复制时间[12,13]. 虽然RMD是检测突出基因的广泛使用方法之一，但大多数突变在功能上是中性和良性的。只有少数突变（称为致病性突变）会损害分子功能，从而导致癌症[14]. 这些早期发表的研究结果促使我们确定了DLBCL中渗出相关淋巴瘤的突变特征。

在这项研究中，我们比较了两组患者的遗传特征：有恶性积液的DLBCL患者与无积液（例如淋巴结疾病）的DLBCL患者。为此，我们对9例渗出型DLBCL患者进行了全基因组测序，并将其与22例基于淋巴结的DLBCL样本进行了比较。我们的目标是通过研究两个因素，即突变累积分数和突变的致病性，来确定与淋巴瘤性渗出相关的DLBCL病例中的高突变基因。

材料和方法

与恶性胸腔积液相关的DLBCL病例来自国立成功大学（NCKU）医院，包括9例接受全外显子组测序（WES）的病例（表1). 所有样本的肿瘤负荷均超过80%。TCGA数据集包括22例淋巴结肿瘤DLBCL样本的WES(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/strutural-genomics/tcga). 该研究得到了机构审查委员会（NCKUH-A-ER-102-397和NCKUH-A-ER-105-483）的批准，并符合1975年《赫尔辛基宣言》（2013年修订）。

表1

DLBCL患者淋巴瘤性积液的临床病理特征

案例	年龄	性别	子类型首席运营官	遗传的	BCL2级	基-67	c-MYC公司	阶段	状态
第9部分	56	M（M）	基础知识	EZB公司	+	60–70 %	+	IIIE公司	活着
第10节	69	M（M）	基础知识	MCD公司	-	60–70 %	+	IIIE公司	死亡
第11节	71	M（M）	基础知识	EZB公司	+	> 90 %	+	四	死亡
第12节	52	F类	GCB公司	EZB公司	-	50–60 %	-	四	活着
第13节	45	M（M）	GCB公司	N1型	-	> 90 %	+	IIE公司	活着
S14标准	39	M（M）	GCB公司	BN2型	+	70–80 %	-	四	活着
第15节	63	F类	GCB公司	联合国	+	70–80 %	-	IIIE公司	死亡
第16节	83	M（M）	GCB公司	BN2型	+	80–90%	+	独立的	死亡
第17条	85	F类	基础知识	MCD公司	+	> 90 %	-	工业工程	死亡

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缩写：+，positive；-，负向；根据Hans细胞-原生质（COO）分类确定的ABC（活化B细胞）或GCB（生发中心B细胞）亚型[15]. 基于MCD的遗传亚型(88马来西亚第纳尔和CD79B型突变）、BN2（BCL6融合和NOTCH2突变）、N1（NOTCH1突变）和EZB（EZH2突变和BCL2易位）[6]. 所有9例患者均有淋巴瘤性积液，EBV阴性；舞台，Ann-Arbor舞台系统

全外显子组测序的DNA提取和质量控制

7根据DNA样品试剂盒（零件号0801−0303）随附的Illumina说明书制备文库。简言之，使用T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA Pol I大片段（Klenow聚合酶）和T4多核苷酸激酶组合对DNA进行最终修复。用Klenow片段（32到52个外显子负）和dATP处理钝的磷酸化末端，以产生一个突出的3-“a”碱基，用于结扎Illumina的适配器，该适配器在3”末端有一个“T”碱基悬垂。适配器连接后，用Illumina引物对DNA进行15个周期的PCR扩增，从琼脂糖凝胶中分离出约250 bp的文库片段（插入物加适配器和PCR引物序列）。纯化的DNA被捕获在Illumina流式细胞上以生成簇。根据制造商的协议，在基因组分析仪上对文库进行测序。

文库准备和测序

为了生成标准外显子组捕获库，我们使用了用于Illumina Hiseq配对测序库（目录号G9704K）的Agilent SureSelect XT HS试剂盒协议。在所有情况下，均使用SureSelect XT临床研究Exome第2版（67.29Mbp）探头组。我们使用1 ug基因组DNA和安捷伦SureSelect XT试剂盒构建文库。使用Agencourt AMPure XP珠（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）纯化扩增适配器连接样品，并在TapeStation 4200 D1000屏幕胶带上进行分析。制备500～1000 ng的gDNA文库，用于与捕获诱饵杂交，并将样品杂交用于安捷伦杂交程序，用Dynabeads MyOne Streptavidin T1（美国生命技术公司）捕获，并用Agencourt AMPure XP珠纯化。使用安捷伦协议通过杂交后扩增添加索引标签。最后，使用150PE协议在Illumina NovaSeq 6000测序器上对所有样本进行测序。突变解释器的生物信息学分析和方法详见补充方法。

