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科学高级。2021年8月；7（35）：eabb3799。
2021年8月27日在线发布。 数字对象标识：10.1126/sciadv.abb3799
PMCID公司：PMC8397269号
PMID：34452908

拉明B1封存53BP1，以控制其对DNA损伤的补充

Laure Etourneaud公司,1,2,† 安吉拉·穆萨,1,2,† 艾米莉·拉斯斯,1,2,† 黛安·杰奈特,1,2,† 西蒙·威洛姆,1,2 卡罗琳·查班塞·库穆拉,1,2 保罗·万斯科尔,1,2 朱利安·皮科托,1,2 贝诺·特·塞塞,1,2 乔丹·戴帕涅,三 泽维尔·维奥特,三 埃利亚·迪泽特,三 迪迪埃·布索,三 巴拉斯库（Aurélia Barascu）,1,2 拉米亚·埃尔巴,1,4 蒂埃里·科图列夫斯基,1,5 安娜·坎帕兰（Anna Campalans）,6 凯瑟琳·勒查洛尼,1,2 苏菲·津·贾斯汀,7 拉尔夫·斯库利,8 加列·彭纳伦,1,2和帕斯卡尔·贝特朗1,2,*
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补充资料

拉明B1控制53BP1募集到DNA损伤。

摘要

双品牌断裂（DSB）是有害的损伤，也是基因组不稳定的主要原因。研究表明，核膜与DNA损伤反应之间存在联系。在这里，我们发现核包膜的主要成分层粘连蛋白B1与53BP1蛋白直接相互作用，53BP1蛋白在DSB修复中起着关键作用。这种相互作用在DNA损伤后分离。拉明B1过度表达阻碍53BP1募集到DNA损伤部位，导致DNA损伤持续存在，非同源末端连接缺陷和对DSB敏感性增加。通过对层粘连蛋白B1和53BP1之间相互作用域的鉴定，我们可以证明53BP1募集的缺陷和层粘连基因B1过度表达后DSB的持续存在是由于层粘连分子B1隔离53BP1所致。这项研究强调了层粘连蛋白B1是一个控制损伤后53BP1向DNA损伤部位募集的因子。

简介

基因组的稳定性是通过细胞周期控制、DNA修复、细胞凋亡和衰老的协调来保证的。双品牌断裂（DSB）是由内源性和外源性应激产生的非常有害的损伤(1). DSB修复缺陷导致细胞死亡、衰老和基因组不稳定。在哺乳动物细胞中，非同源末端连接（NHEJ）在DSB修复中起着关键作用，其缺陷一直导致对DSB诱导剂和基因组重排的高度敏感性。然而，虽然NHEJ对维持基因组稳定性至关重要，但它也可以通过染色体序列捕获或易位产生遗传不稳定性(2–4). 此外，NHEJ被认为有助于触发在肿瘤中观察到的显色菌(5).

肿瘤抑制蛋白p53结合蛋白（53BP1）与端粒相关蛋白RIF1（RIF1）、PAX-相互作用蛋白1（PTIP）、Bloom综合征蛋白（BLM）蛋白相关，通过53BP1-RIF1依赖性募集屏蔽复合物来保护DNA末端不被切除，从而有助于NHEJ DSB修复(6–10)，竞争对手路径所需的步骤，例如同源重组或替代末端连接(11–16). 53BP1缺乏导致放射敏感性，53BP1缺陷小鼠容易发生肿瘤(17). 然而，不受控制的53BP1补充增加了有丝分裂中的遗传不稳定性(18,19). 总之，这些观察结果表明需要严格控制NHEJ和53BP1对DNA损伤的补充。据报道，控制53BP1与受损染色质结合的各种复杂机制。染色质和DSB周围相关蛋白的一些修饰调节53BP1对DNA损伤位点的可及性。此外，53BP1的翻译后修饰本身严格控制了其向受损DNA的募集以及随后在DNA损伤反应（DDR）中的作用(18–22).

不同的研究表明核膜蛋白和DDR之间存在联系。在哺乳动物细胞中，核膜的完整性和可塑性由两种核层粘连蛋白（A型和B型）及其相关蛋白来保证(23). 而核纹层的主要成分层粘连蛋白B1由LMNB1型基因，存在于生物体的整个生命周期中，由LMNA公司基因主要在分化细胞中表达(23). 各种退行性病变与LMNA公司基因突变，其中包括严重早衰的Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）。在这种情况下，前体层粘连蛋白a的加工缺陷导致一种突变的、未成熟的和法尼化的层粘连蛋白质a的表达，称为前体蛋白(24,25). 除了层粘连蛋白对核完整性、基因表达调控以及可能的DNA复制的影响外，还报道了层粘连蛋白质，特别是层粘连蛋白酶a在DNA损伤信号传递和修复中的作用。在早衰症细胞中，层粘连蛋白A过表达后，以及在具有缺陷ZMPSTE24蛋白酶的小鼠模型中，观察到DNA损伤的持续性，如DSB标记物γH2AX灶的存在所示，该蛋白酶参与层粘连蛋白A的加工以产生成熟的层粘连蛋白A(26–29). DNA损伤的持续性被认为参与了HGPS的衰老表型(26,27). 此外，在缺乏层粘连蛋白a基因表达的小鼠胚胎成纤维细胞中，53BP1稳定性降低(30). 也有研究表明，层粘连蛋白A可以与53BP1免疫共沉淀(31)前层粘连蛋白A的过度表达导致53BP1在细胞质中定位错误(32). 在衰老诱导时可以观察到的层粘连蛋白B1减少的情况，导致DNA修复因子表达的失调，特别是那些参与DSB修复的因子，并可能导致DNA修复缺陷(33,34).

然而，到目前为止，还没有报道与层粘连蛋白B1水平下降相关的遗传病。最近，有报道称在LMNB1型这会对核膜形成产生主要的破坏性影响，并导致人类小头畸形(35,36). 相反，各种病理情况都与层粘连蛋白B1的过度表达有关。复制LMNB1型导致层粘连蛋白B1过度表达的基因是成人型常染色体显性白质营养不良（ADLD）的原因(37). 在两种修复综合征中也报告了层粘连蛋白B1的过度表达，即共济失调毛细血管扩张症（A-T）和沃纳综合征，这两种综合征分别由以下基因突变引起：自动取款机和警告基因，与遗传不稳定性、癌症易感性和过早衰老相关(38,39). 我们之前已经确定了层粘连蛋白B1在A-T细胞中的积聚。我们发现，层粘连蛋白B1正常化挽救了细胞核形状改变（NSA），并减少了在这些细胞中观察到的早衰(38). 最后，NSA是肿瘤细胞的特征之一，几十年来，细胞学专家一直使用它来根据肿瘤的侵袭性对肿瘤进行分类。在一些肿瘤中，发现了高水平的层粘连B1(40–44). 然而，NSA尤其是层粘连蛋白B1积累对基因组稳定性或DSB修复的影响尚未研究。

在这里，我们确定了层粘连蛋白B1过度表达对DSB修复的影响。与已报道的层粘连蛋白A缺乏或前层粘连膜A突变体积聚相比(30–32)我们发现，当层粘连蛋白B1过度表达时，53BP1水平及其核定位都没有改变。然而，层粘连蛋白B1的过度表达阻碍了53BP1对DNA损伤的补充。我们确定了内源性层粘连蛋白B1和53BP1蛋白之间的直接相互作用。在细胞中，这种相互作用在电离辐射（IR）照射后被解离，使53BP1迅速补充到DNA损伤中。总之，这些数据突显了一种以前未确定的机制，该机制调节DNA损伤后53BP1的募集，并揭示了核膜、DSB修复和基因组稳定性之间的另一种联系。

结果

拉明B1过度表达导致DSB积累，并对基因毒性应激更敏感

拉明B1在人转化成纤维细胞中过度表达，48小时后，在暴露于基因毒性应激时测量细胞存活率。辐射暴露后进行的克隆效率分析表明，与对照细胞相比，层粘连蛋白B1过度表达细胞的敏感性提高(图1A). 一致地，在IR上，层粘连蛋白B1过表达细胞的中期表现出明显较高水平的染色体异常，包括染色单体断裂(图1B). 在未受挑战的层粘连蛋白B1过度表达细胞中，染色体DSB数量增加(图1B)经γH2AX病灶定量证实(图1C). 当层粘连蛋白B1过度表达2到5倍时，γH2AX病灶增加，这一水平与在ADLD或肿瘤细胞中观察到的水平相当(图1C). Western blotting也检测到γH2AX水平的增加并进行定量(图1C). 与对照细胞相比，层粘连B1过度表达细胞中IR诱导的γH2AX病灶消失的动力学较慢，这与DSB修复缺陷一致。照射3小时后，65%和80%的γH2AX病灶持续存在于层粘连B1过度表达细胞中（分别是2到5倍的过度表达和>5倍的过量表达），而不到25%的γH2AX病灶持续存在对照细胞中(图1D). 放射后3小时中期（未激发细胞和IR）断裂的量化和γH2AX病灶的分析表明，层粘连蛋白A的过度表达也会触发DNA损伤持续性（图S1、A和B）。MDC1蛋白参与DDR的第一步，通过γH2AX与DSB结合，是53BP1招募所必需的(45,46). 与对照细胞相比，在层粘连蛋白B1过表达的细胞中也观察到IR诱导的MDC1病灶的消失减少（图S2）。这些数据表明，γH2AX和MDC1募集下游的层粘连B1失调触发了DSB修复缺陷。

