RIG-I样受体在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染中的不同作用

摘要

亲爱的编辑：，

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种包膜阳性单链RNA病毒，已造成21世纪最大的全球公共卫生危机。其发病机制在很大程度上仍不清楚，这突出表明迫切需要在这一领域进行新的研究。胞质维甲酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是RNA病毒的主要模式识别受体（PRRs）。一旦与病毒RNA结合，RLR就会结合线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），从而触发信号级联，导致免疫基因转录[1]. 由于它们对启动抗病毒免疫反应的重要性，因此这些途径是许多病毒（包括SARS-CoV-2）逃避免疫的共同目标[2].

我们研究了RLR在人类肺上皮细胞系Calu-3中控制SARS-CoV-2感染和增加免疫反应中的作用。我们使用CRISPR-Cas9产生了单个敲除，并通过免疫印迹法进行了验证（附加文件1：图S1a）。为了证明这些基因功能被精确地沉默，我们用水疱性口炎病毒（VSV）感染突变细胞，并将绿色荧光蛋白（GFP）整合到其基因组中。正如预期，钻机-I^−/−或MAVS公司^−/−细胞表现出比野生型（WT）细胞更高的VSV-GFP负荷，而MDA5型^−/−这些细胞的病毒载量与WT细胞相似（附加文件1：图S1b）。然后我们比较了这些细胞中SARS-CoV-2的载量和干扰素（IFN）。感染后24小时和72小时（p.i.），所有敲除细胞中的细胞内病毒RNA负荷显著高于WT细胞（补充文件2：图S2a）。一贯地，所有敲除细胞产生的细胞外病毒滴度也高于WT细胞产生的病毒滴度（附加文件2：图S2b）。我们在另一人肺上皮细胞系A549中证实了这些观察结果（附加文件2：图S2c），但对SARS-CoV-2的许可性明显较低。虽然主要检测DNA病毒，但环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激物（STING）信号通路也限制了许多RNA病毒的感染[三]. 我们注意到SARS-CoV-2负载在STING（STING）^−/−单元格（附加文件2：图S2d，e），表明STING信号在很大程度上对SARS-CoV-2的控制是不必要的。

接下来我们检查了抗病毒免疫反应。这个IFNB1公司（I型干扰素）和IL29号（III型IFN）mRNA水平在WT细胞感染过程中持续上调；而这种诱导在MDA5型^−/−和MAVS公司^−/−细胞，一个干扰素刺激基因（ISG15）也是如此（附加文件三：图S3a）。细胞培养上清液中IFN-λ和C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）蛋白的浓度MDA5型^−/−和MAVS公司^−/−远低于WT电池（附加文件三：图S3b）。然而，I/III型干扰素和ISG15的表达在钻机-I^−/−比WT单元（附加文件三：图S3a），表明RIG-I独立于IFN干扰SARS-CoV-2复制。接下来我们研究了RLR信号是否调节血管紧张素转换酶2（ACE2）的表达，ACE2是SARS-CoV-2的主要细胞进入受体，从而影响病毒复制。在气道上皮中，除了全长ACE2（805个氨基酸）外，还表达了一种短亚型（459个氨基酸），不含信号肽的17 aa和N末端肽酶结构域的339 aa。短型，而非全长，可由I型或III型干扰素诱导。然而，短亚型不能结合SARS-CoV-2尖峰蛋白，因此可能在病毒进入中没有作用。我们首先使用我们自己的引物（靶向外显子4和5）通过定量RT-PCR对全长ACE2进行定量。值得注意的是，与1 h p.i相比，24 h和72 h WT中全长ACE2的mRNA水平诱导了两倍以上MDA5型^−/−和MAVS公司^−/−与WT单元中一样正常（附加文件三：图S3c），尽管这些敲除细胞缺乏I/III型IFN表达（附加文件三：图S3a，b），表明严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染以不依赖于干扰素的方式诱导ACE2表达。有趣的是，它比钻机-I^−/−在整个感染过程中都比WT细胞多（附加文件三：图S3c），表明RIG-I可能抑制全长ACE2转录。我们仅使用已发布的全长ACE2引物对证实了这些结果（附加文件三：图S3d）。根据最近的研究，我们接下来使用两对独特的引物评估了短亚型的表达，分别命名为MIRb和dACE2。与每周1小时相比，72小时时WT细胞中短亚型上调了3.5倍以上，但在钻机-I^−/−单元格（附加文件三：图S3d）。

了解呼吸道上皮细胞中的主要PRR途径在生理上具有重要意义，因为这些细胞是宿主防御的第一道防线。RLR信号在所有组织和细胞类型中都有功能，而病毒RNA-sensing TLR3/7主要局限于免疫细胞。我们的研究结果表明，MDA5是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的主要RLR，这与最近的两项研究一致[4,5]. 然而，无论是在MDA5还是MAVS基因敲除细胞中，IFN的诱导都被完全废除，这表明其他PRR可能共同发挥作用。RIG-I缺失对干扰素应答没有负面影响，但仍能增强病毒复制，表明RIG-I发挥MAVS-IFN依赖性抗病毒作用。然而，RIG-I在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染中的作用并不一致。Yin等人[4]证明RIG-I对于SARS-CoV-2复制的控制是不可或缺的，而我们和山田的[5]数据表明情况并非如此。从机制上讲，RIG-I可能通过解旋酶结构域结合SARS-CoV-2 RNA基因组的3'非翻译区，并阻止病毒RNA独立于IFN复制[5]. 除了上述机制外，我们的结果表明RIG-I可以抑制全长ACE2的表达，从而抑制SARS-CoV-2细胞的进入。令我们惊讶的是，SARS-CoV-2诱导短亚型ACE2表达似乎依赖于RIG-I。尽管RIG-I在全长/短ACE2转录中对比作用的机制尚不清楚，但值得注意的是，它们的转录确实受到不同的调节。有必要在未来开展全面的工作来阐明这一点。

我们想指出的是，我们的发现仅限于人类肺上皮细胞系，其他PRR，如病毒RNA-sensing TLR3/7，可能是其他细胞类型中重要的SARS-CoV-2传感器。尽管如此，考虑到MDA5在启动呼吸道上皮抗病毒免疫反应中的重要作用，因此MDA5激动剂可能对早期SARS-CoV-2感染具有潜在的治疗作用。

补充信息

致谢

缩写

作者的贡献

DMY执行了大多数实验程序和数据分析。TTG和AGH对其中一些数字做出了贡献。PHW构思并监督了该研究。DMY和PHW撰写了这篇论文，所有作者都审查和/或修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

基金

这项工作得到了国家卫生研究院拨款（编号：R01AI132526）和康州大学健康创业基金的部分支持。

数据和材料的可用性

所有相关数据和材料都在本文及其附加文件中。

声明

参与者信息

杨多蒙，电子邮件：ude.chcu@gnayd.

耿廷廷，电子邮件：ude.chcu@gneg.

安德鲁·哈里森，电子邮件：ude.chcu@nosirraha.

王鹏华，电子邮件：ude.chcu@gnawep.

参考文献