突变累积得分

由于本研究的主要目的是比较DLBCL样本的两个群体，我们设计了一种基于群体的评分方法，利用所有样本的突变累积。对于给定的基因，我们记录了在不同样本中发生的所有突变。换言之，我们为每个突变维护了一个列表，该列表代表了突变宿主的样本（补充图S1A） ●●●●。包含的每个突变列表n个行，其中n个表示总体中的样本数。如果样本中存在突变，则样本突变列表中对应的行包含样本的等位基因频率。否则，数字0分配给列表中样本的对应行。尤其， ${A类 F类}_{j个, 我}$ 代表变异的等位基因频率 $我$ 在样品中 $j个$ 。由于我们考虑了突变累积，我们考虑了变异的位置距离（两个突变之间的碱基对数量）。与其他区域的突变相比，发生在基因的一个区域bin中的突变具有类似的功能影响[16——18]. 此前，WinBinVec，一个基于深度学习的模型，使用一维卷积神经网络揭示了bin的突变具有类似的功能影响[19]. Domanska等人[20]结果表明，在小型箱中，高浓度的突变使kataegis、局部超突变、区域明显突出。因此，我们假设，如果一个样本中的突变与另一个样本的突变距离很近，那么它们可能会产生类似的功能影响。另一方面，如果两个突变的距离很长，那么这些突变很可能不会产生共同的功能影响。基于假设和等位基因频率值，我们提出了以下等式来为每个突变指定分数：

{A类 c（c） c（c）}_{秒 c（c） o（o） 第页 e（电子）}^{(我)} = \frac{1}{n个} \sum_{k个 = 1}^{n个} {A类 F类}_{k个, 我} + \frac{1}{我 o（o） 克 ({d日}_{米 我 n个} (我) + 1) + 1},

哪里 ${A类 c（c） c（c）}_{秒 c（c） o（o）第页 e（电子）}^{(我)}$ 是突变的累积分数 $我$ , $n个$ 是总体中的样本数 ${d日}_{米我 n个} (我)$ 是突变的最小距离 $我$ 及其附近的突变 $我 + 1$ 和 $我 - 1$ )以下为：

{d日}_{米 我 n个} (我) = 米 我 n个 [{d日}_{(我, 我 - 1)}, {d日}_{(我, 我 + 1)}],

哪里 ${d日}_{(我, j个)}$ 是突变的距离 $我$ 和 $j个$ 碱基对（bp）。最后，为了获得基因的累积分数，我们选择了其突变的最大累积分数：

{A类 c（c） c（c）}_{秒 c（c） o（o） 第页 e（电子）}^{[克]} = \underset{我 = 1 \dots 米}{米 一 x个} {A类 c（c） c（c）}_{秒 c（c） o（o） 第页 e（电子）}^{(我)},

哪里 $米$ 是基因发生突变的数量 $克$ 基因的累积分数代表其在群体中的重要性。

突变基因的致病性评分

在这种方法中，与突变累积法不同，每个样本都是单独检查的。已经设计了多种突变解释器和数据库，以帮助了解基因变体对基因和癌症的潜在影响的功能意义。这些工具可以利用蛋白质序列、生化特征和进化信息区分致病突变和良性突变。每个突变解释器利用不同的方法和资源来预测突变的致病性。因此，突变解释器可能将突变识别为良性，而另一个解释器则可能将其检测为致病性突变。在这项研究中，我们收集了四种不同的突变解释程序的结果（参见补充方法). 我们的方法优先考虑致病突变而非良性突变。例如，在补充图S中1B、 InterVar、ClinVar、SIFT和CADD分别报告第一个突变为良性（-7.8）、良性（-6.2）、致病性（6.1）和致病性（5）。接下来，我们选择最高得分（致病性最强）作为最终突变得分（例如，对于第一个突变，6.1是最高得分）。最后，为了计算基因得分，我们总结了致病性得分高于0（致病性）的所有突变得分。根据CoLaSp模型修改了将致病性评分分配给每个基因的一致性方法[21].

基因芯片分析

研究队列包括2例胸腔积液中的DLBCL（男性40岁，腹水中有GCB型DLBCL，男性55岁，胸腔积液里有ABC型DLBCL）和2例实体器官中的DLBC（女性34岁，前纵隔中有ABC类型DLBCL；女性36岁，纵隔淋巴结中有GCB-DLBCL）。根据说明书，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA。使用ND-1000分光光度计（美国纳米滴技术公司）在OD260 nm处对纯化的RNA进行定量，并使用生物分析仪2100（美国安捷伦科技公司）和RNA 6000纳米实验室芯片试剂盒（美国安捷伦科技公司）进行鉴定。安捷伦微阵列杂交室试剂盒用于实验（G2534A，安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）。根据制造商的建议，使用DLBCL细胞的总RNA制备生物素化RNA。GAPDH和β-肌动蛋白的比率（3'/5'）在可接受的范围内。RNA分离后，线性扩增两份0.2µg RNA，并使用安捷伦低输入快速安培标记试剂盒（安捷伦科技）用Cy3-CTP（渗出液中的DLBCL）或Cy5-CTP（淋巴结中的DLBC）荧光标记。制造商表示，将等量（0.3µg）的菁染料标记样品与安捷伦8×60 K微阵列芯片（安捷伦科技）杂交。使用安捷伦微阵列扫描仪扫描微阵列，并使用安捷伦特征提取软件（10.5.1.1版）对扫描进行量化，并使用具有最小背景校正的秩一致性线性LOWESS进行归一化。使用微阵列显著性分析（SAM）确定差异表达基因集，仅包括阳性或阴性变化为2.0倍或以上的基因集。进行了层次聚类。