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增强了层粘连B1过度表达细胞的遗传毒性应激敏感性和增加了DSB的形成。

(A类)γ射线照射后对照组（Ctrl）和层粘连蛋白B1过度表达细胞（LMNB1）的克隆存活曲线。转染48小时后，细胞被镀（每孔六孔板100、500、1000或2000个细胞）并照射（Cs137、0.5、1或2 Gy，1.77 Gy/min；iBL637辐照器）。8至11天后，细胞集落被龙胆紫染色并计数。多个t吨测试P（P）值*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005. (B类)在细胞收获前24小时，在基础条件（NI）或照射（2Gy）下，对层粘连蛋白B1过表达细胞或对照细胞制备的中期铺展中的染色体畸变进行评分。柱状图显示每个中期的平均染色单体断裂数[n个=89（控制，NI）n个= 98; （LMNB1，NI）；n个=94（Ctrl，IR）；和n个=94（LMNB1，IR）]。左图显示了层粘连蛋白B1过度表达细胞中染色体的染色单体断裂示例。(C类)转染48小时后，对对照细胞和层粘连B1过度表达细胞的基础γH2AX病灶和蛋白质水平进行分析。用Western blot（左上）分析γH2AX蛋白水平，并用ImageJ（右上）对三个独立实验进行定量。左下和右下面板分别显示了γH2AX病灶的代表性图像和免疫荧光染色定量。比例尺，10μm。(D类)对照（Ctrl）和层粘连蛋白B1过度表达（LMNB1）细胞照射（0.5 Gy）后IR诱导的γH2AX病灶动力学分析。利用Metamorph软件对四个独立实验中的γH2AX病灶进行计数。对于（C）和（D），层粘连蛋白B1过度表达的细胞分为两类：表达中度（高达五倍）或更高（超过五倍）层粘连肽B1的细胞。对于（B）、（C）和（D），未成对t吨测试P（P）值*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005; ***P（P）< 0.0001. 误差线，SEM。

Lamin B1过度表达改变NHEJ效率

然后，我们确定是否NHEJ修复DSB的缺陷会导致DSB对基因毒剂的敏感性和照射后DSB的持续存在。为此，将含有染色体内底物的细胞与编码巨核酶I-SceI和层粘连蛋白B1的载体共转染，以测量NHEJ事件(图2A). 如前所述，通过流式细胞术测量CD4表达可监测NHEJ诱导的I-SceI诱导的DSB的修复频率(2,16,47–49). 在I-SceI表达后，Lamin B1过度表达导致CD4阳性细胞的频率降低了两倍(图2B). 层粘连蛋白B1过度表达后的I-SceI水平与用空载体转染的细胞中的水平相当(图2A，右侧）。这些数据表明，层粘连蛋白B1过度表达抑制NHEJ。层粘连蛋白可能在基因表达中起作用(23)在层粘连B1过度表达后，通过Western blot检测NHEJ途径必需蛋白（KU70、KU80、DNA-PKcs、XRCC4和连接酶IV）的表达水平。在层粘连蛋白B1过度表达的细胞中没有观察到这些蛋白质水平的变化（图S3A）。

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Lamin B1过度表达降低NHEJ效率。

(A类)染色体内底物（左）：报告基因编码膜抗原H2Kd和CD4。在巨核酶I-SceI表达之前，CD4距离CMV启动子太远，无法表达。I-SceI位点位于含有H2Kd基因的片段侧面。经I-SceI巨核酸酶切割后，DNA末端的重新连接可导致CMV启动子与CD4片段直接连接，从而通过流式细胞术监测CD4的表达。Western blot分析（右）显示层粘连蛋白B1过度表达，I-SceI和I-SceI+LMNB1条件下的I-Sce1表达水平相等。(B类)对照组和层粘连蛋白B1过度表达细胞中的NHEJ事件频率。CD4阳性细胞荧光激活细胞分选定量（NHEJ事件）的一个例子显示在对照和层粘连蛋白B1–过表达细胞中（左）。NHEJ事件的频率（CD4+)在层粘连蛋白B1中，相对于对照细胞（I-SceI）过度表达的细胞（I-SceI+LMNB1）如右图所示（双尾Mann-Whitney试验**P（P）< 0.005). 这些值对应于14个独立实验。异硫氰酸荧光素；PE：藻红蛋白。

拉明B1过度表达改变损伤部位的53BP1募集

53BP1蛋白在控制DSB修复中起着重要作用，并通过抑制双链DNA末端的切除来支持NHEJ。拉明B1过度表达以剂量依赖的方式触发53BP1 IR诱导的病灶（IRIF）形成的减少(图3A). 分析了下游RIF1蛋白的53BP1依赖性募集对DNA损伤的影响，RIF1蛋白与防护蛋白复合物在保护DSB免受切除中起关键作用。符合53BP1招募缺陷，图3B显示照射后RIF1病灶形成缺陷。

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拉明B1过度表达阻碍53BP1募集到DNA损伤位点。

(A类)用空（Ctrl）或层粘连蛋白B1表达载体转染细胞中53BP1病灶的辐照后动力学。顶部面板显示了照射后30分钟（2 Gy）53BP1病灶的代表性图像，通过免疫荧光染色显示。用Metamorph软件对对照细胞（Ctrl）和层粘连B1过度表达细胞中的三个独立实验中的53个BP1病灶进行计数，并将其分为两类：中度染色（达到层粘连B15水平的5倍）或染色更高（超过5倍）的层粘连B1水平（底部）。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。(B类)辐射后用空（Ctrl）或层粘连蛋白B1表达载体在转染细胞中形成RIF1病灶。放射后1小时（5 Gy）RIF1病灶的代表性图像，通过免疫荧光染色显示在顶部。使用Cell Profiler和KNIME软件从三个独立的实验中对对照细胞（Ctrl）和层粘连B1过度表达细胞中的RIF1病灶进行计数（底部）(C类)仅用53BP1-GFP表达载体（Ctrl）或53BP1-GFP表达载体和Ds-Red层粘连蛋白B1表达载体（LMNB1）转染U2OS细胞后，激光微照射后53BP1的招募动力学。用405-nm激光对细胞进行微照射，并在75分钟内收集图像，以跟踪53BP1的招募（上图）。然后使用NIS-Elements软件（底部）测量断裂处的GFP强度。这些值对应于三个独立的实验。红线：照射区域；白线：比例尺。未付款t吨测试P（P）值*P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.0001. 误差条，SEM。比例尺，10μm。

为了解释层粘连蛋白B1的过度表达是否会影响53BP1的表达或稳定性，我们通过Western blot测定了53BP1蛋白的表达水平。拉明B1过度表达不会影响53BP1的蛋白水平（图S3B）；因此，与在LMNA公司−/−单元格(30,31). 然而，为了排除层粘连蛋白a水平的潜在变化，我们在层粘连B1失调后测量了层粘连蛋白质a/C的水平，我们没有观察到任何差异（图S3C）。这些数据表明，层粘连蛋白B1诱导的53BP1募集受损导致DNA损伤与层粘连a和层粘连C蛋白的变化无关。据报道，核孔蛋白NUP153缺失后，53BP1核导入的差异导致DNA损伤位点的缺陷补充和NHEJ缺陷(50). 然而，层粘连蛋白B1失调后，53BP1的细胞定位没有观察到差异（图S3D），与最近报道的层粘连蛋白A前过度表达形成对比(32). 总之，这些观察结果表明，层粘连蛋白B1过度表达导致53BP1病灶形成缺陷，这既不是由于53BP1蛋白表达/稳定性缺陷，也不是由于其进入细胞核的缺陷。

接下来，我们通过微辐射后的延时视频显微镜分析了53BP1对受损DNA的补充。绿色荧光蛋白（GFP）-53BP1和DsRed层粘连蛋白B1在U2OS细胞中共表达。48小时后，对细胞进行微辐射，并使用实时显微镜进行监测。然后，对GFP-53BP1募集到激光轨道进行分析。与对照细胞相比，DsRed层粘连B1阳性细胞的GFP水平较低(图3C)证实了层粘连蛋白B1过度表达导致53BP1募集到DNA损伤部位的缺陷。请注意，激光轨迹上没有显示层粘连蛋白B1染色/存在，这表明DNA损伤后，层粘连基因B1不会参与DNA损伤。

总之，这些观察结果表明，层粘连蛋白B1过度表达导致53BP1募集到损伤部位的缺陷。然而，与已发表的前层粘连蛋白A表达数据相比，层粘连基因B1表达引发的53BP1募集对DNA损伤的改变并不是由于53BP1蛋白表达/稳定性缺陷或导入细胞核所致，这表明所涉及的分子机制不同于由层粘连蛋白A失调诱导的分子机制。

