国际分子科学杂志。2021年8月；22(15): 8218.
幼年热性惊厥对幼年大鼠海马突触可塑性的影响
安德烈亚斯·格拉布鲁克，学术编辑
收到日期：2021年6月18日；2021年7月28日验收。
摘要
早期的热性惊厥（FSs）是晚期神经系统疾病和认知功能障碍的重要危险因素。然而，关于FSs对发育中的大脑的影响的现有数据是相互矛盾的。我们旨在研究出生后第10天暴露于高温诱导癫痫发作的幼年大鼠海马的形态和功能变化。我们发现FSs导致了轻微的形态紊乱。CA1和门的细胞数量减少了10%，但CA3或齿状回区域的细胞数量没有减少。相反，功能性损伤很严重。CA3-CA1突触中的长时程增强（LTP）显著降低，这归因于N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）活性不足。使用全细胞记录，我们发现FS组NMDAR电流脱敏程度较高。由于NMDAR的脱敏取决于亚单位组成，我们分析了NMDAR电流衰减和亚单位的基因表达，这表明对照组和FS组大鼠之间没有差异。我们认为，脱敏增加是由于NMDAR的甘氨酸位点激活不足，因为应用甘氨酸位点激动剂D-丝氨酸可以将LTP恢复到控制值。我们的结果揭示了FS影响大脑发育的一种新的分子机制。
关键词：高热惊厥、高热、长期增强、NMDA受体、海马
1.简介
发烧的传染病可引发热性癫痫（FSs）[1,2]这是3个月至5岁儿童最常见的神经系统疾病之一[三]. FSs分为简单FSs（持续时间<10–15分钟）和复杂FSs（持久时间>15分钟）[4,5]. 这种分类目前被认为具有预测价值。在绝大多数情况下，简单的FSs是良性的，不会对儿童的发展产生不利的长期影响[6]. 临床研究表明，早期经历更长时间FSs的成年人在以后的生活中经常表现出广泛的神经系统疾病[7,8,9]. 对成人颞叶癫痫患者的回顾性分析表明，儿童早期存在长期FSs病史的高患病率（30-50%）[5]. 与许多其他在早期生活中起作用的消极因素一样，FSs也会导致认知功能的长期改变，尤其是学习和记忆[10,11,12,13,14].
为了研究FSs对发育中大脑影响的机制，建立了新生大鼠高温诱导癫痫发作模型[7,15,16]. 癫痫发作强烈影响谷氨酸能传播[17,18]. 由于谷氨酸能传递与学习和记忆密切相关，因此早期癫痫发作导致认知障碍并不奇怪。
结果表明，长时间的实验性FSs可诱导短暂的海马神经元损伤[19,20]导致海马神经元特性的长期改变，对海马神经网络的兴奋性产生深远影响[21]. 这些和其他变化增强了大鼠一生中对进一步边缘区癫痫发作的敏感性[22]并在35%的动物生命后期诱发反复、自发的癫痫发作[23].
一些研究描述了FSs对突触可塑性影响的实验数据，但这些数据相互矛盾。Chang等人（2005年）发现，重复的FSs导致海马CA1区突触可塑性的长期双向调节，特别是长期增强（LTP）的减弱和长期突触抑制（LTD）的促进[24]. 然而，Notenboom等人（2010年）证明，P10 FSs后，P44大鼠的LTP增加，LTD降低[25].
