急性淋巴细胞白血病细胞株中天冬酰胺酶敏感性与天冬酰胺合成酶蛋白含量而非mRNA含量的相关性

摘要

简介

L-天冬酰胺酶（ASNase）是儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的重要化疗药物，临床试验表明，强化ASNase治疗可以改善预后[1,2]. ASNase给药导致血浆天门冬酰胺耗竭，随后细胞内天门冬氨酸丢失[三]. 大多数组织含有足够的天冬酰胺合成酶（ASNS）活性来维持天冬酰胺，或者该酶在天冬酰胺耗竭时上调[4,5]. 原代ALL细胞和许多ALL细胞株表现出ASNS表达水平特别低[6,7]因此，对天冬酰胺消耗异常敏感。经药物筛选的抗ASNase的ALL细胞株表现出ASNS的高表达[8,9]以及外源性ASNS蛋白的过度表达导致在缺乏药物选择的情况下出现ASNase耐药表型[9].

尽管原代ALL细胞有能力上调ASNS mRNA含量，以应对体外ASNase治疗[10]或体内[11]天冬酰胺仍然是该细胞群的必需氨基酸。这种明显的悖论使得很难解释ALL细胞对ASNase治疗的敏感性。研究表明，ALL母细胞体外ASNase敏感性与体内耐药性和预后相关[12–15]. 然而，与人类细胞中ASNS蛋白或活性和ASNase耐药性相关的已发表数据有限。在1969年的一项研究中，Haskell和Canellos[16]与四名药物敏感患者相比，五名ASNas耐药患者的ASNS酶活性更高。最近，Dübbers等人[17]据报道，AML或ALL患儿淋巴母细胞中ASNS活性值相似，但患者的活性水平差异较大。通过微阵列分析，Fine等人[18]在16个ALL细胞系中观察到ASNS mRNA含量和ASNase敏感性之间存在相关性，但在原代ALL细胞中没有强相关性。

Stams等人[10]假设TEL-AML1蛋白对ASNS表达的抑制可能解释了TEL-AML1（+）ALL细胞体外对ASNNase敏感性的增加，但令人惊讶的是，他们的研究表明，TEL-AML1（+）ALL母细胞表达的ASNS mRNA是TEL-AML1（−）细胞或正常对照的五倍。他们还观察到，接触ASNase后上调ASNS mRNA的能力没有差异。Krejci等人[19]尽管相对于TEL-AML1（−）细胞ASNase敏感性增加，但在TEL-AML1（+）细胞中观察到ASNS mRNA增加。有趣的是，尽管15名ASNS mRNA低于中位数的TEL-AML1（+）患者中有10名复发，但ASNS升高的患者中没有一名复发。然而，Stams等人[20]与ASNS mRNA水平相比，复发率没有差异。Holleman等人[21]检测了173名患者的囊胚对ASNase的敏感性，并将敏感性与寡核苷酸阵列测定的ASNS mRNA相关联。虽然ASNS不是与体外抗ASNase相关的前35个基因之一，但ASNS mRNA水平高出2.9倍(P（P）<0.001）。这些结果与60个人类肿瘤细胞株中ASNS mRNA和ASNase敏感性之间的反向关系一致[22].

对许多最近研究的警告是，ASNS mRNA是分析的，而不是蛋白质含量或酶活性。相互矛盾的已发表数据强调需要更好地理解ASNS表达与ASNase敏感性之间的关系。本研究旨在测试ASNS mRNA表达和ASNS蛋白含量之间的对应关系，并确定这些参数中哪一个与ASNase敏感性更好相关。

材料和方法

结果

对ASNase的敏感性

对暴露于1 IU/ml ASNase后的总活细胞数和存活率的分析证实了MOLT-4P细胞的敏感性和所选抗ASNase的MOLT-4R对应物的不敏感性(图1). NALM-6和REH这两种B细胞系都没有表现出显著的细胞死亡，但生长比MOLT-4R慢，这说明了ASNase对这些特定细胞系的细胞抑制性质。与MOLT-P相比，过度表达外源性ASNS的MOLT-4P/ASNS细胞显示出ASNas敏感性显著降低，证实ASNS表达升高足以诱导更耐药的表型[9].