拉明B1与53BP1蛋白相互作用

已经证明，层压板通过隔离蛋白质来调节转录因子等蛋白质的活性(51). 由于在层粘连蛋白B1过度表达时未观察到53BP1表达或核导入缺陷，我们假设层粘连基因B1可能与53BP1相互作用，从而在DNA损伤后调节其活性/募集。免疫沉淀分析表明内源性层粘连蛋白B1与内源性53BP1共沉淀(图4A). 此交互未受影响(图4A和图S4A），从而表明层粘连B1和53BP1蛋白不会通过DNA桥接共沉淀。层粘连B1–53BP1相互作用通过邻近连接分析（PLA）得到进一步证实，该分析允许可视化和量化原位相互作用（在邻近蛋白质之间）。里面的红点图4B对应于层粘连B1和53BP1之间的原位内源性相互作用。小干扰RNA（siRNAs）对53BP1或层粘连蛋白B1的消亡强烈影响PLA点的频率，证明了检测信号的特异性(图4B和图S4C）。相反，在层粘连蛋白B1过度表达后，观察到更多的聚乳酸点，反映了相互作用的增加(图4C). 接下来，研究了相互作用的局部化。图4D图S5A显示PLA点位于核内部和核外围。然而，根据层粘连蛋白B1的过度表达水平，PLA点的数量在外周显著增加（50-65%，而没有过度表达的为30%）。这表明当层粘连蛋白B1过度表达时，53BP1（至少一部分）可以被隔离在核膜（NE）。

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53BP1与层粘连蛋白B1相互作用。

(A类)内源性层粘连蛋白B1和53BP1的免疫共沉淀。在（−）或（+）苯甲酸酶处理之前或之后，将来自细胞裂解物的蛋白质与兔抗层粘连蛋白B1或IgG抗体进行免疫沉淀，作为对照。用小鼠抗53BP1抗体和兔抗层粘连蛋白B1抗体显示共免疫沉淀蛋白。在四个独立的实验中证实了层粘连蛋白B1和53BP1的协同免疫沉淀。(B类)内源性53BP1和层粘连蛋白B1之间的原位相互作用。用对照siRNA（siCtrl）、针对层粘连蛋白B1 mRNA的siRNA特异性（siLMNB1）或针对53BP1 mRNA的特异性（si53BP1，）转染细胞，并使用抗53BP1和层粘连肽B1抗体对其进行PLA处理。内源性53BP1和层粘连蛋白B1之间的原位相互作用示例显示为红色荧光点（左）。显示了每个细胞核的PLA点的量化(n个>每种情况分析100个核）（右）。(C类)层粘连蛋白B1过度表达后53BP1和层粘连B1蛋白之间的原位相互作用。用空载体（Ctrl）或层粘连蛋白B1表达载体（LMNB1）转染的细胞用抗53BP1和层粘连肽B1抗体进行PLA处理。53BP1和层粘连蛋白B1之间的原位相互作用示例显示为红色荧光点（左）。显示了每个细胞核的PLA点的量化(n个>每种情况分析400个核）（右）。(D类)53BP1和层粘连蛋白B1相互作用的原位定位。用空载体（Ctrl）或层粘连蛋白B1表达载体（LMNB1）转染的细胞用抗53BP1和层粘连肽B1抗体进行PLA处理。在三到四个独立实验中，计算核膜或细胞核内部的PLA点，并以每细胞总PLA点的百分比表示。与内源性水平相比，拉明B1过度表达水平可分为三类：1至2倍、2至5倍或5至10倍（强度类别分别为1至2、2至五或5至十）。误差条，SEM。比例尺，10μm。未付款t吨测试P（P）值*P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.0001. ns，不显著。

以前曾报道过层粘连蛋白A和53BP1之间的协同免疫沉淀(31); 然而，没有迹象表明这种互动是否是直接的。我们证实了这些蛋白质通过PLA相互作用，至少在很近的范围内。层粘连蛋白A和53BP1之间的这种相互作用受层粘连蛋白质B1缺失的影响，并因层粘连蛋白酶B1过度表达而增加（图S5、B和C），这可能表明层粘连酶B1在这种相互作用中发挥作用。分析了层粘连蛋白A和53BP1之间相互作用的定位。PLA点在内源性条件下定位于核质或核外周，并且在层粘连蛋白A过度表达时不会重新定位到外周（过表达水平与层粘连B1相当（2-5倍或>5倍）（图S5D）。因此，与层粘连蛋白B1过表达情况相反，层粘连A过表达后，53BP1似乎没有重新定位或隔离到NE。

DNA损伤后，层蛋白B1和53BP1解离

在未激发的细胞中观察到内源性层粘连蛋白B1和53BP1蛋白之间的相互作用(图4，A和B)表明这种相互作用具有生理作用。接下来，我们研究了DNA损伤情况下这种相互作用的命运。为此，PLA在2-Gy照射后的不同时间监测层粘连B1和53BP1之间的相互作用。照射30分钟后，在对照细胞中检测到PLA点减少(图5A，左）。值得注意的是，该时间对应于这些细胞中最大53BP1焦点聚集的时间（比较图5A和​和3A）。3A级). 这些数据表明，层粘连蛋白B1和53BP1之间的相互作用在基础条件下预先存在，但在照射后，当受损部位需要53BP1时，相互作用被中断。当层粘连蛋白B1过度表达时，在30分钟时不再观察到层粘连基因B1–53BP1相互作用的分离(图5A，右侧）。此外，图S6A显示（剩余的）层粘连B1–53BP1 PLA点和53BP1病灶之间没有共定位，这表明层粘连B1-53BP1之间的相互作用在DNA断裂时没有共定位并且层粘连B_1调节损伤距离处53BP1的募集。因此，这些数据强烈表明，照射后必须抑制层粘连蛋白B1和53BP1之间的基础相互作用，以使53BP1能够补充到DNA损伤部位。然而，较高水平的层粘连蛋白B1会阻碍53BP1从层粘连蛋白质B1中分离出来，随后会损害53BP1向DNA损伤位点的募集。这一假设与观察到的53BP1病灶形成动力学和53BP1募集到DNA损伤位点的缺陷高度一致，如上述数据所示(图3).

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53BP1–层粘连B1相互作用在照射后分离。

(A类)DNA损伤后层粘连蛋白B1–53BP1相互作用的命运。来自三个独立实验的照射（2Gy）后内源性相互作用的PLA动力学的量化（左）。三个独立实验（右图）对照射后（2 Gy）层粘连蛋白B1过度表达的PLA动力学进行量化。(B类)ATM活性抑制对IR诱导DNA损伤后53BP1–Lamin B1解离的影响。用ATM抑制剂（ATMi，+）或载体（−）处理的细胞裂解液中的蛋白质在照射前（NIR）或照射后1小时（2 Gy）用兔抗层粘连蛋白B1或IgG抗体进行免疫沉淀，作为DNAse处理的对照。用小鼠抗53BP1抗体和兔抗层粘连蛋白B1抗体（左）通过Western blot显示共免疫沉淀蛋白，并通过四个独立实验（右）进行量化。(C类)53BP1 N末端磷酸化对IR后层粘连蛋白B1和53BP1分离的影响。53BP1敲除细胞转染WT 53BP1载体（53BP1 WT）或28A突变53BP1质粒（53BP128A）后，在照射前（NIR）或照射后1小时（2 Gy）用抗53BP1和层粘连素B1抗体接受PLA。53BP1结构体和层粘连蛋白B1之间的原位相互作用示例，显示为红色荧光点（左）。图中显示了三个独立实验中每个核的PLA点的量化（右）。对于（B）和（C），照射后层粘连蛋白B1–53BP1结合的百分比归一化为相应的未照射条件。误差条，SEM。比例尺，10μm。未付款t吨测试P（P）值**P（P）< 0.005; ***P（P）< 0.0001.

正如之前报道的那样，拉明A–53BP1相互作用在损伤后也会分离(31). 然而，层粘连蛋白A的过度表达并不妨碍其与53BP1的分离（图S6B）。这也表明，与层粘连蛋白B1过度表达触发的机制不同，层粘连素A过度表达通过不同的机制阻止53BP1募集到DNA损伤中（图S6C）。

由于在暴露于IR后不久，层粘连蛋白B1和53BP1之间的相互作用减弱，这表明DDR可能参与了这种相互作用的破坏。因此，我们分析了ATM激活对这些蛋白质之间解离的影响。免疫共沉淀分析证实照射后层粘连蛋白B1和53BP1之间的相互作用减少(图5B和图S7A）。尽管在未经照射的情况下，在ATM抑制剂上观察到与层粘连蛋白B1免疫共沉淀的53BP1减少（图S7A），但在有ATM抑制剂的情况下在IR后，层粘连分子B1和53BP1之间的相互作用水平仍然较高（与未经ATM抑制剂照射后相比）。辐射前后相互作用无差异(图5B和图S7A），表明ATM信号可能在相互作用的分离中起作用。

此外，53BP1被ATM磷酸化以响应DSB，其N-末端区域包含28个Ser/Thr-Gln（S/T-Q）残基，这些残基是ATM的已知靶位点(52,53). 在未受挑战的条件下，在表达野生型（WT）53BP1或28A不可磷酸化突变体53BP1的53BP1缺陷细胞中证实了53BP1与层粘连B1的相互作用(图3G). 进行PLA实验，分析WT 53BP1和28A突变53BP1表达水平相当的细胞。IR后WT 53BP1–层粘连B1 PLA点显著减少，证实了层粘连B1-53BP1之间的分离(图5C和图S7B）。出乎意料的是，与WT 53BP1–层粘连B1相比，在未经辐照的情况下观察到28A突变53BP1-层粘连B1-PLA点减少（图S7B）。然而，照射后，含有28A突变体53BP1的层粘连蛋白B1 PLA点的数量仍然比用WT 53BP1获得的数量更多。辐射前后，层粘连蛋白B1与突变53BP1的相互作用没有差异(图5C和图S7B）。这些数据可能表明，53BP1磷酸化可能是其在IR后有效解离所必需的。