啮齿类动物的突触可塑性和认知功能的长期损害也在其他诱发新生儿癫痫模型中观察到[26,27,28,29,30,31,32]. 例如，在P10缺氧诱导的新生儿癫痫模型中，癫痫发作后立即观察到LTP升高[33]. 癫痫发作后48–72小时记录LTP的衰减，这在成年大鼠中持续存在（P60）[34]. 然而，导致早期癫痫发作后海马可塑性变化的确切机制仍不清楚。
在本研究中，我们旨在研究暴露于FSs的幼年大鼠海马的形态和功能变化，以更好地了解可塑性损伤的机制。实验中只包括FSs持续时间至少15分钟的动物。研究在FSs后11天进行。
2.结果
2.1. 热性惊厥导致海马CA1区和海马门神经元数量减少
FSs是否诱导神经细胞死亡仍存在争议。前瞻性和回顾性临床研究表明，FSs延长可能导致神经元细胞死亡和内侧颞叶硬化[5,7,8,11,35]. 动物研究表明，早期实验性FSs可能导致海马神经元持续功能障碍，而不会导致细胞死亡[19,20].
使用尼塞尔染色()我们计算了海马CA1和CA3区锥体层、DG门和颗粒细胞层的神经元数量。我们检测到CA1细胞数量下降（对照组N=8大鼠每100μm 51.2±1.0个细胞，FS后为46.8±1.0个/100μm，N=8个大鼠；t吨-测试=3.07，第页<0.01）和肝门（对照组为40.9±1.1个细胞，FS后为36.6±1.1个；t=2.72，第页< 0.05). CA3中的神经元数量没有显著变化（对照组为30.4±0.9个细胞，FS后为29.1±0.9细胞；t=1.05，第页=0.31）和DG（对照组68.6±1.1个细胞；FS后66.1±1.4个细胞；t=1.44，第页= 0.17).
对照组（CTRL）和FS大鼠（FS）海马CA1、CA3、门和齿状回（DG）神经元的尼塞尔染色。每100μm细胞层计数的尼塞尔染色神经元的分组数据。菱形显示每个大脑的个体值。条形图表示平均值，误差条形图表示均值的标准误差*第页< 0.05, **第页< 0.01,t吨-测试。
因此，我们证明FS导致某些海马区的细胞数量减少10%。CA1和门是最容易受到FSs影响的区域，而CA3和DG中的细胞数量没有明显变化。因为海马体的信息处理是由区域内和区域间的兴奋性突触联系决定的；海马不同区域神经元数量比例的变化会导致海马的某些功能紊乱。
2.2. FS后CA3-CA1突触神经传递的有效性降低
接下来，我们研究了FS后CA3-CA1锥体神经元突触的突触神经传递效率是否发生变化。使用钨双极电极在CA2/CA1边界处对来自CA3区域的传入纤维进行电刺激。我们在25至300毫安的强度范围内施加电流，并测量突触前FV的振幅，这表明了激发动作电位和fEPSP的CA3轴突的数量，显示了CA1神经元发生的整体兴奋性突触后反应。
首先，我们比较了对照组（N=12只动物，n个=27片）和FS动物（N=23只大鼠，n个=53片）；各组之间没有发现差异（重复测量ANOVA F11,858= 0.50;第页= 0.90,a） ●●●●。相反，FS（F11,836= 8.7;第页<0.001，对照组：n个=26，FS：n个= 52;b） 提示突触前纤维具有较高的兴奋性。
fEPSP振幅的刺激-反应关系(一)和突触前FV振幅(b条)对照组（CTRL）和FS大鼠海马CA1区记录。每个点代表平均值±SEM(c（c）)对照组和FS大鼠海马脑片fEPSP和FV振幅之间I/O关系的典型示例。(d日)FS大鼠的最大I/O斜率小于对照动物。每个菱形代表在单个大脑切片中获得的值。每只动物使用一到三片*第页< 0.05, **第页<0.01-对照组和FS组之间的差异。
接下来，我们比较了对照组和FS组fEPSP和FV振幅之间的神经元输入-输出（I/O）关系。这种曲线中的最大I/O斜率被视为突触强度度量[36]. 我们通过用sigmoid Gompertz函数拟合实验数据来确定每个切片的最大I/O斜率(c） 并注意到FS后大鼠的平均斜率降低了25%(t吨-试验：t=2.30；第页< 0.05; 控制：n个=22，FS：n个=49；d） ●●●●。这些数据表明，FS后CA3–CA1的突触神经传递效率降低。