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图1。

所有细胞株都显示出不同的生长模式和对ASNase治疗的敏感性。将5个ALL衍生细胞系稀释至50×10⁴细胞/ml，用1 IU/ml的ASNase处理指定时间。处理36小时后，给细胞注入新鲜培养基。绘制总活细胞数（顶面板）或细胞存活率百分比（底面板）与ASNase治疗时间的关系。结果显示为三个独立实验的平均值±标准偏差。

ASNase作用的浓度依赖性

为了确定五种细胞系的相对敏感性，将细胞在0–5IU/ml ASNase中培养72小时，然后分析细胞增殖和生存能力。初始细胞数为5×10⁴每个细胞系，所以在补充图S10 IU/ml时的值表示它们在72小时内的相对生长速率，即：MOLT-4R和NALM-6>MOLT-4P和MOLT-4P/ASNS>>REH。虽然NALM-6和REH没有MOLT-4P那么敏感，但它们的生长受到大于1 IU/ml的ASNase水平的抑制。当分析存活率时，相对ASNase敏感性也很明显(图2). 当ASNase浓度为5IU/ml时，MOLT-4R中的细胞死亡率低于20%，而NALM-6和REH中的细胞死亡率约为50%。MOLT-4P对ASNase的敏感性显著高于所有其他IC估计的细胞株₅₀0.004 IU/ml(图2). 相反，MOLT-4R具有IC₅₀ASNase大于25 IU/ml。NALM-6、REH和MOLT-4P/ASNS的敏感性与IC大致相当₅₀值分别为6.1、3.5和0.7 IU/ml。

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图2。

ASNase浓度对ALL细胞株细胞死亡的影响。ALL细胞稀释至50×10⁴毫升⁻¹然后将100μl的等分试样放入96 well板的每个孔中。用ASNase处理72小时后，测定细胞存活率。显示的结果是三个独立实验的平均值±标准偏差，为了清楚起见，ASNase低于0.1 IU/ml的治疗数据显示为插入数据。

急性ASNase治疗后ASNS的表达

来自MOLT-4P细胞的数据[9,23]和一次爆破[11]表明ASNS mRNA水平随着对ASNase的反应而增加，但ASNS蛋白含量尚未报道。为了评估ASNS mRNA和蛋白的表达，将5个细胞系暴露于1 IU/ml ASNase中0–48小时(图3A和​和B）。B类). 作为对ASNase治疗的反应，所有五种细胞系的ASNS mRNA含量增加了12小时，并在整个48小时内保持升高(图3A).不同细胞系之间ASNS的基本蛋白含量差异很大(图3B). MOLT-4P细胞的水平极低，其中MOLT-4R细胞含有最多的ASNS蛋白，NALM-6、REH和MOLT-4P/ASNS是中间产物。与ASNS mRNA的变化形成鲜明对比的是，只有MOLT-P细胞在ASNase处理后ASNS蛋白含量表现出时间依赖性增加(图3C). 然而，相对于基础（T=0小时）的增加程度直到24小时才达到统计显著性(图3C). 剩余细胞类型的最高MOLT-P值（48小时时为15.7±4.7）仍低于最低基础值（REH细胞，20.3±4.6）。为了说明ASNase敏感性和ASNS表达之间的关系，估计的IC₅₀将三个亲代ALL细胞系的值与ASNS mRNA和蛋白值进行比较(图3D). ASNS蛋白与IC的相关性₅₀比IC大得多₅₀ASNS mRNA含量。这些结果与下述观察结果一致，这些观察结果表明大多数新诊断患者的ASNS蛋白水平极低(图4).

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图3。

ASNase治疗期间ALL细胞系中ASNS mRNA和蛋白的表达。ALL细胞稀释至50×10⁴细胞/ml，用1 IU/ml的ASNase处理指定时间。治疗后36小时更换培养基。（A组）在每个时间点收集RNA，并使用ASNS和GAPDH特异性引物进行定量RT-PCR。将ASNS mRNA水平标准化为GAPDH水平，并绘制时间0时相对于MOLT-4P细胞的倍数诱导。（B组和C组）收集全细胞提取物，并对ASNS或肌动蛋白进行免疫印迹（B组），并通过密度测定法对结果进行量化（B组与C组）。在图B中，免疫印迹和定量数据，标准化为肌动蛋白水平，显示了ASNS蛋白的基础量（时间=0小时）。在面板C中，数据是相对于MOLT4-P细胞在时间=0小时时的值绘制的。显示的结果是三个独立实验的平均值+标准偏差，以及那些显著不同的值(P（P）<0.05）。面板D显示了ASNase IC之间的关系₅₀ASNS蛋白或mRNA表达。对于三个亲本细胞系（MOLT-4P、NALM-6和REH），估计IC₅₀ASNase敏感性值来自以下数据图2与面板A和C中显示的ASNS蛋白（上部）或ASNS mRNA（下部）的相对量进行比较。