生物信息学和通路分析

基因集富集分析（GSEA，加州大学圣地亚哥分校，加利福尼亚州，美国）用于从渗出液中DLBCL的cDNA微阵列与实体器官中DLBCL的cDNA芯片中确定富集的基因。根据富集基因的数量，为每个先验定义的基因集生成一个富集分数。表中描述了设置和参数2根据丰富的分数，我们确定了与输入数据正相关和负相关的基因集。使用Ingenuity Pathway Analysis软件（IPA，Qiagen，Redwood City，CA，USA）对选定的基因进行分析。基于经典途径、与上游调节因子的关系、分子和细胞官能团以及相关的网络功能，对已知的功能网络进行了富集测试。

表2

基因集富集分析（GSEA）中的参数和设置

芯片平台	带有Emapping_MSigDB.v7.4芯片的人类基因符号
基因集数据库	C2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt[控制]
排列的数量	1000
置换类型	基因集
富集统计	加权
基因排名指标	信号2噪声
最小尺寸（不包括较小的集）	15
最大尺寸（不包括较大的集）	500
探针集的折叠模式 $\geq 1$ 基因	最大探针（_P）
规格化模式	平均值

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DLBCL细胞系和EBV转化的淋巴母细胞系（LCL）

为了验证从上述生物信息学分析中获得的基因的临床意义，对临床样本进行了定量实时PCR、Western blotting和免疫组织化学分析。DLBCL细胞系和LCL（补充表S1)在37°C和7%CO下培养₂在RPMI 1640培养基（Gibco/BRL，Grand Island，NY，USA）中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、4mM谷氨酰胺、75单位/ml链霉素和100单位/ml青霉素。使用台盼蓝排除试验或MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵）试验测定细胞活力。

TaqMan定量实时PCR（TaqMan-qRCR）

总RNAB类-细胞淋巴瘤患者胸膜液中的淋巴瘤和细胞按照制造商的说明用齐唑（#79306，QIAGEN）提取。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（#4368814，Thermo）将1微克总RNA逆转录成cDNA。使用ChamGE Probe qPCR Master Mix（CGE-03，TopGen Biotech）通过TaqMan定量实时聚合酶链反应（qPCR）测定基因表达。PCR引物和TaqMan探针的序列如下所示：

TP53BP2型	探查	ACAAACTTGCGTAAACTGCTC
	福沃德	AAGACTCGGTGAGCATGCG公司
	反向	CCTCATTCGATGAGCGATACG公司
SLC35G6型	探查	AGGAAAGATGGCTGGCGTC公司
	福沃德	CACTCCAACCATGTCACATGG公司
	反向	GTCAGGCGGTTCAAGTAGG公司
PDIA4公司	探查	法案
	福沃德	加加加加加加加特加奇
	反向	GACGGGTCCTTGTTGTTCTT公司
MUC4型	探查	AGCTCTGTGAGAATGGGACGTTG公司
	福沃德	CAATGCTGGAGGATGCAACTT公司
	反向	TGCTAGAATCCCAGAGTGAGAGAGAGG公司
百万平方米	探查	AGAATTGGCTTCCTGAAAGATAAGGG
	福沃德	CACTTCATGCAATGAAATGAATCC公司
	反向	TGAGTTTTCCAGTTGGCTTCT公司
IL13RA1型	探查	ACTTCCGTGTGAAACCTGATC公司
	福沃德	AATAATGGTCTCAAGGATATGCAGGA公司
	反向	CATCATTGTGGAAGGAGGTT公司
HDAC1型	探查	ATGGAAAATCTATCGCCCTCACAA公司
	福沃德	CTCACCGAAATCCGCATGAC公司
	反向	GCTGGTACTTGGTCATCTCCT公司
ARAP3型	探查	ACTTACAGGGCTTCCTGTACT行动
	福沃德	CTGGCCTCTTCTTGCCCTCAGA公司
	反向	GAGGGTCCAGCTTTTTGCT公司
ACTB公司	探查	AGGCACCAGGGCGTG公司
	福沃德	ATGTGCAAGGCCGTCTT公司
	反向	CTCTTGCTCTGGGCCTCGT公司

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蛋白质印迹分析

B的总裂解物-用RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl/pH8.0，150 mM NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，1%Nonide P-40，0.1%SDS，1 mM DTT，10 mMβ-磷酸甘油酯和1 mM EGTA）提取淋巴瘤患者的细胞淋巴瘤和胸水细胞，并辅以蛋白酶抑制剂混合物（P8340，Sigma）。使用蛋白质检测试剂盒（#5000006，Bio-Rad）测量蛋白质浓度。使用抗-ERp72（PDIA4）抗体（#2798，细胞信号）、抗TP53BP2抗体（ab181377，Abcam）和抗α-微管蛋白（T6199，Sigma，）进行蛋白质印迹分析。

免疫组织化学分析

在用表位回收溶液2（EDTA，pH 9.0）预处理的福尔马林固定材料的脱蜡组织切片上进行免疫组织化学染色。使用Bond-Max Automated IHC染色器（澳大利亚纽卡斯尔莱卡生物系统有限公司）进行操作。主要抗体和工作稀释液如下：MUC4（1:100，8G7，小鼠单克隆，Zeta Corporation，Taizhung，Taiwan）、MDM2（1:1100，IF2，小鼠单抗，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA USA）和HDAC1（1:400，4E1，小鼠单株，GeneTex，Tai台新竹）。采用适当的阳性和阴性对照。使用苏木精进行反染色，使用数字显微镜相机（DP12；日本东京奥林巴斯公司）拍摄图像，并使用Adobe Photoshop 8.0版软件（美国加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems Incorporated）进行处理。当肿瘤细胞MDM2的核表达≥10%时，认为染色阳性[22]和HDAC1 in≥50%[23]如前所述。对于MUC4，≥10%的肿瘤细胞的细胞质染色分级为阳性。另外51例DLBCL病例的独立队列(n个 = 31）或无（n=20）淋巴瘤性积液列在补充表S中2[4].