2.3. 出生后早期肿瘤发生中FS大鼠海马神经元短期突触可塑性无变化
突触传递效率的中断可能是由于突触前机制的干扰。作为第一种近似，介质释放概率的变化可以通过短期突触可塑性特性的变化来确定[37]. 我们使用成对脉冲刺激来研究短期突触可塑性的可能变化，并比较了对照组动物（N=7只大鼠，n个=12片）和实验（N=9，n个=15）组。显示了30 ms和80 ms刺激间隔下成对fEPSP的示例，以及说明成对振幅比对刺激间隔值依赖性的曲线。重复测量方差分析显示FS（F1,336= 0.20;第页=0.66）或因素的相互作用（刺激间隔时间×FS；F14,336= 0.26;第页=0.99）。
FS后大鼠海马脑片短期突触可塑性无变化。(一)对照组（CTRL）和FS后大鼠（FS）海马CA1区对脉冲响应的典型示例，脉冲间隔为30 ms和80 ms(b条)图中显示了不同刺激间海马脑片中的配对脉冲促进作用。每个点代表平均值±SEM。
因此，对照组和实验组之间短期可塑性没有差异，这表明FS后CA1区神经递质释放的概率没有改变。
2.4. 热惊厥对大鼠海马长期突触可塑性和突触传递的影响
接下来，我们研究了FSs后海马CA3–CA1突触的LTP特性是否发生变化。我们应用了两种LTP诱导方案：θ波刺激（TBS）和高频刺激（HFS）。两种方案对FS组LTP诱导的效果都较差(). 根据双向方差分析，FSs显著降低LTP（FS/对照，F1,44= 19.1,第页<0.001），无论使用何种协议（协议类型×FS/控制，F1,44= 0.001,第页= 0.98). TBS方案在对照组（N=6只大鼠，n个=9片），而FS组仅为1.21±0.06（N=8，n个=18），HFS协议-1.61±0.08（N=7，n个=9）和1.27±0.07（N=6，n个=12）。
幼年大鼠早期FSs后海马CA1区的长期突触增强（LTP）减弱。(一)显示海马体中电极位置的图式。(b条)诱导前（1）和HFS或TBS后60分钟fEPSP的典型示例（2）。(c（c）)显示对照组（CTRL）和实验组（FS）动物在θ波刺激（TBS）或高频刺激（HFS）后fEPSP标准化斜率值的变化的图表（在时间0时进行刺激）。(d日)图表显示了不同刺激类型的对照（CTRL）和实验（FS）动物之间LTP的差异。本图和下图中的所有数据均以平均值±标准误差的形式表示*第页<0.05——与对照组的显著差异（Tukey的事后检验）。
因此，FS后幼年大鼠CA1海马区LTP显著减弱。
CA3–CA1突触的LTP被认为依赖于NMDAR的激活[38,39]. 为了评估NMDAR依赖性可塑性机制的维持，我们应用了非竞争性拮抗剂MK-801（10μM）。在对照组中，MK-801应用几乎完全阻止了两种TBS诱导LTP(a、 c；1.15 ± 0.06; N=6只大鼠，n个=10片）和HFS协议(b、 d；1.07 ± 0.06; N=8只大鼠，n个=9片）。在实验组中，MK-801的作用相似。在MK-801存在的情况下，未诱导明显的LTP（TBS:1.08±0.07；N=5，n个= 7; HFS:1.12±0.08；N＝9，n个= 10). 因此，我们的结果证实，在对照和FS动物中，LTP诱导是NMDAR依赖的过程。
幼年动物早期FS后CA1海马LTP的诱导是NMDAR依赖性的。对照组和实验组在NMDAR阻滞剂MK-801（10μM）存在下TBS前后的标准化fEPSP斜率(一)或HFS(b条). (c（c）,d日)显示对照组和实验组在MK-801存在下TBS后塑性大小的图表(c（c）)或HFS(d日). 注意，在任何组中，MK-801均未检测到突触可塑性。采用Tukey事后检验后的双向方差分析**第页< 0.01, ***第页< 0.001.