拉明B1直接与53BP1的最小区域相互作用，该区域是DNA损伤所必需的

由于层粘连蛋白B1可以通过其相互作用影响53BP1向受损染色质的募集，我们旨在通过首先确定53BP1与层粘连蛋白质B1相互作用的结构域来进一步表征后者。谷胱甘肽S公司-使用不同纯化截短53BP1结构的转移酶（GST）下拉分析表明，层粘连蛋白B1直接与53BP1片段（从氨基酸1222到1659）相互作用(图6A). 这对应于DNA损伤所需的53BP1的最小区域（IRIF域）(54)，包括都铎和泛素化依赖性募集（UDR）结构域，这是允许53BP1与组蛋白修饰结合的关键结构域。在受损的染色质处，53BP1分别通过其Tudor和UDR结构域与组蛋白H4的二甲基化赖氨酸20（H4K20me2）和组蛋白H2A的泛素化赖氨酸15（H2AK15ub）相互作用(46,55,56). 因此，我们在人成纤维细胞中表达了53BP1的IRIF结构域。图6B表明该结构域与内源性层粘连蛋白B1共同免疫沉淀。PLA也在现场检测到这种相互作用(图6C). PLA点的定位可以在核外围清晰地可视化。与GST下拉分析和联合免疫沉淀结果一致，与其他转染53BP1片段相比，IRIF结构域53BP1的每个核中PLA点的数量在统计学上显著增加(图6D和图S8A）。总之，这些结果证实了内源性层粘连蛋白B1和细胞内53BP1的IRIF结构域之间的相互作用。用53BP1片段（ΔOD-IRIF）转染的细胞与同一区域相对应，但缺乏其寡聚结构域（1222到1289残基之间的缺失），每个细胞核呈现同等数量的点，表明IRIF结构域在相互作用中的特定参与，而不是通过与内源性53BP1二聚体形成另一结构域。值得注意的是，这种互动似乎需要IRIF区域的完整性。当成纤维细胞中仅表达MDC1结构域（残基1288至1409）或Tudor-UDR区域（残基1410至1659）时，这种相互作用会发生很大改变。总之，我们的数据表明，层粘连B1对53BP1的隔离需要53BP1 IRIF结构域，该结构域与受损染色质的识别有关。

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53BP1直接与层粘连蛋白B1相互作用。

(A类)用于相互作用研究的GST-tagged 53BP1构建物方案（左）和纯化重组蛋白（GST-53BP1 N末端、GST-53BP 1 IRIF、GST-53 BP1 C末端、GST）的考马斯染色样品（中）。GST下拉实验检测到53BP1的层蛋白B1和IRIF结构域之间的相互作用。用GST或GST-53BP1片段孵育全长层粘连蛋白B1。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离形成的蛋白质复合物，并用抗层粘连蛋白B1抗体进行Western blot分析。左车道对应于这些下拉实验中使用的100 ng纯化全长层粘连蛋白B1（右）。(B类)来自用HA-53BP1 IRIF转染的SV40成纤维细胞的53BP1 IRIF和内源性层粘连蛋白B1的共免疫沉淀。顶部：用兔抗层粘连蛋白B1或IgG抗体作为对照对细胞裂解物中的蛋白质进行免疫沉淀，并用小鼠抗HA和兔抗层粘连蛋白B1抗体进行免疫印迹。底部：将细胞裂解物中的蛋白质与鼠抗HA或IgG抗体进行免疫沉淀，并用鼠抗HA和兔抗层粘连B1抗体进行免疫印迹。顶部和底部面板加载相同的输入（用于共免疫沉淀的相同提取物）。(C类)HA-IRIF 53BP1和层粘连蛋白B1之间具有代表性的PLA，阴性对照使用两种抗体中的任何一种。比例尺，10μm。(D类)内源性层粘连B1和53BP1构建物之间的HA标记53BP1构造物（左）和PLA的方案（右）。用表达不同HA-53BP1结构域的载体转染的细胞在48小时后固定。然后使用针对层粘连蛋白B1和HA的抗体执行PLA。未付款t吨测试值***P（P）< 0.0001. 抗体。

53BP1与层粘连蛋白B1的相互作用控制其向受损DNA的募集

为了评估层粘连蛋白B1过度表达后53BP1募集的缺陷是否是由于53BP1隔离所致，我们确定了层粘连基因B1与53BP1相互作用的区域。

体外GST下拉，使用各种纯化截短的层粘连B1结构(图7A)，表明层粘连蛋白B1的N末端部分，更准确地说是头部线圈1结构域（氨基酸1到243），与53BP1的IRIF结构域直接相互作用(图7B). 相反，层粘连B1的Coil 2结构域（氨基酸244至424）和C末端部分（氨基酸398至586）不与53BP1 IRIF结构域重复相互作用。

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层粘连蛋白B1与53BP1相互作用域的鉴定。

(A类)用于GST下拉实验的层粘连蛋白B1构建方案（左）和用于相互作用研究的纯化重组蛋白考马斯染色样品（右）。(B类)GST下拉实验检测到拉明B1的头部线圈1结构域与53BP1的IRIF结构域之间的相互作用。IRIF 53BP1与GST或GST-层粘连B1结构在苯甲酸酶存在下孵育，形成的蛋白复合物用10%SDS-PAGE分离，并用抗53BP1抗体进行Western blot分析。左车道对应于这些下拉实验中使用的100 ng纯化IRIF 53BP1。星号对应于非特异性捕获GST-Coil2抗体。(C类)内源性53BP1和Flag–lamin B1构建物之间的PLA：在五个独立实验中，使用Cell Profiler和KNIME软件计算Flag表达细胞中的PLA点。单因素方差分析（ANOVA）检验：*P（P）< 0.05 (D类)拉明B1和内源性53BP1的旗头线圈1结构域的免疫共沉淀。将转染Flag–Lamin B1结构的SV40-成纤维细胞的细胞裂解产物中的蛋白质用兔抗Flag标签或IgG抗体进行免疫沉淀，并用小鼠抗53BP1和兔抗Flug标签抗体进行免疫印迹（左）。三个独立实验的量化（右）。未付款t吨测试值**P（P）< 0.005. 误差线，SEM。

我们的目的是通过另一种方法在细胞中证实层粘连蛋白B1区域与53BP1相互作用。为此，表达不同层粘连B1片段的载体首先在人成纤维细胞中表达(图7A以及图S8B），并且通过PLA测试它们与内源性53BP1的原位相互作用。与转染层粘连蛋白B1的Coil 2结构域（氨基酸244至424）和PLA阴性对照组的细胞相比，转染层黏连蛋白B1 N末端区域（氨基酸1至424(图7C). 接下来，我们表达了不含该相互作用域的Flag-Head-Coil 1结构域或Flag-lamin B1。在Flag-Head-Col1的免疫沉淀中，Western blot显示内源性53BP1。相反，在Delta-Head-coil1层粘连B1免疫沉淀中几乎检测不到53BP1(图7D). PLA实验证实了这一结果。与53BP1-HeadCoil1域点相比，对应于53BP1-delta Head-Coil1的PLA点编号非常低（图S8C）。这些结果证实了GST下拉获得的数据，并表明包含层粘连B1的头部和线圈1结构域的区域足以与细胞中的53BP1相互作用。

然后，为了进一步证实层粘连B1–53BP1相互作用是层粘连B1-53BP1过度表达时观察到的53BP1病灶减少的关键，我们分析了层粘连B_1最小相互作用域（Head-Coil1）的表达和缺乏其相互作用域的层粘连b_1的表达（Δ-Head-Cool1）时53BP1灶的形成。我们观察到层粘连蛋白B1相互作用结构域（Head-Coil1）的表达模拟了过度表达的全长层粘连蛋白B1蛋白的作用，并导致53BP1病灶的减少(图8A和图S9）。相反，缺乏相互作用域的层粘连B1蛋白（Δ-Head-COL1）的表达对53BP1病灶的形成没有影响。我们通过Western blot（图S8B）验证了缺乏该区域的全蛋白、Head-Col1结构域和层粘连B1的相对表达是等效的，并且在具有不同层粘连B1-结构的可比较表达（通过免疫荧光测量）的细胞中量化了53BP1病灶的数量（图S9）。总之，我们的数据表明，层粘连蛋白B1直接与53BP1 IRIF结构域相互作用，参与受损染色质的识别，并表明层粘连基因B1的过度表达通过捕获53BP1影响53BP1的募集而受损。为了研究层粘连蛋白B1螯合53BP1对DNA损伤持久性的影响，我们分析了IR后γH2AX病灶的持久性，以及层粘连蛋白B1的相互作用结构域或缺乏与53BP1相互作用结构域的层粘连蛋白B1表达时中期的断裂数(图8、B和C). 相互作用域的表达模拟了完整层粘连蛋白B1表达的影响：γH2AX病灶的持续存在和中期DNA断裂数量的增加。相反，缺乏相互作用域的层粘连蛋白B1也不会引起显著的DNA损伤持续性，通过γH2AX病灶的测量也可以观察到(图8B)或每个中期的破裂次数(图8C). 这些数据表明，层粘连蛋白B1对53BP1的隔离是层粘连基因B1失调后DNA损伤持续存在的关键。