统计分析

使用适当的统计检验检查变量之间的关系和相关性，包括χ²-测试。评估从最初诊断到任何原因死亡的总体生存率，并在最后一次接触日期评估存活患者的随访数据。使用Kaplan和Meier方法计算总生存分布的估计值。使用对数秩检验比较时间-事件分布。使用SPSS统计软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行分析。

结果

补充表S中提供了9个喷出相关DLBCL样本的WES信息三靶区高质量序列的平均深度为197.4x至377.2x，中位数为301.9x。由于无法获得匹配的生殖系DNA，因此通过与遗传变异数据库进行比较来确定体细胞变异。筛选出公共和内部数据库（gnomAD东亚和台湾生物银行）中存在的次要等位基因频率（MAF）>1%的变异。补充图S2显示了每个样本中这些潜在体细胞变异的数量。共有3919个单核苷酸变体（SNV，每个样本的中位数：476，范围：403–555）和209个插入/缺失（indels，每个样本中位数：30，范围：18–37）显示出潜在的蛋白质变化特征（补充表S4Excel文件）。WES数据可在国家生物技术信息中心获得(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov网站/)，生物项目：PRJNA740363(https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA740363？reviewer=49scseu631s44tsbpgt64h0pmi)。

突变评分法可区分渗出相关DLBCL中迁移/侵袭相关通路的较高遗传改变

淋巴瘤细胞进入体腔的途径可能通过血液或淋巴管传播[24]. 体腔中的浆液从顶叶血管循环到内脏血管。因此，体液中淋巴瘤细胞的存在突显了淋巴瘤细胞传播能力的增强。此外，这种能力可能是更具侵袭性的转移性播散表现，如迁移、侵袭和粘附。因此，我们提取了多种途径中的迁移/入侵调节基因。提取的基因属于以下途径或组之一：B细胞受体（BCR）、NFκB、类toll受体（TLR）、黏着斑激酶（FAK）、BCL10-CARD11-MALT1（BCM）复合物、细胞因子、体细胞超突变、白细胞跨内皮细胞迁移、糖蛋白和跨膜蛋白（补充表S5Excel文件）。

接下来，我们比较了两个DLBCL队列（有与无淋巴瘤渗出）之间上述途径和组中迁移/侵袭调节基因的累积分数。如图所示1箱线图比较了不同路径和组的两个队列的累积分数。有趣的是，与非积液相关的DLBCL病例相比，积液相关的DLBCL病例的箱形图中的基因显示出显著更高的累积分数。流出相关DLBCL数据集中的平均得分高于0.4。相比之下，在大多数情况下，非渗出性DLBCL数据集中的累积得分平均值小于0.2。补充表S6Excel文件包含两个数据集中所有基因的累积分数。

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图1

使用箱线图比较两个队列中不同迁移/侵袭相关途径和分子群的累积分数：流出相关（渗出+）DLBCL和非流出相关（分泌-）DLBCL。渗出液中有肿瘤的样本的迁移/侵袭相关基因的累积分数（>0.4）远高于淋巴结等实体器官中的肿瘤样本（<0.2）

基于渗出液的DLBCL样本中致病基因和突变基因的鉴定

突变和SNV是检测各种疾病的生物标志物的丰富来源。在这里，我们考虑了渗出液中肿瘤样本的突变/SNV。喷出相关DLBCL数据集的突变/SNV的详细信息如补充图S所示三-S公司6我们在至少五个样本中获得了受SNV、indels或两者影响的基因（图2A）。补充图S7显示了与溢出相关和基于节点的DLBCL队列中SNV和索引的堆叠条形图，以及补充图S8包含受至少一个溢出相关DLBCL样本中剪接、indels、错义、多次点击、停止丢失和停止-主突变影响的所有基因。尽管图2A和补充图S8包含有关基因及其特征的有用信息，基因突变的数量与异常基因的恶性潜能之间没有联系。因此，我们提取了至少五个流出相关DLBCL样本中检测到的致病基因（图2B） ●●●●。如图所示2,MUC4型（9/9样本中有致病性），SLC35G6型(8/9),ARAP3型(7/9),SLC9B1型(6/9),DDX11型(6/9),MUC16型（5/9），以及HNRNPC公司（5/9）在致病基因和突变基因列表中均有报道。令人惊讶的是，在少数非渗出相关的DLBCL样本中，两幅图中报告的所有基因都发生了突变或致病，除了MUC4型也经常出现在非溢出相关的DLBCL中，需要进一步验证。