突触可塑性特性取决于NMDAR的亚基组成[40]. 为了评估含GluN2B的NMDAR的影响，我们使用了它们的选择性拮抗剂ifenprodil（3μM）。我们发现，在TBS方案中，ifenprodil显著影响突触可塑性(a、 c；双向方差分析，ifenprodil（+/-）：F1,43=8.0时，第页<0.01）和HFS协议(b、 d；F类1,36= 13,第页< 0.001). 伊芬地尔在对照组和实验组中的作用相似（TBS方案：组（对照/FS）×伊芬地尔（+/-），F1,43= 2.3,第页= 0.13; HFS协议：F1,36= 0.74,第页= 0.39). 在对照动物中，ifenprodil使LTP的幅度降低了近两倍（TBS:1.24±0.04；N=9只大鼠，n个=14片；a、 c；HFS:1.24±0.05；N=6，n个= 7;b、 d）。在实验大鼠中，无论采用何种方案，LTP的生成均被阻断（TBS:1.11±0.08，N=6，n个= 6;a、 c；HFS:1.08±0.08；N=7，n个= 10;b、 d）。
含有GluN2B的NMDAR参与了对照组和FS后动物LTP的诱导。TBS前后，在含有选择性GluN2B NMDAR拮抗剂ifenprodil（Ifen，3μM）存在下，对照组和实验组的相对fEPSP斜率(一)或HFS(b条). 注意，在FS组中，ifenprodil的存在没有检测到突触可塑性。(c（c）,d日)显示TBS后，在ifenprodil存在的情况下，对照组和FS后组的可塑性大小的图表(c（c）)或HFS(d日). 注意，在FS组中，ifenprodil的存在没有检测到突触可塑性。采用Tukey事后检验后的双向方差分析*第页< 0.05.
因此，含有GluN2B的NMDAR参与了对照和实验动物LTP的诱导。FS大鼠LTP的完全阻断可能是因为含GluN2B受体在NMDAR中占主导地位。另一种可能性是，ifenprodil进一步阻断最初通过NMDAR的较低电流。为了确定这些原因中哪一个更可行，我们检测了不同谷氨酸受体亚基的表达。
2.5. FS后NMDAR和AMPAR亚单位基因的相对表达不变
我们比较了NMDAR的表达(格林1,格林2a,格林2b)和AMPAR(格里亚1,格里亚2)P21三组大鼠海马背区亚单位基因。除了对照组和FS组外，本研究还使用了一组完整的动物。谷氨酸受体亚基基因的mRNA表达没有变化；这个格林2b/格林2a表达率也没有改变().