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层粘连蛋白B1–53BP1相互作用是层粘连素B1过度表达后观察到的53BP1募集缺陷的关键。

(A类)照射后30分钟（2 Gy），层粘连蛋白B1相互作用域对辐射诱导的53BP1病灶的影响。使用ImageJ软件对Flag-expressing细胞中的53BP1病灶进行计数，并根据四个独立实验中细胞核（右侧）的Flag-eexpression水平将每个细胞核的病灶划分为三类。单向方差分析测试：*P（P）< 0.05. (B类)层粘连B1相互作用域表达后持续γH2AX病灶动力学分析。使用ImageJ软件计算Flag-expressing细胞中的γH2AX病灶，并绘制类似Flag-eexpression水平的细胞图。直方图显示了三到四个独立实验中辐射诱导病灶在照射后持续3小时（0.5 Gy）的百分比。(C类)在细胞收获前24小时，在基础条件（NI）或照射（2 Gy）下，对表达细胞或对照细胞的Flag–Lamin B1结构制备的中期扩散进行染色体畸变评分。柱状图显示每个中期的平均染色单体断裂数(n个=199至425）。P（P）与匹配的NIR或IR“空向量”数据集相比，该条以上的值。(D类)层粘连蛋白B1控制53BP1募集的模型。在未受挑战的细胞中，53BP1通过其最小病灶形成区域（包括Tudor域和UDR域）与层粘连蛋白B1相互作用。我们的数据表明，在DNA损伤时，这些蛋白质之间发生ATM活性依赖性解离，从而使53BP1能够被募集到受损的染色质中。然而，在层粘连蛋白B1过度表达的情况下，53BP1被隔离，其向受损染色质的募集被阻止。对于（B）和（C），未配对t吨测试P（P）值*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005; ***P（P）< 0.0001. 误差线，SEM。

讨论

DSB站点的53BP1招募对于其在DDR中的功能至关重要，必须进行精细控制。53BP1在DSB修复途径选择中起关键作用；然而，不受控制的53BP1结合或补充到损伤部位会导致基因不稳定(18,19). 已经描述了53BP1与受损染色质结合的几种复杂机制(20). 这种相互作用所需的53BP1的最小区域包括其都铎结构域和UDR基序。一旦染色质受损，53BP1通过其Tudor结构域与H4K20me2结合，通过UDR基序与H2AK15Ub结合(46,55,56). DSB诱导后，RNF8和RNF168蛋白通过JMJD2A和L3MBTL1蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解，揭开H4K20me2，在53BP1向受损染色质的募集中发挥重要作用(57–59). 此外，各种翻译后修饰参与了53BP1募集对DNA损伤的调控。UDR基序磷酸化已被证明可以阻止有丝分裂染色质中53BP1与H2AUb的结合，从而避免染色体分离期间的遗传不稳定性(18,19). 然而，有新的数据表明，在距离受损染色质较远的地方也有控制53BP1的机制。

我们的结果揭示了层粘连蛋白B1直接与53BP1区域相互作用，该区域包括Tudor和UDR结构域（IRIF结构域），53BP1与受损染色质相互作用并控制其募集(46,55,56). 这些数据表明，除了隔离53BP1外，层粘连蛋白B1还可以掩盖53BP1区域，该区域是其向受损染色质募集所必需的。然而，我们无法检测到DNA损伤时层粘连蛋白B1的任何募集，层粘连肽B1–53BP1 PLA点似乎没有与53BP1病灶共定位，这表明层粘连素B1在距离损伤较远的地方可以控制53BP1的募集。最近的报告表明，TIRR蛋白与53BP1的IRIF结构域结合，并控制53BP1对DNA损伤的补充（也在DNA损伤的距离上）(60,61). 这些数据以及我们的结果再次突出了IRIF结构域在诱导DNA损伤后53BP1调控中的关键作用。该结构域被诸如层粘连蛋白或TIRR蛋白（可能还被其他有待发现的蛋白）等蛋白质掩盖，从而控制53BP1到达损伤部位。IRIF结构域还负责与受损染色质的直接结合。此外，53BP1与G处DNA损伤结合2/M还受IRIF域翻译后修饰的调节(18,19). 最近，有研究表明，核骨架NuMA蛋白（被认为与核层粘连蛋白结构相关）也通过与53BP1蛋白的相互作用，在DNA损伤距离处控制53BP1的募集(62). 红外诱导DNA损伤后，53BP1与TIRR、NuMA或层粘连B1之间的相互作用被切断(18,19). TIRR蛋白最近被报道为53BP1-P53复合物的重要抑制剂，因此控制P53介导的细胞命运程序(63). 最近的研究表明，53BP1核隔间具有液-液相分离的特征(64,65). 相位分离调制也是调制53BP1功能的一种方式。最近的报告显示，AHNAK是一种支架蛋白，与G中的53BP1相互作用1也可以通过限制53BP1在染色质上的积累以及抑制53BP1的齐聚和相分离来调节p53依赖的细胞命运(66). 在DNA损伤的情况下，与层粘连蛋白B1相比，AHNAK和53BP1在染色质上的相互作用增强，可能限制了p53-P21的反应。层粘连蛋白与TIRR、Numa和AHNAK之间的潜在关系、竞争或串扰尚不清楚，需要进一步研究。

TIRR蛋白与53BP1的分离由ATM依赖的DDR控制，需要53BP1磷酸化。由于非磷酸化NuMA突变体表达后，53BP1在激光轨道上的募集被取消，因此也有人建议通过ATM进行NuMA磷酸化，以在DNA损伤后释放其53BP1相互作用(62). 我们的数据还表明，ATM也可能通过磷酸化53BP1来调节53BP1与层粘连B1的结合/分离。ATM的这种调节强烈加强了这些相互作用的生理重要性。

尽管我们的数据表明，53BP1磷酸化可以控制IR时层粘连蛋白B1和53BP1之间的解离，但我们不排除其他机制可能参与这些蛋白质之间的相互作用。因此，研究层粘连蛋白B1的一些翻译后修饰是否能够调节与53BP1的结合-解离将是一件有趣的事情。已经描述了层粘连蛋白B1的许多不同翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、乙酰化……）。在这篇手稿的修订过程中，已经发表并提出了层粘连蛋白B1的乙酰化可能参与53BP1在NE的定位，作者认为它可能在DSB修复（DSBR）机制之间的平衡中发挥作用(67). 对层粘连蛋白B1乙酰化可能负责的乙酰转移酶或脱乙酰酶对53BP1相互作用、DNA损伤持续性或基因组稳定性的影响可以进一步研究。

据报道，层粘连蛋白A缺陷会影响53BP1的稳定性(30)在层粘连蛋白B1过度表达后，我们没有观察到53BP1水平的任何变化。此外，我们还表明，层粘连蛋白B1诱导的53BP1募集对DNA损伤的损害与层粘连a和层粘连C蛋白的变化无关。在我们的研究中，我们确定了层粘连蛋白B1和53BP1蛋白之间的直接相互作用，并确定了相互作用域。缺乏其相互作用域的层粘连蛋白B1的表达不会影响IR后53BP1的募集或持续的γH2AX病灶，也不会影响中期观察到的断裂数量。总之，这些观察结果表明，层粘连蛋白B1过表达后53BP1募集的缺陷和随后的DNA损伤持续存在主要是由于层粘连蛋白B1直接螯合53BP1。

先前的研究表明，层粘连蛋白A和53BP1蛋白可以共同免疫沉淀(31). 在这里，我们通过PLA证实了这两种蛋白质之间的密切关系。目前还没有报道层粘连蛋白A是否能与53BP1直接相互作用。层粘连蛋白A和53BP1之间的相互作用似乎需要层粘连B1（或组织合理的层粘连B1-网络）的存在，因为我们发现，当PLA分析内源性层粘连A和53BP 1蛋白之间的原位相互作用时，层粘连B_1的缺失会减少点的数量（图S5B）。

我们在这里表明，层粘连蛋白A过表达导致53BP1募集缺陷和γH2AX所揭示的DNA损伤的持续存在，以及中期断裂的增加。然而，所涉及的机制似乎与我们在这里描述的层粘连B1过度表达后的机制不同。前层粘连蛋白A的过度表达对其与53BP1相互作用的定位没有影响（没有重新定位到NE），也不会阻止其在DNA损伤后与53BPl分离。这些数据表明，与层粘连B1的过度表达相比，层粘连A的过度表达并不会通过隔离机制阻止53BP1的募集，但可能是由于报道的53BP1转运到细胞核的缺陷所致(32). 已经建立了层粘连蛋白A和DNA修复之间的不同联系(68)因此，层粘连蛋白A失调的许多其他后果也可以解释DNA损伤的持续性(68). 也有人提出，层粘连蛋白A影响病灶稳定性，并可能与γH2AX相互作用(69)层粘连蛋白A的过度表达可能导致γH2AX信号延长。这也可以解释在层粘连蛋白A过度表达的情况下γH2AX的持续存在。