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图2

受至少五个渗出相关（渗出+）DLBCL样本突变影响的基因。(A类)含有至少一种插入/缺失（Indel）突变、SNV或两者的样本分别由粉色、蓝色和绿色方块表示。图底部显示了包含SNV和Indel的非渗出相关（渗出）样本的数量。(B类)在至少五个渗出相关（渗出+）DLBCL样本中发生致病性突变的基因。含有良性突变的基因显示为绿色（s<0）。没有致病性突变和至少一个不确定显著性变体（VUS）的基因显示为白色（s=0）。由至少一个致病性突变组成的基因显示为橙色（0<s<10）、红色（10<=s<=20）或灰色（s>20），具体取决于致病性突变的数量。分数越高，说明致病性越强

基因集富集和通路分析

为了破译与渗出液中淋巴瘤播散相关的基因表达谱（GEP），我们额外使用cDNA微阵列来搜索渗出相关DLBCL病例与无渗出液的DLBCL之间的差异表达基因。由于两组DLBCL细胞都来自具有不同微环境的位点，即一组嵌入固体基质，另一组漂浮在渗出液中，我们仔细排除了参与微环境和基质重塑的基因，以将偏差降至最低。如补充表S所示7因此，使用Ingenuity Pathway analysis（IPA）和Gene Set Enrichment analysis（GSEA）软件对积液组中表达强度变化1.5倍的基因进行统计模拟和分析，以确定典型路径。

GSEA分析显示慢性粒细胞白血病（浓缩分数（ES）=0.55；p值=0.010），细胞周期（ES=0.53；p值=0.000），MAPK（ES=0.45；p值=0.007），WNT（ES=0.57；p值=0.006），TGFβ（ES=0.56；p值=0.014），VEGF（ES=0.80；p值=0.000），TLR（ES=0.61；p值=0.004）和JAK-STAT（ES=0.50；p值=0.044）通路在与淋巴瘤性渗出相关的DLBCL样本中显著激活（图三和补充图S9). 此外，计算样本基因集富集度的单样本分析（ssGSEA）和基因集变异分析（GSVA）的结果与GSEA的结果一致（表三). 另一方面，IPA显示，渗出液中携带肿瘤的样本与涉及p53信号转导、核苷酸切除修复（NER）、细胞周期中的检查点激酶（CHK）蛋白、DNA复制、sumoylation（SUMO）和p38 MAPK通路的通路显著相关。IPA提取的每条途径的详细信息见补充表S8Excel文件。我们提取了参与IPA和GSEA鉴定的通路的伙伴蛋白。图4A显示了这些蛋白质的突变累积分数，这些蛋白质也存在于NGS数据集中。在该图中，我们排除了在渗出相关和非渗出DLBCL组中得分均为零的蛋白质。流出相关队列中得分高于非流出相关队列的蛋白质以紫色表示。相反，在非渗出相关的DLBCL队列中，蓝色蛋白得分较高。如图所示4A，GSEA和IPA鉴定的大多数基因在流出相关DLBCL队列中具有较高的累积分数，即图4A在微阵列和NGS数据集中都存在，并且在流出相关的DLBCL队列中显示出较高的突变分数。在图中4B、我们强调了与最高/最低z-score值最相关的六种途径。z评分的正值和负值分别表示流出相关DLBCL队列中通路的激活和抑制。因此，我们发现SUMO酸化和p38 MAPK通路被激活（补充图S10-S公司11)以及在细胞周期控制中对DAN复制、NER、细胞周期检查点控制和p53信号通路的抑制/下调（补充图S12-S公司15)。

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图3

基因集富集分析（GSEA）对渗出相关DLBCL（渗出+）病例与无渗出（渗出-）病例之间的基因表达数据进行分析。KEGG基因集的结果表明，流出相关的DLBCL与(A类)MAPK信号通路(B类)TLR信号通路，以及(C类)JAK-STAT信号通路

表3

基因集变异分析（GSVA）和单样本GSEA（ssGSEA）的结果

	GSVA公司				ssGSEA公司
信号通路	E（+）1	E（+）2	E（-）1	E（-）2	E（+）1	E（+）2	E（-）1	E（-）2
MAPK公司	0.158	0.312	-0.236	-0.244	0.175	0.170	0.061	0.059
Toll样受体	0.160	0.168	-0.142	-0.177	0.170	0.177	0.113	0.116
JAK/STAT（JAK/静止）	0.359	0.208	-0.014	-0.498	0.083	0.076	-0.043	-0.059

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GSVA和ssGSEA都是使用R中的“GSVA”包实现的

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图4

伴侣蛋白的积累分数涉及IPA和GSEA识别的不同途径。(A类)在流出相关（渗出+）队列和非流出相关（分泌-）队列中得分较高的蛋白质分别用紫色和蓝色表示。(B类)与IPA检测到的流出相关DLBCL呈正相关和负相关的途径。我们强调了六个最大和最小z-score值。橙色条（阳性z评分）表示通路的激活，蓝色条（阴性z评分）表明通路的抑制

DLBCL细胞系和临床样本中选定基因突变的验证

我们验证了NGS产生的相关基因的表达（图2B）和GEP（图4B） DLBCL不同细胞系和临床样本的分析。如图所示5定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）证实了SLC35G6、MUC4、TP53BP2、PDIA4、HDAC1和百万平方米在大多数DLBCL细胞系中与LCL（淋巴母细胞系）相比。mRNA水平HDAC1、MDM2、和PDIA4公司与β-actin相比，在大多数临床样本中高度表达（图5B） ●●●●。Western blot（WB）分析也证实PDIA4和TP53BP2的蛋白水平在大多数DLBCL细胞系中高度表达（图6A）和临床样本（图6B） ●●●●。由于缺乏可用的SLC35G6抗体，无法验证该标记的蛋白表达(https://www.antibodypedia.com/gene/82013/SLC35G6)。