热性惊厥后背海马区Grin1、Grin2a、Grinb2b、Gria1、Gria2基因的相对表达以及Grin2a/Grin2b比率。CTRL对照组；FS-实验组。单向方差分析，然后是Tukey的事后多重比较测试。数据以平均值和平均值的标准误差表示。每个点（圆、菱形、方形）代表单个动物获得的值。
结果表明，NMDAR和AMPAR的亚单位组成在这种发热性癫痫模型中不太可能发生变化。专性亚基GluN1的表达值没有变化也表明NMDAR的总数很可能没有改变。因此，突触可塑性降低的可能原因可能是NMDARs的功能障碍。
2.6. 热性惊厥对TBS诱发NMDAR介导突触电流特性的影响
热性惊厥后LTP下降可能是由于NMDAR依赖性钙电流减弱所致。因此，我们使用全细胞补丁灯方法比较了TBS期间NMDAR介导的反应。在对照组和FS组大鼠中，在训练期间，反应幅度降低，但幅度不同(a、 b）。我们将EPSC的振幅归一化为第一个峰值的振幅，并进行混合模型方差分析。分析表明，在FS组中，NMDAR介导的电流峰值振幅在五个响应（F24,649= 4.05,第页< 0.001). 因此，在FS组中，NMDAR表现出更快的脱敏，并且在诱导方案中提供较少的钙进入突触后终末。反过来，这可能是LTP产量受损的原因。
在FS大鼠中，TBS诱发的NMDAR介导的电流特性受到干扰。(一)TBS在对照组（黑色）和FS大鼠（红色）CA1神经元中诱导的NMDAR介导电流的典型电压灯记录。(b条)响应中单个电流峰值的平均振幅，归一化为第一个响应的振幅。混合模型方差分析揭示了各因素之间的显著相互作用（FS×刺激数）。根据Dunnett的事后检验，星号表示相同刺激次数下，对照组和FS组大鼠的数值之间存在显著差异。(c（c）)在TBS期间，NDMAR介导的电流的90–10%衰减的代表性记录。电流用双指数函数拟合，时间常数为=65 ms和=300毫秒(d日)TBS期间反应的快成分和慢成分的相对贡献。混合模型ANOVA没有显示对照和FS大鼠之间的差异。星号表示与第一个响应的显著差异*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001.
由于NMDAR脱敏的动力学强烈依赖于其亚基组成[41]此外，我们还使用电生理方法测试了NMDAR的亚基组成在FS后是否发生了变化。NMDAR介导的eEPSC的衰变阶段取决于GluN2亚单位的类型，在锥体神经元中，它可以用具有快时间常数和慢时间常数的双指数函数拟合。之前，我们已经证明，含有GluN2B的NMDAR拮抗剂ifenprodil选择性地阻断具有慢时间常数的成分[42]. 我们研究了FS是否影响这些成分的相对贡献，以及TBS对对照组和FS大鼠快速和慢速成分的相对影响是否不同。
我们证实，在对照组和FS大鼠中，电流衰减由时间常数的两个指数函数拟合=65 ms和=300毫秒(c） FS组和对照组对第一次反应的相对贡献没有差异。接下来，使用混合模型方差分析，我们发现在TBS（F4,109= 56.3,第页< 0.001). 尽管如此，FS（F1,109= 0.01,第页=0.9），并且未检测到响应数和FS之间的显著交互作用（F第4109页= 0.6,第页= 0.7). 对于快速衰减成分（刺激次数：F4,109= 3.5,第页= 0.011; 可行性研究：可行性研究1,109= 0.27,第页= 0.6; 刺激数×FS:F4,109= 0.23,第页= 0.9).
结合qRT-PCR数据，这些结果表明FSs不影响NMDAR的亚基组成。
2.7. D-丝氨酸部分恢复FS-Rat中的LTP
NMDARs的激活需要微摩尔浓度的谷氨酸和共激动剂甘氨酸或D-丝氨酸。谷氨酸与GluN2的结合通过负变构调节降低GluN1对甘氨酸/D-丝氨酸的亲和力；这导致在激动剂存在下通过NMDAR的离子电流逐渐减少。
NMDAR脱敏表现为亚摩尔甘氨酸，并随着甘氨酸浓度的升高而降低。这被称为甘氨酸依赖性脱敏[41,43,44]. 海马星形胶质细胞保留控制涉及Ca的LTP的能力2+-依赖性D-丝氨酸释放[45]癫痫患者星形胶质细胞与神经元的关系受到干扰[46]. 最近，我们用锂-匹罗卡品颞叶癫痫模型显示，应用D-丝氨酸可以完全恢复大鼠海马LTP的初始阶段（5-15分钟）[47]. 因此，我们设计了下一组实验来评估D-丝氨酸（10μM）的应用效果。
我们发现D-丝氨酸对对照动物和FS大鼠突触可塑性的影响不同()，当使用TBS协议时（双向方差分析，组（FS/对照）×D-丝氨酸（+/-），F1,37= 5.1,第页<0.01）和HFS（F1,39= 4.3,第页< 0.05). 在FS大鼠中，应用D-丝氨酸使LTP值恢复到对照值。在HFS方案中，D-丝氨酸的应用使LTP幅度从1.27±0.07增加（N=6只大鼠，n个=12片）至1.63±0.08（N=8只大鼠，n个= 16,第页<0.01）。我们的研究结果表明，FS后神经元与神经胶质的关系可能会受损。
D-丝氨酸是NMDAR的联合激动剂，可增强FS组的LTP，但不增强对照组。对照组和FS组在NMDAR协同激动剂D-丝氨酸（10μM）存在下TBS前后的标准化fEPSP斜率(一)或HFS(b条). (c（c）,d日)显示TBS后D-丝氨酸存在时对照组和实验组可塑性大小的图表(c（c）)或HFS(d日). Tukey事后测试后的双向方差分析：*第页< 0.05, **第页< 0.01.