据报道，在层粘连蛋白B1缺失后，不同DNA修复基因的表达失调(33). 这些转录改变似乎也会导致DNA损伤处理的缺陷。相反，当层粘连蛋白B1过度表达时，我们发现NHEJ相关蛋白的表达没有差异。我们的数据表明，层粘连蛋白B1的过度表达并不是通过改变关键DNA/NHEJ修复基因的表达，而是通过隔离53BP1蛋白直接影响DSB修复。由于基因毒性治疗导致内源性53BP1与内源性层粘连B1分离，这种关联在生理上受到严格调控。总之，这些数据加强了这样一种观点，即控制层粘连蛋白B1水平对基因组稳定性特别重要，不仅在肿瘤发生过程中，而且在衰老或病理学（如HGPS）中。

DNA损伤的持续性被认为参与了HGPS中前体蛋白表达的有害影响。研究前体蛋白是否也能与53BP1相互作用来表征这种潜在的相互作用将是一件有趣的事情。我们的数据也提出了早衰患者中观察到的层粘连蛋白B1减少的潜在作用的问题(70)DNA损伤持续性。我们在此报告，层粘连蛋白A和53BP1之间的相互作用受层粘连蛋白质B1耗竭的影响。层粘连蛋白B1水平的降低可能对HGPS病理学中观察到的DNA损伤的持续性具有重要意义。因此，未来应进一步研究层粘连蛋白B1减少和潜在53BP1缺陷在早衰中的作用。

在许多肿瘤中观察到核形态改变和层粘连蛋白B1水平增加，似乎与肿瘤发生的高级程度和不良预后有关(40–44). 我们在这里表明，层粘连蛋白B1上调导致DSB积累，最终可能导致染色体重排和遗传不稳定，这两者都是肿瘤发生的标志。因此，我们很容易推测，层粘连蛋白B1的失调可能通过53BP1的隔离和/或DNA损伤的积累促进肿瘤的进展。在各种肿瘤中也观察到层粘连蛋白A的减少。由于组织蛋白酶L蛋白酶体途径活性增加，A型层粘连蛋白缺失导致53BP1失稳(71). 据报道，由于NUP153定位错误，前层粘连蛋白A的过度表达导致53BP1细胞质积累和随后的招募缺陷导致DNA损伤(32). 因此，A型或B型层粘连蛋白的失调通过53BP1的改变影响DNA损伤修复，而53BP1是通过不同的机制介导的。一方面，层粘连蛋白A失调通过降解或定位错误影响53BP1的水平，另一方面，当层粘连素B1过度表达时，会将53BP1隔离在修复部位之外。然后，在这两种情况下，层粘连蛋白的失调可能参与与肿瘤发生相关的遗传不稳定性。应该进行激动人心的未来研究，以直接解决这一假设。

总之，当前数据可以统一在以下模型中(图8D)在正常细胞中，在没有DNA损伤的情况下，层粘连蛋白B1与53BP1相互作用，可以作为53BP1的“蓄水池”，远离修复部位，但在应对基因毒性应激时很快可用。DNA损伤后，53BP1与层粘连蛋白B1分离，从而允许其快速补充受损的染色质。在过度表达（或与层粘连蛋白B1上调相关的病理情况）的情况下，层粘连肽B1会隔离53BP1，阻止其向DNA损伤部位募集。这种阻抗可能会影响染色体重排的频率，因此可能有助于肿瘤的演变。然而，由于53BP1缺乏和层粘连蛋白B1过度表达都会导致放射敏感性，层粘连蛋白B1水平的失调也可能是肿瘤的致命弱点。

材料和方法

细胞系

SV40转化的人成纤维细胞（GM0639细胞系）、U2OS和衍生细胞在37°C、5%CO、添加10%（v/v）胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和青霉素（200 IU/ml）的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长2U2OS 53BP1敲除（KO）由D.Durocher提供(6).

存活率测定

转染48小时后，将SV40转化的成纤维细胞以每孔100、500、1000或2000个细胞的速度培养。粘附后，用不同剂量的γ射线（iBL637辐照器；0.5、1或2 Gy，1.77 Gy/min）处理细胞，并在37°C下培养8至11天，然后用龙胆紫染色和菌落计数。

表达不同53BP1和Lamin B1片段载体的构建

根据要进行的实验，我们制作了两组构造。对于体外直接相互作用试验，使用Gateway技术（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）通过定点重组克隆人53BP1（53BP1）或人层粘连蛋白B1（层粘连素B1）的不同结构域。在体内实验中，通过序列和连接无关克隆（SLIC）或限制性连接克隆层粘连B1和53BP1的结构域。使用特异引物（表S1）通过聚合酶链反应（PCR）扩增待克隆的开放阅读框（ORF）。简而言之，对第一组构建物进行了两次连续PCR反应。第一次PCR是用模板特异的前向引物进行的，该引物携带了烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶识别位点编码序列，用于进一步切割。第二次PCR使用正向通用引物进行，包括自动变速箱B1重组位点序列。第一组的两个PCR均使用模板特异性反向引物进行，包括自动变速箱B2重组位点。通过BP反应对所得PCR产物进行重组，以生成用于进一步LR反应（第一组结构体）或通过限制性连接释放插入结构域（第二组结构物）的入口克隆。对于第二组构建物，使用序列特异性引物扩增将由SLIC克隆的ORF，引物在5′端和3′端延伸，引物具有修改后的pcDNA3载体的同源序列，然后进行SLIC克隆。所有PCR均按照制造商的说明使用Phusion DNA聚合酶进行。扩增后，使用GeneJET PCR纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）纯化PCR产物。网关克隆是按照制造商的说明执行的。使用pDONOR207供体载体（生命技术）进行BP反应，使用pGGWA或pHGWA进行LR反应(72)分别针对53BP1片段或全长层粘连蛋白B1。所有引物均设计为具有T型米≈60°C。限制性内切酶来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州伊普斯威奇），抗生素来自西格玛阿尔德里奇（密苏里州圣路易斯）。使用GATC的通用T7引物（T7、pcDNA3.1-RP/1、pcDNA2.1-RF、pDONOR-FP和pDONOR-RP，取决于结构）验证所有结构的序列（表S2）。

Ds-Red层粘连蛋白B1表达载体描述于(73). 未标记的层粘连蛋白B1全长购自Origene（#SC 116661）。通过克隆pCMV6-XL4-LMNB1（#SC 116661，Origene）扩增的PCR产物（引物：下部：GGGTACCCTTTACATAATTGCACAGCTTAATTGGATGGTGGAAA；上部：CCGCTCGAGCTAGCCACCATGGACGAGAGAGAGACGACGAGACGAGCGCCGGCGACT-GCGACCCCGCGCGCGGCGGARGGCGCGCGCCGCGGCCCCCCCCCCACGCACGG）构建Flag–lamin B1进入pcDNA3-puromycin载体Xho I和Kpn I位点。

转染

对于各种实验，1.8×105转染前1天进行细胞培养。在制造商规定的条件下，使用jetPEI转染试剂转染SV40成纤维细胞和53BP1 KO U2OS细胞（息肉转染），使用Lipofectamine转染U2OS电池（Lipofectamine 2000，Life Technologies）。对于修复病灶分析、邻近结扎和存活分析，3×10−13在治疗和/或固定前48小时，用mol的p-CMV-LMNB1质粒或等量的不同53BP1或LMNB1构建物、WT 53BP1质粒或28A突变53BP1（Addgene）质粒或空质粒转染细胞。为了进行NHEJ定量测定，通过用7.5×−13pCMV–血凝素（HA）–I-SceI质粒的摩尔数，以及2.5×10−13p-CMV-LMNB1质粒（层粘连蛋白B1过度表达）或空质粒（对照条件）的摩尔数。将1.5μg GFP-53BP1质粒和1.5μg DsRed-LMNB1质粒或空质粒转染用于微辐射实验的U2OS细胞。在PLA分析中，在制造商规定的条件下，使用上述质粒或20μM特异性siRNA转染细胞至层粘连B1、层粘连A或53BP1（ON-TARGET+SMARTpool、Dharmacon）或使用干扰素（Polyplus Transfection）的对照siRNA（NEG05，Eurogentec）。

非同源末端连接分析

含有pCOH-CD4染色体内NHEJ底物的SV40转化人成纤维细胞系（GC92）图2用于确定NHEJ频率，如前所述(48). 简单地说，在转染后72小时，在含有20 mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中收集细胞，然后在PBS中清洗（不含Ca2+)并在室温下用2%（w/v）多聚甲醛在PBS中固定20分钟。用PBS和2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）饱和细胞15分钟后，用0.5μg抗CD4–荧光素异硫氰酸盐（FITC）或抗CD4-Alexa Fluor 647抗体（BD Pharmingen）染色45分钟。在荧光激活细胞分选分析之前，细胞在PBS中清洗两次。