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图5

验证DLBCL细胞系和临床样本中感兴趣基因的mRNA表达水平。(A类)8个选择基因的相对mRNA表达(MUC4型,SLC35G6型,TP53BP2型,ARAP3型,IL13RA1型,PDIA4公司,HDAC1型和百万平方米)采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测不同DLBCL细胞系（LCL细胞为对照）。(B类)的级别MUC4型,HDAC1型,百万平方米,PDIA4公司,TP53BP2型用RT-qPCR分析mRNA。β-肌动蛋白基因表达作为内源性控制。误差条表示平均值的标准误差，一式三份

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图6

DLBCL细胞系和临床样本中PDIA4、TP53BP2、HDAC1和MDM2蛋白水平的验证。对PDIA4、TP53BP2的蛋白水平进行评估(A类)在各种DLBCL细胞系和(B类)western blot检测临床标本（LCL细胞作为对照）。(C类,D类)在51例DLBCL患者的独立队列中，HDAC1和MDM2的代表性IHC染色分别有（n=31）例和无（n=20）例淋巴瘤积液。比例尺表示50μm。(E类)淋巴瘤性渗出与HDAC1和MDM2表达呈正相关。(F类)Kaplan-Meier生存分析，比较不同HDAC1表达水平的所有患者的累积生存率

51例DLBCL病例的独立队列（补充表S2)对有（n=31）和无（n=20）淋巴瘤性积液的患者进行免疫组织化学研究，以验证MUM4、HDAC1和MDM2过度表达在淋巴瘤性积脓形成中的作用。我们发现HDAC1的过度表达（图6C）和MDM2（图6D）与淋巴积液的存在相关（图6E） HDAC1过表达也与预后较差有关（p=0.005，图6F）。补充图S显示了HDAC1和MDM2在非渗出性DLBCL病例中的表达以及其他临床病理因素的生存分析16值得注意的是，尽管在NGS分析中发现MUC4具有致病性，但所有51例DLBCL病例的MUC4表达均为阴性。

讨论

在这项研究中，我们设计了一种方法，将基于RMD的分数分配给群体中的每个基因。我们选择了在与淋巴瘤性渗出相关的DLBCL病例中得分较高的基因，而在无渗出的淋巴结型DLBCL患者中得分较低（≈0）的基因。此外，我们使用四种不同的突变解释程序来识别致病基因。在大多数渗出相关DLBCL样本中报告为致病性的基因，但在无渗出的基于结节的DLBCL样品中为良性的基因可能与基于渗出的DLBCL相关。有趣的是，我们发现基于RMD或致病性评分较高的基因与肿瘤侵袭、迁移和粘附有关。最后，我们在一个独立队列中验证了TP53相关和染色质重塑途径在DLBCL淋巴瘤性渗出发病机制中的作用。我们发现DLBCL相关的淋巴瘤性渗出可能与TP53-MDM2通路和HDAC相关的染色质重塑机制有关。

有趣的是，积液病例比非积液病例携带更多的Indels和SNV（补充图S7). 这些发现并不为人所知。TCGA的非渗出组以结节为基础，通过Mutect2调用肿瘤和匹配正常样本中的体细胞变体进行分析。排除（过滤）公共和内部数据库（gnomAD东亚和台湾生物银行）中MAF>1%的变异，以进行进一步分析。相反，对于渗出阳性组，我们使用Freebayes将肿瘤样本中的潜在体细胞变异称为仅考虑外显或剪接变异，并删除同义SNV。因此，积液病例比非积液病例携带更多Indels和SNV的可能原因如下：首先，过滤策略：TCGA组首先使用匹配的正常组织来减去潜在候选基因，但我们没有；第二，肿瘤细胞生物学：与原发（淋巴结）肿瘤细胞相比，扩散（转移）肿瘤细胞获得额外的突变基因来完成传播过程。因此，与非渗出性队列（原发性肿瘤）相比，渗出性群组（转移性肿瘤）携带更多突变基因是合理的。

重点关注与迁移/入侵途径的联系非常重要。因此，我们利用各种迁移/侵袭相关途径来计算DLBCL中有或无淋巴瘤渗出的调节基因的突变累积分数。我们发现，在流出相关的DLBCL队列中，以下途径更为活跃，包括BCR、NFκB、TLR、FAK、BCM复合物、细胞因子和糖蛋白。细胞外刺激通过FAK（PTK2）激活和磷酸化MEKK1-MKK4（或MKK7）-JNK-FAK信号；接下来，激活的JNK磷酸化Jun、Paxillin或Spir[25]磷酸化Jun促进细胞迁移。帕罗西林磷酸化加速细胞粘附的转换，促进细胞快速运动[25]. 磷酸化的螺旋体也影响肌动蛋白动力学和细胞迁移。此外，FGF和EGF生长因子通过Ras-Raf-MEK-Erk-FAK信号模块激活FAK[25].