2.8. NMDAR对TBS的中介响应仿真
为了研究环境甘氨酸/D-丝氨酸浓度的降低是否会影响TBS期间NMDAR脱敏，我们实现了NMDAR动力学的数学模型().
用于模拟NMDAR选通机制的动力学方案。每个箭头上方的速率常数以s为单位−1，但甘氨酸结合和谷氨酸结合速率常数除外，其单位为µM−1秒−1Gly和Glu分别表示甘氨酸和谷氨酸浓度（单位：µM）。
使用两种浓度的环境激动剂进行模拟：10µM和1µM。对于两种浓度的甘氨酸，TBS的实施诱导了NMDAR反应，这与实验中观察到的反应相似。每次突发都会导致开启状态概率的单一峰值，从而产生五个响应，每个响应都有五个峰值(). 当出现较高浓度的甘氨酸时，在五次爆发中的每一组中，个别峰值都显示出轻微下降。在低浓度甘氨酸中，概率峰的振幅在训练期间表现出更大幅度的降低()与TBS期间NMDAR电流的实验观察结果相当。因此，模拟表明，低浓度甘氨酸在TBS期间促进NMDAR的使用依赖性下调，与实验中观察到的类似。
NMDAR对TBS的响应模拟(一)开放状态概率（O1+O1）的总和，反映了由TBS诱导的NMDAR介导的突触电流的时间进程。上面的痕迹（黑色）代表5种反应，用10µM的环境甘氨酸模拟。用1µM环境甘氨酸模拟较低的痕量（红色）。(b条)响应中单个开放状态概率峰值的振幅归一化为第一个响应的第一个峰值振幅。
3.讨论
大量证据表明，长期或反复的新生儿癫痫发作可导致后天癫痫和认知功能障碍[16,28,31,48,49]. 癫痫诱发癫痫和认知异常的确切机制尚不完全清楚，尽管人们认为兴奋性突触传递特性的改变有助于这一过程。由于儿童癫痫的高发病率，了解其对未成熟大脑的影响机制是最关键的任务之一。
这项研究使用了一个紧密复制长时间FSs的动物模型[三]; 为了实现这一点，我们监测了动物中FSs的持续时间，并且只包括癫痫发作持续15–20分钟的大鼠。本研究的主要发现是，P10的热性癫痫发作导致P21大鼠海马LTP诱导显著减弱。海马突触可塑性的减弱伴随着CA1区突触传递效率的减弱以及CA1区和门区神经元数量的轻微减少。我们认为FS大鼠的可塑性诱导减弱与NMDAR更显著的脱敏有关。脱敏增加可能是由于NMDAR的甘氨酸位点激活不足，因为甘氨酸位点协同激动剂D-丝氨酸的应用可以将突触可塑性恢复到控制值。
在本研究中，我们假设FS模型中谷氨酸能传递受损可能主要与AMPAR和NMDAR的特性中断有关，因为在各种新生儿癫痫模型中都显示出这种紊乱。例如，早期低氧诱导的癫痫发作导致CA1中AMPAR介导的信号增强，与受体磷酸化增加相关[50]. 新生儿缺氧-缺血后还观察到NMDAR亚基的酪氨酸磷酸化增强[51]. 在缺氧新生儿癫痫模型中，海马中GluN2A磷酸化增加[52]. 缺氧诱导的癫痫发作也可能导致缺乏Ca的GluA2的表达增强2+-海马中的可渗透性AMPA受体[31,53]. 在癫痫发生的早期阶段，最经常报告的干扰包括含有GluN2B的NMDARs的相对贡献增加，这在匹罗卡品和锂-匹罗卡平模型中显示[42,54,55]. 戊四唑诱导的点燃也得到了类似的结果[56].