细胞分馏

在含有1 mM Hepes、10 mM KCl、1.5 mM MgCl的缓冲液中培养，从SV40转化的成纤维细胞中提取细胞溶质蛋白2，0.5 mM二硫苏糖醇（DTT），0.1%Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）在4°C下放置10分钟，然后在5000下离心克在4°C下保持2分钟。核部分是通过在tris缓冲液中提取剩余颗粒获得的【10 mM tris（pH 7.5）、1%十二烷基硫酸钠、蛋白酶和磷酸酶抑制剂】。

蛋白质印迹分析

SV40转化的成纤维细胞在含有10 mM tris（pH 7.5）、1%十二烷基硫酸钠、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液中溶解。我们使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或3%至8%NuPAGE三醋酸凝胶（对于大蛋白，如53BP1）将变性蛋白提取物（25至50μg）分离，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用以下一级抗体探测膜：抗层粘连蛋白B1（兔子，ab16048，Abcam）、抗53BP1（兔子，#4937S，细胞信号）、抗HA（小鼠，MMS-101P，Covance）、抗γH2AX（小鼠，#05636，Upstate）、抗肌动蛋白（兔子，057 K4803，Sigma-Aldrich）和抗长春碱（小鼠，ab18058，Abcam）。使用增强化学发光检测试剂盒（EZ-ECL，Biological Industries）可视化免疫反应性，并使用ImageJ软件量化信号。对于GST下拉实验，为了控制siRNA缺失和片段或GFP标记的构建物的表达，我们使用了二级荧光抗体[抗兔IR800（R-05060）、抗兔IR700（R-05054）、抗鼠IR800（R-05061）和抗鼠IR700（R-05055），DIAGOMICS]。使用Odyssey成像仪（LI-COR Biosciences）采集荧光信号，并使用Image Studio软件（LI-COR Bioscinces）进行量化。

蛋白质纯化

His–Lamin B1和His-IRIF 53BP1

编码His-protein基因的基因被放置在载体pHGWAHsLaminB的T7启动子下，该载体被导入大肠杆菌菌株BL21（DE3）。0.5 mM异丙基-β诱导组氨酸蛋白表达-d日-硫代半乳糖苷（IPTG）。随后的所有蛋白质纯化步骤均在4°C下进行。收集细胞，将其重新悬浮在裂解缓冲液中[50 mM tris-HCl（pH 8）、500 mM NaCl、1 mM DTT、10%甘油、1×Triton X-100、溶菌酶（1 mg/ml）、1 mM4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟、10 mM苯甲脒和2μM胃蛋白酶]，并通过超声波进行破坏。提取物在186000下通过离心作用被清除克在4°C下保持1小时，然后补充咪唑（最终20 mM），然后加载到2 ml镍-硝基三乙酸（Ni-NTA）柱（Qiagen）上，该柱与50 mM三氯化氢（4°C时pH为8）和500 mM氯化钠平衡。用30 ml缓冲液A[50 mM tris-HCl（4°C时pH 8）、500 mM NaCl、1 mM DTT和20 mM咪唑]洗涤柱，然后用30 ml缓冲液B[50 mM tris-HCl（4°C时pH 8）、100 mM NaCl、1 mM DTT和20 mM咪唑]进行第二次洗涤。用含有500 mM咪唑的缓冲液B洗脱蛋白质。将含有His-protein的组分合并到1 ml Resource Q色谱柱中（GE Healthcare），与不含咪唑的缓冲液B平衡。用0.05至0.5 M NaCl的12 ml线性梯度洗脱蛋白质。纯化的His-protein储存于−80°C。

GST-53BP1片段纯化和GST–层粘连蛋白B1片段纯化

将IPTG诱导的T7启动子控制下的质粒pGGWAHs53BP1片段（含GST-53BP1融合基因）和质粒pGGWAHs层粘连蛋白B1片段（含有GST-层粘连肽B1片段融合基因）导入大肠杆菌菌株BL21（DE3）。隔夜培养物在LB中稀释100倍，并在37°C下培养至OD600（600 nm处的光密度）达到1。当时，将IPTG添加至0.5 mM，并在37°C下培养3小时。收集细胞；在50 mM三氯化氢（4°C时pH为8）、500 mM氯化钠、1 mM DTT、10%甘油、1×Triton X-100、溶菌酶（1 mg/ml）、1 mM4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟、10 mM苯胺和2μM胃蛋白酶抑制素中重新悬浮；并被声波干扰。提取物在186000时通过离心进行清除克在4°C下保持1小时，然后加载到1 ml谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare）色谱柱上，用缓冲液a[50 mM tris-HCl（4°C时pH为8）、500 mM NaCl、1 mM DTT、0.5 mM EDTA和10%甘油]进行平衡。在对色谱柱进行广泛清洗【40 ml缓冲液A，然后是80 ml缓冲液B（缓冲液A含有100 mM NaCl）】后，用洗脱缓冲液【50 mM三氯化氢（4°C时pH为8）、100 mM氯化钠、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、10%甘油和30 mM谷胱甘肽】洗脱GST蛋白。使用Vivaspin浓缩器浓缩含有GST蛋白质的组分，然后将其装载到与缓冲液B平衡的Superdex 75 10/300 GL（GE Healthcare）上。纯化的蛋白质储存在−80°C下。

GST下拉分析

将GST-53BP1片段（10μg）[GST-Nterm、GST-IRIF、GST-Cterm或GST-Nerm层粘连B1、GST-Head-COL1层粘连B1,GST-Coil2、GST-C层粘连B_1或GST（10μg/）]固定在20μl谷胱甘肽Sepharose 4B上的100μl缓冲液A[50 mM三氯化钠（4°C时pH为8）、150 mM氯化钠、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、10%甘油、2 mM MgCl中2和25 U苯甲酸酶]在4°C下保持120分钟。通过离心收集珠子，并用300μl缓冲液B（缓冲液A+0.05%NP-40）洗涤三次。然后添加His–lamin B1（100μl缓冲液B中10μg）或His-IRIF 53BP1（10μg。去除上清液，并用300μl缓冲液B将珠子洗涤两次。然后，通过添加30μl 50 mM三氯化氢（4°C时pH为8）、150 mM氯化钠、1 mM DTT和30 mM谷胱甘肽洗脱与珠子结合的蛋白质，通过Western blot分别使用抗层粘连蛋白B1抗体（ab16048，Abcam）或抗53BP1抗体（#4937S，Cell Signaling）测定洗脱液中是否存在His–层粘连素B1或His-IRIF 53BP1。

免疫荧光

转染后48小时，将生长在玻璃盖玻片上的SV40转化的成纤维细胞在4%（w/v）多聚甲醛中固定15分钟，并在PBS中洗涤三次，然后在PBS中将0.5%Triton X-100渗透15分钟。渗透后，用含0.05%吐温20的2%PBS-BSA在室温下饱和1小时。对于53P1病灶分析，将盖玻片在冰镇甲醇中固定5分钟，并在PBS中清洗三次，然后按照上述方法进行饱和。然后使用以下抗体在室温下用含有0.05%吐温20的PBS-1%BSA稀释90分钟进行免疫标记细胞：抗层粘连蛋白B1（兔，ab16048，Abcam），抗γH2AX（小鼠，#05636，Upstate）和抗MDC1（兔，ab11169，Abcam）。然后用分别与Alexa Fluor 488或594偶联的二级抗鼠或抗兔抗体探测细胞（生命科技）。在PBS中使用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；1μg/ml）进行反染色，并使用荧光固定介质（Fluoromount-g，Southern Biotech）固定载玻片。图像是在配备63倍物镜和CoolSNAP HQ2相机的徕卡DM5500上获得的，并使用MetaMorph软件（Molecular Devices）进行进一步处理。使用ImageJ软件或MetaMorph软件开发的内部脚本执行细胞核和病灶分割以及荧光测量的数字图像处理。根据层粘连蛋白B1的表达水平，转染的成纤维细胞被分为两类：与非转染细胞中的基本表达水平相比，表达中等（高达5倍）或更高（介于5倍和10倍之间）层粘连蛋白质B1的细胞。对于Flag–lamin B1片段过表达后形成的53BP1病灶，根据细胞核的Flag表达强度与在空载体转染细胞上测量的非过表达细胞核的最大Flag抗体背景强度相比的倍数对细胞核进行分类。每个层粘连蛋白B1构建物的两类Flag表达强度相似：最大背景强度的二到四倍或四到六倍。每个条件和每个重复的平均细胞数为25到80个。

活细胞微辐射实验

U2OS细胞被镀在35mm玻璃底培养皿上。在微辐射前48小时，用53BP1-GFP质粒和层粘连蛋白B1质粒或空质粒共同转染细胞。细胞核用Hoescht（1μg/ml；Hoescht333424082，细胞信号）染色。使用PLAN APO 60×（数值孔径：1.4）物镜在尼康A1共焦激光扫描显微镜系统上进行活细胞成像，该系统连接在一个倒置的ECLIPSE Ti（尼康公司，日本东京）上，在5%CO下保持37°C2和20%O2大气。用405 nm激光二极管设置为最大功率的2%，对选定区域进行2 s的微辐照。在75分钟内每隔30秒采集一次时间推移图像。通过测量辐照区域荧光强度随时间的变化，使用NIS-Elements软件（尼康公司）进行蛋白质补充动力学分析。在微辐照前，强度值由同一区域的背景水平标准化。