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图4。

儿童ALL主要患者样本中ASNS蛋白含量。从最初诊断时获得的所有患者样本中制备全细胞提取物。样本（15μg/lane）通过免疫印迹分析ASNS或肌动蛋白水平。作为相对丰度的参考，还包括来自MOLT-4P和MOLT-4R细胞的细胞提取物。

讨论

MOLT-4P细胞表达ASNS蛋白的水平极低，但通过ASNase-selection（MOLT-4R）或强制过表达（MOLT-4 P/ASNS）增加ASNS的表达，诱导ASNase抵抗[9]. 当前的实验扩展了这些观察结果，并包括以下新的观察结果。（1） B-ALL细胞系REH和NALM-6表达ASNS mRNA和蛋白的基础水平高于MOLT-4P，但低于药物选择的MOLT-4R细胞。（2） ASNase的作用主要是抑制细胞生长，对抗REH、NALM-6和MOLT-4P/ASNS；只有MOLT-4P细胞表现出显著的细胞死亡。（3） 尽管REH是TEL-AML1（+），NALM-6不是，但两种B-ALL细胞系的ASNase敏感性相似。（4） 对于三个亲本细胞系，ASNase敏感性与ASNS mRNA水平无关，但与ASNS蛋白含量相关。（5） ASNS蛋白含量存在无法从mRNA水平预测的细胞特异性差异。（6） ASNase在所有五个细胞中都诱导了ASNS mRNA，但只有在MOLT-4P细胞中ASNS蛋白显著增加。然而，上调的MOLT-4P ASNS蛋白含量仍低于ASNase不敏感细胞群的基础水平。（7） 虽然从最初诊断时起，所有患者样本都表达了不同数量的ASNS mRNA，但其水平与ASNase敏感的MOLT4-P细胞中的水平相似。在十个样本中，只有一个样本表达的ASNS蛋白高于MOLT4-P中观察到的水平，并且该水平比高抗性MOLT4-R品系中的ASNS表达水平低几个数量级。综上所述，这些数据表明，在最初诊断时，由于ASNS蛋白高水平表达而导致的ASNase耐药性至多是罕见的。（8） 对ASNS表达的抑制增强了ASNase的敏感性。

ASNS mRNA分析得出了关于原代ALL细胞中ASNS mRNA水平与ASNase敏感性之间关系的不同结论。Holleman等人[21]据报道，体外抗ASNase患者的成核细胞中ASNS mRNA水平显著升高，而其他人没有观察到这种相关性[11,18,26]. 这些不同的结果与目前的数据一致，即ASNS蛋白表达和ASNase敏感性都不一定与ASNS mRNA含量相关。相反，ASNase敏感性与ASNS蛋白丰度呈负相关。考虑到大多数患者最初对ASNase敏感，他们的细胞可能会被药物敏感的MOLT-4P细胞反射。10例新诊断的ALL患者的ASNS蛋白与在MOLT-4P细胞中观察到的蛋白相似。ALL患者的ASNase敏感性可能是以下两个观察结果的结果。首先，在MOLT-4P中，首次接触ASNase和ASNS蛋白增加之间有12–24小时的延迟。其次，即使在ASNase诱导后，在ASNase抗性ALL细胞系中，MOLT-4P ASNS蛋白含量仍低于基础水平。显然，有必要对患者样本进行广泛分析，以确定这些细胞培养结果是否适用于治疗。Dübbers等人的研究结果强调了这一谨慎[17]他观察到，所有患者的ASNS酶活性变化达50倍。

TEL-AML1（+）ALL患者对ASNase更敏感[10,27]尽管这些患者中ASNS mRNA的含量可以与TEL-AML1（−）患者中相同[10,26]. 这些人群中的ASNS蛋白质含量尚未得到监测。ASNase暴露后，TEL-AML1（−）NALM-6细胞和TEL-AMP1（+）REH细胞ASNS mRNA含量的变化没有显著差异，但与估计的IC一致₅₀此处报告的值和患者的观察值[10]与REH细胞相比，NALM-6细胞中ASNS蛋白的基础水平是REH细胞的两倍。

总的来说，目前的结果表明，ASNS蛋白而非mRNA的测量可能是ASNase敏感性的更好指标，可能解释了ASNS mRNA与药物敏感性之间已发表的不一致性。

补充材料

确认

缩写：

脚注

参考文献