FSs对谷氨酸系统的影响目前研究较少。早期频繁重复的FSs导致成年大鼠海马CA1区NMDA治疗后GluN2A亚基酪氨酸磷酸化选择性缺失[24]. Chen等人表明，在延长FSs后，GluN2B Tyr1472磷酸化逐渐增加，并在7天内保持高水平，而GluN2B总表达水平没有任何明显变化[57].
在本研究中，我们没有观察到AMPAR或NMDAR亚单位的mRNA表达水平有任何变化。尽管蛋白质和mRNA水平的受体亚单位表达水平可能不一致，但对照组和FS组中NMDAR介导的电流衰减相似，表明NMDAR的亚单位组成不受FS的影响。然而，FS组中NMDAR的功能活动发生了改变：与对照组相比，FS组的NMDAR表现出更快的脱敏。
NMDAR脱敏是由几个不同的并发过程引起的。NMDAR激活后，至少会发生两种不同类型的脱敏[41]. （1） 谷氨酸结合GluN2通过负变构调节降低GluN1对甘氨酸的亲和力；这导致在存在激动剂的情况下通过NMDAR的离子流逐渐减少[43]. 甘氨酸浓度的增加消除了这种影响[58]. （2） 钙依赖性脱敏是由于GluN1亚单位进入细胞后与细胞内钙结合而引起的[41]. 这两种类型的脱敏都取决于NMDAR亚单位的组成[41].
由于我们没有使用PCR分析检测到NMDAR亚单位组成的任何变化，我们认为这些变化可能与甘氨酸位点激动剂的可用性有关。以下数据支持这一假设。细胞外甘氨酸浓度随脑区和神经元活动而变化。在海马体中，甘氨酸的突触可用性主要受星形胶质细胞和突触后神经元中表达的甘氨酸转运体1（GlyT1）的控制[59,60]. Shen等人（2015），使用两种不同的癫痫啮齿动物模型，证明了GlyT1在海马结构中的强烈过表达，表明癫痫中的甘氨酸信号传导功能失调[61]. 值得注意的是，颞叶癫痫患者海马甘氨酸受体表达的变化也有报道，表明癫痫中甘氨酸信号的失调[62]. 因此，我们可以假设FSs后有效甘氨酸的浓度降低，从而NMDRs的脱敏增加。在我们的实验中，添加甘氨酸位点激动剂D-丝氨酸可以恢复LTP，这一事实支持了这一假设。
NMDAR脱敏增强和突触可塑性受损的另一个可能原因可能是神经元-胶质细胞关系的紊乱。海马星形胶质细胞保持在其各自区域内或附近控制LTP的能力，包括Ca2+-依赖性D-丝氨酸释放[45]. 因此，星形胶质细胞可以调节局部D-丝氨酸供应，并可能能够将D-丝碱传递给特定的NMDAR人群，从而降低他们的脱敏。此前，我们发现应用D-丝氨酸可以完全恢复毛果芸香碱治疗大鼠海马脑片LTP的初始阶段[47]. 在这项研究中，D-丝氨酸的作用更为显著，这表明神经元-胶质细胞相互作用受损的假说有待进一步探讨。
实验诱导的FSs对星形胶质细胞间隙连接偶联产生强烈抑制[63]可能影响FS后海马神经元的兴奋性，促进癫痫的发展[20,22]. 在重复的FS模型中，星形胶质细胞的长期激活[64]海马星形胶质细胞和颞叶新皮质出现明显的超微结构改变。颗粒内质网和线粒体的损伤是主要表现[65]导致一些细胞间生化事件的紊乱，例如异常的蛋白质合成或氧化磷酸化的抑制。