细胞遗传学分析

将SV40转化的成纤维细胞转染有层粘连B1、Head-Col1结构域、缺失Head-Coil1结构域的层粘连B1+前层粘连A或对照载体，培养48小时，然后照射或不照射（IBL637辐射器，2 Gy，1.77 Gy/min），并替换24小时。在最后2小时内，向细胞中添加秋水仙碱（0.1μg/ml；Sigma-Aldrich）。胰蛋白酶化细胞颗粒在低渗KCl溶液中膨胀，并在37°C下孵育20分钟。细胞固定在乙醇-乙酸（3:1）中，并铺展在预冷玻璃载玻片上。将载玻片风干后，用4%Giemsa染色10分钟。装上载玻片后，使用带有63×物镜的明场显微镜（徕卡DM5500）以盲法捕获中期扩散。

协同免疫沉淀

SV40转化成纤维细胞的细胞蛋白在分裂后48小时内提取，用于内源性条件，或在转染后48小时使用50 mM tris-HCl（pH 7）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）提取。对于ATM抑制剂的相互作用分析，用10μM ATM抑制剂（ATMi；KU60019，S1570，Selleckchem）或二甲基亚砜预处理处理过的细胞2小时。无论照射后1小时（IBL637辐射器，2 Gy，1.77 Gy/min）与否，收集细胞并使用与上述相同的缓冲液和5%NP-40提取蛋白质。蛋白细胞提取物与添加10 mM MgCl的RQ1核酸酶（Promega）或苯甲酸酶核酸酶（0.5 U/μl；E1014，Sigma-Aldrich）孵育2在室温下保持1小时。根据制造商的建议（Life Technologies），使用Dynabeads蛋白G试剂盒进行联合免疫沉淀。总共，在室温下将2.5μg抗体与Dynabeads偶联1小时。随后，在用1 mg蛋白细胞提取物（室温下1小时30分钟）孵育步骤之前，用0.05%吐温20在PBS中清洗珠子三次。用含4%β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液（2×）对珠-抗体-蛋白质复合物进行解离和变性。进行蛋白质印迹分析以揭示上述蛋白质。作为联合免疫沉淀对照，使用特定的小鼠和兔免疫球蛋白（IgG）[小鼠IgG（sc2025 Santa Cruz）或兔IgG[sc2027 Santa Cru或12-370 Merck Millipore）]。

原位PLA

将生长在载玻片上的SV40转化的成纤维细胞在甲醇中固定10分钟，在PBS中洗涤，并存储在PBS（4°C）中。然后按照上述方法对载玻片进行饱和并染色，以使用以下抗体对进行免疫荧光标记：抗53BP1（小鼠，612522，BD Biosciences）和抗层粘连蛋白B1（兔，ab16048，Abcam）或抗HA.11（小鼠，MMS 101P，Covance）和抗-层粘连素B1或抗53BP1（小鼠，612522，BD Biosciences）和抗Flag（兔，F7425，Sigma-Aldrich）或抗53BP1（小鼠，612522，BD Biosciences）和抗层粘连蛋白A（兔，L1293，Sigma-Aldrich）抗体。根据制造商的协议，使用Duolink原位检测试剂盒（Sigma-Aldrich）进行PLA。对于Flag–Lamin B1片段过度表达后的PLA，对每个Lamin B1结构体的Flag表达强度相似的人群进行分析。对于WT或28A突变53BP1表达后53BP1 KO U2OS细胞中的PLA分析，分析了53BP1类似表达水平的细胞核群体。数字图像由SPE Leica DMRxA2共焦显微镜使用63倍物镜采集。使用徕卡和ImageJ软件对图像进行进一步处理。为了研究内源性相互作用的定位，在共焦显微镜上获得了多个Z平面上的PLA点。然后使用ImageJ软件在焦平面上对点进行评分，并将其分类为位于膜上（层粘连染色共定位）或位于核内部。

显微镜设备和采集设置

对于免疫荧光分析，使用Leica DM5500B表观荧光显微镜获取图像。使用流明200-W汞灯（Microvision）作为光源。使用的徕卡滤波器如下：A4激励滤波器带通（BP），360/40nm；长程二向色（LPDC）镜，400 nm；发射滤波器，BP 470/40 nm（#11504162，徕卡）；L5励磁滤波器，BP 480/40 nm；LPDC反射镜，505 nm，发射滤波器BP 527/30（#11504166，徕卡）；TX2激发过滤器BP 560/40 nm，LPDC镜595 nm，发射过滤器BP 645/75 nm（#11504166，徕卡）。采用单色CoolSNAP HQ2 14位相机，带电荷耦合器件传感器，像素尺寸为6.45×6.45μm。图像是在×63浸油放大倍数下采集的（数值孔径：1.30）。获取的图像大小为1344×1024像素，深度为14位x-y轴每像素0.1024μm的尺寸。

对于PLA，图像是使用徕卡SPE激光扫描共聚焦显微镜采集的，该显微镜配备有光电倍增管和405、488和532纳米激发激光器。图像采集使用商业软件LAS AF（徕卡）。图像采集采用×63浸油放大倍数（数值孔径：1.30）。采集的图像大小为512×512像素，深度为12位x-y轴每像素0.227μm的尺寸。图中包含的所有图像都具有线性gamma（=1曲线），并且其显示范围已被同等缩放。

数字显微镜图像分析

使用Wiener滤波器预处理Landweber方法（带ImageJ软件的并行迭代2D反褶积插件v1.9）对线性和全显示范围内采集的原始数据图像进行迭代反褶积算，以消除模糊，除了在53BP1 KO U2OS细胞中的层粘连B1片段过度表达和PLA分析后形成的53BP1病灶外，均使用CellProfiler软件进行批量处理。每个感兴趣结构（即细胞核、病灶和PLA点）的分割基于自适应标记相关阈值。自动分割的一致性在原始图像上通过视觉控制，并辅以识别对象的轮廓。CellProfiler在管道运行期间收集每个物体的测量数据，然后使用KNIME分析平台进一步分析，以计算每个核参数。用ImageJ软件分析层粘连蛋白B1片段过度表达后53BP1病灶的形成，以及WT或28A突变53BP1表达后53BP 1 KO U2OS细胞中PLA的测定。在DAPI复染上进行细胞核分割后，分别将53BP1或PLA场上的病灶或PLA点计数为局部最大值，并分别与所分析细胞核的层粘连B1片段表达或53BP1表达强度相匹配。根据其层粘连B1片段或53BP1强度对细胞核进行分类，并与在空载体转染细胞上测量的非过度表达细胞核的最大背景强度进行比较。对于53BP1病灶，定义了每个层粘连蛋白B1构建体具有相似表达强度的两类：低表达或中等表达细胞，分别对应于最大背景强度的2至四倍或4或4次表达量：。对于PLA点，比较LMNB1片段或53BP1表达相似的人群。

统计分析

统计分析[未配对t吨测试，多个t吨使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad-Software Inc.）进行了检验、双尾Mann-Whitney检验和单向方差分析（ANOVA）。

致谢

我们感谢K.Dubrana、S.Marcand、E.Soler、F.Boussin和B.Lopez对手稿的有益讨论和评论。我们感谢D.Durocher提供53BP1缺陷型U2OS细胞系。这份手稿由美国期刊专家编辑。基金：这项工作得到了法国国家癌症控制委员会（Ile de France committee）、癌症研究协会（ARC基金会）拨款数量（如需要）（ARCPJA32020070002430）、AT欧洲协会、放射生物学项目CEA拨款、EDF拨款、AFM-Téléton拨款数量（若需要）（n 21566）、INCA拨款、，和INSERM内部资金（SGCSR单位）。L.E.得到了法国国家癌症防治研究金（上塞纳河委员会）和INSERM的支持。a.M.获得了CEA DSV IRTELIS国际研究金和ARC基金会研究金。D.G.是CEA DSV IRTELIS国际奖学金和ARC基金会奖学金的获得者。E.R.是Recherche医疗研究基金会的接受者。S.W.是CEA DRF“Phare”奖学金和ARC基金会奖学金的接受者。P.W.是法属国家癌症控制研究金的获得者。J.P.获得了巴黎萨克雷大学的博士研究金。作者贡献：P.B.和E.R.写了这篇论文。L.E.、D.G.、A.M.、E.R.、G.P.和P.B.构思了实验。L.E.、D.G.、A.M.、E.R.和G.P.进行了大部分实验。S.W.、C.C.-O.、P.W.和J.P.进行了一些实验。B.T.为图像分析开发了几个内部脚本，并进行了一些实验。A.B.进行了初始DSB修复实验。J.D.和X.V.进行了GST下拉分析。E.D.和D.B.构建了表达不同53BP1和层粘连B1结构域的载体。L.I.、T.K.和A.C.帮助进行了激光微辐照实验。C.L.C.协助开发了Metamorph软件中的几个内部脚本。S.Z.-J.，用于有益的讨论，特别是用于截短的层粘连B1结构/蛋白质的设计。R.S.提供了其专业知识和生物试剂。竞争利益：提交人声明他们没有相互竞争的利益。数据和材料可用性：评估论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充材料中提供。

补充材料

本文的补充材料可在以下网址获得：http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/35/eabb3799/DC1

参考和注释

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文章来自科学进展由以下人员提供美国科学促进会