转录因子NFκB是淋巴细胞存活、增殖和活化的主要调节因子之一，它在慢性炎症和淋巴腺病之间提供联系。NFκB的激活增加了抗凋亡因子和趋化因子的产生，从而触发免疫细胞向炎症灶的迁移。这些特性促进肿瘤细胞生存和转移，同时抑制凋亡[26]. BCL10-CARD11-MALT1（BCM）复合物在NFκB活化和细胞表面抗原受体触发之间形成重要联系中起着关键作用。遗传和生化方法表明，BCM复合体和活化NFκB之间的联系在功能上导致迁移和侵袭[27]. 激活NFκB信号传导的途径可以促进肿瘤生长。已知病原体与细胞表面Toll样受体（TLR）的相互作用可激活NFκB通路。NFκB的激活导致白细胞介素（IL）-10、IL-16、IL-2、IL-1的上调，并增加各种促炎细胞因子的产生[28]. 肿瘤细胞中TLR信号的激活通过血管生成因子（如MMP、VEGF和IL-8）刺激转移并增强癌细胞的增殖[29]. 炎症介质（如细胞因子）可以通过多种机制抑制DNA错配修复系统，从而导致基因突变[30].

通过BCR的信号传导激活整合素的细胞质域，导致细胞外域的构象改变，从而诱导细胞迁移[31]. BCR通路基本基因中的体细胞突变积累突出了BCR信号在DLBCL肿瘤发生中的关键作用。大多数CD79A/B型突变导致免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAM）区域的大片段缺失[32]. 这些突变被证明可以提高BCR表面表达水平[32]. 糖基化影响肿瘤生长和生存并促进转移[33]. 肿瘤中的异常糖基化与致癌转化有关，在肿瘤的进展、生长和转移中起着至关重要的作用[34,35]. Oliveira-Ferrer等人[35]研究表明，糖蛋白影响转移过程的不同阶段，如癌细胞的迁移和侵袭。

我们还强调了受突变影响的基因或在至少五个流出相关DLBCL样本中检测到的致病基因。在这里，我们讨论了一些基因与细胞迁移/侵袭之间的联系。MUC4通过促进一组肿瘤细胞扩散到血液中来促进转移。一项研究表明，MUC4增强侵袭和迁移潜能，促进转移和肿瘤发生[36]. MUC16在体外增强癌细胞的侵袭、迁移和增殖，并在体内增强肿瘤的发生和转移[37]. ARAP3存在于质膜中，在刺激PI3K通路激活的生长因子信号后对跛足形成至关重要[38]. Wang等人发现，ARAP3的下调显著抑制甲状腺癌细胞系的侵袭和迁移能力[39]. 抑制TP53BP2（ASPP2）可加速乳腺癌细胞的细胞迁移、侵袭和上皮间质转化[40]. 值得注意的是，尽管在NGS分析中发现MUC4具有致病性，但所有51例DLBCL患者的MUC4表达均为阴性。这些数据突出了验证临床样本中蛋白质表达的重要性。或者，MUC4突变可能导致功能丧失。

GSEA分析显示，在DLBCL相关的淋巴瘤性渗出物样本中，WNT、VEGF和JAK-STAT等一系列通路被显著激活。WNT通路的异常激活促进异常细胞行为，如细胞运动、基质侵袭和肿瘤进展[41]. 结肠癌细胞系中VEGF信号的抑制通过与细胞运动相关的调节蛋白强烈抑制癌细胞的迁移和侵袭[42]. JAK1是许多细胞系统中STAT3的主要激活物[43]. 早期的一项研究表明，JAK-STAT信号在很大程度上与入侵和迁移相关[44]. 据报道，STAT3在浸润性癌前缘转移中的表达增加[45].

IPA分析确定了细胞周期中的p53信号传导、核苷酸切除修复（NER）、检查点激酶（CHK）蛋白、DNA复制、SUMO和p38 MAPK途径，这些途径与渗出液中携带肿瘤的样本显著相关。p53是一种肿瘤抑制因子，其缺失扰乱了细胞周期检查点。p53抑制也破坏了减少转移的途径。p53直接控制参与细胞粘附、运动和侵袭的基因的转录[46]. p38失调与转移和低生存率相关[47]. 此外，一种著名的抗癌药物黄芩素通过抑制p38信号通路抑制癌细胞运动和转移[48]. NER信号通路识别并消除多种DNA损伤。NER相关基因的畸变已在几种恶性肿瘤中得到证实，对临床问题具有潜在影响[49]. Ranbp2蛋白与癌细胞有关，遗传点突变和易位与肿瘤发生有关[50]. 胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）与Ranbp2的相互作用对IGF1R酰化至关重要，IGF1R酰化在癌细胞进展中起着至关重要的作用[51]. 另一方面，SUMO结合酶ubc9的一些多态性与转移和侵袭有关[52]. 此外，AP-1表达增加促进迁移、侵袭和转移[53]. DNA必须在细胞分裂之前精确复制。有缺陷的DNA复制会触发异常类型的DNA复制，如DNA重新复制和计划外内复制，从而导致更具攻击性和耐药性的癌症。激酶共济失调毛细血管扩张症和rad3相关蛋白（ATR）、共济失调毛细管扩张症突变（ATM）和检查点激酶1/2（CHK1/2）在停滞的复制叉处形成一个关键的DNA损伤反应模块，被认为是复制应激。ATM-ATR的激活使CHK1和CHK2磷酸化，从而进一步激活p53和其他下游分子以及对复制应激的反应蛋白[54].

GSEA和IPA分析显示23个富集基因，包括PDIA4公司,HDAC1型、和百万平方米与对照组相比，流出相关DLBCL样本的突变累积分数较高。据报道，PDIA4作为组织因子的促进剂，负责凝血、调节血小板的功能和积聚[55]. 受刺激血小板有助于促进肿瘤细胞转移、增殖、粘附和血管生成，并使肿瘤细胞远离免疫系统[56]. 因此，PDIA4可能是活化血小板与肿瘤进展之间的联系[57]. PDIA2是一个重要的预后标志物，在卵巢癌耐药表型中起重要作用[58]. 据报道，HDAC1在多种癌症类型中高表达。DLBCL患者某些组蛋白相关蛋白的表达水平，包括HDAC1、HDAC2和HDAC6，明显高于正常淋巴组织。此外，HDAC1的表达增加与DLBCL患者的肿瘤侵袭性和生存率降低有关[59]. 同时，我们发现HDAC1和MDM2的过度表达与淋巴瘤性渗出的发生相关，并且HDAC1的过度表达进一步预测了更糟糕的结果。p53抑癌基因受MDM2负调控。p53反式激活物百万平方米MDM2反过来降低并抑制p53活性，形成负反馈回路。据报道，MDM2在癌症中高度表达[60]. 激活肿瘤中过度表达MDM2和野生型p53的p53介导的凋亡的一个值得注意的策略是抑制p53-MDM2的相互作用[61]. 我们的研究结果表明，DLBCL相关淋巴瘤性渗出可能与TP53-MDM2通路和HDAC相关染色质重塑机制有关。

我们研究的弱点是样本数量相对较少，这是因为DLBCL最初以淋巴瘤性渗出为表现的罕见发生。然而，我们使用了两种方法，WES和基因微阵列，以及精细的生物信息学分析来破译DLBCL淋巴瘤性渗出发病机制的基因。此外，我们用另外一组临床样本验证了我们的NGS发现，包括有或无肿瘤性积液，并证实了有趣的发现，这值得在更大的独立队列中进行进一步研究。

结论

DLBCL是最常见的淋巴瘤类型。一部分患者可能在最初或疾病进展期间出现淋巴瘤性渗出，并与受影响患者的不良预后相关[4]. 在这项研究中，我们使用NGS和GEP来评估基于渗出的DLBCL细胞，并将结果与非渗出相关的DLBCL细胞进行比较。结果表明，流出相关的DLBCL细胞在BCR、NFκB和TLR通路以及白细胞迁移相关基因中得分较高。另一方面，IPA强调了TP53相关和染色质重塑途径在DLBCL淋巴瘤性渗出中的关键作用，这在独立队列中得到了验证。我们的发现揭示了淋巴瘤性渗出的DLBCL患者的预后和治疗意义。

补充信息

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致谢

不适用。

缩写

自动取款机	共济失调毛细血管扩张症突变
自动标签阅读器	共济失调毛细血管扩张症与rad3相关蛋白
车身控制模块	BCL10-卡11-MALT1
业务连续性审查	B细胞受体
CHK（检查）	检测激酶
DLBCL（DLBCL）	弥漫性大B细胞淋巴瘤
锿	浓缩分数
FAK（传真）	粘着斑激酶
通用电气设备	基因表达profilin
GSEA公司	基因集富集分析
ssGSEA公司	单样本GSEA
GSVA公司	基因集变异分析
伊利诺伊州	白细胞介素
投资促进机构	创意路径分析
意大利电信协会	免疫受体酪氨酸活化基序
拼箱拼箱	淋巴母细胞系
MAF公司	次要等位基因频率
净入学率	核苷酸切除修复
NGS公司	下一代测序
风险管理部	区域突变密度
定量RT-PCR	定量逆转录PCR
SNV公司	单核苷酸变异；插入/删除
SUMO公司	SUMO化
TCGA公司	癌症基因组图谱
TLR公司	类收费受体
WES公司	全外显子组测序
工作分解结构	蛋白质印迹

作者的贡献

Sina Abdollahi和Seyedeh Zahra Dehghanian：生物信息分析的表现和文章的起草。梁义洪和杨宪杰：实时定量PCR和免疫印迹数据的采集和分析。陈道鹏：下一代测序的表现。L.Jeffrey Medeiros：数据分析、批判性审查和草案修订。蒋正贤和张孔超：数据的设计、分析和解释以及草案的修订。作者阅读并批准了最终稿。

基金

本研究得到了台湾科技部（MOST 106-2320-B-006-037-MY3和MOST 109-2320-B-007-045-MY3）以及台湾高雄医科大学研究中心（KMU-TC109A04-1）对KC Chang博士的资助。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。WES数据可在国家生物技术信息中心获得(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov网站/)。

声明

道德批准和参与同意

该研究得到了机构审查委员会（NCKUH-A-ER-102-397和NCKUH-A-65 ER-105-483）的批准，并符合1975年《赫尔辛基宣言》（2013年修订）。已获得相关参与者的书面知情同意。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明没有利益冲突。

脚注

出版商笔记

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

参与者信息

蒋正贤，电子邮件：wt.ude.ukcn.liam@gnaihcj。

张孔超，电子邮件：wt.ude.ukcn.liam@ckgnahc。

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文章来自生物标志物研究由以下人员提供BMC公司