在本研究中，我们还证实了早期FSs不会导致显著的神经细胞死亡，支持了先前的研究，即未成熟海马对癫痫诱导的神经元死亡具有抵抗力[20,66]. 然而，本研究表明，在海马CA1区和门的锥体层中有10%的神经元损失，但在CA3或DG中没有。此外，受影响神经元的分布与之前的研究报告部分相似[19]其中，作者使用银染法，确定了海马CA1锥体层和所有CA3亚区神经元物理化学性质中最具破坏性、最显著和最持久的变化。
因此，我们的研究表明，早期FSs不会直接导致海马细胞死亡，但会导致谷氨酸能神经传递的多种功能紊乱，包括突触内可塑性的改变。这些障碍最终可能导致癫痫状态，并成为认知功能障碍的主要机制。
4.材料和方法
4.1. 动物和FS模型
所有实验均由塞奇诺夫进化生理学和生物化学研究所伦理委员会批准，并按照当地实验动物治疗指南进行。这些指南完全符合俄罗斯和国际动物研究标准。雌性Wistar大鼠及其窝鼠在室温下的标准条件下饲养，可以自由获得水和食物。只有10只幼崽被遗弃在窝里。在P10上诱导FS。幼犬被放置在一个10升的玻璃室底部。温度保持在46°C。动物直肠温度测量[67].
实验前，体温为31.1±0.1°C，癫痫发作开始时为39.8±0.1°C。癫痫发作后，每隔2分钟测量一次温度。如果温度升高到41°C以上，则将幼鼠移到凉爽的表面上2分钟，然后放回试验箱。将动物的高温（39–41°C）维持25分钟。
该范式中的行为性癫痫是刻板的，包括热诱发的运动亢进的停止，随后是面部自动化，通常伴有身体屈曲，随后是肌阵挛抽搐和阵挛性癫痫。热疗后，将动物放在寒冷的表面上，直到核心温度恢复到正常范围，然后再放回笼子。热疗后，幼崽的体重变化不大（体重变化<3%），表明只有轻微的脱水症状。体温过高和随后30分钟内的死亡率低于1%。只有持续至少15分钟的FS动物被纳入研究（N=43）。
同时从笼子中取出用于对照的利特曼盐，但保持在室温下（N=42）。此外，使用一组完整的动物（N=5）来研究谷氨酸受体亚单位的表达。来自完整组的大鼠未接受任何治疗。
4.2. 脑切片准备
海马切片的制备如前所述[68]. 简单地说，在第21–23页，大鼠被斩首。大脑被迅速切除。使用振动棒HM 650 V（Microm，Walldorf，Germany）在冷冻人工脑脊液（ACSF；t=0°C）中切割水平脑切片（400μm），该脑脊液中通入碳（95%O）2和5%CO2). ACSF的成分（单位：mM）：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2人事军官4，1 MgSO4，2氯化钙2，24氯化钠三，10葡萄糖。然后将切片在35°C下孵育1小时，然后在室温下放置。孵育后，将切片转移到记录室，在那里记录25-27°C下的现场反应。在记录室中，ACSF流速为5–7 mL/min。
4.3. 现场电位记录
用玻璃微电极（0.2–1.0 MΩ）从海马放射CA1层记录细胞外场兴奋性突触后电位（fEPSP）。用增加的振幅电流刺激每个切片（25至300μA，25μA步长），并测量每个fEPSP的振幅、20–80%的上升相位斜率和纤维束振幅（FVs）。如前所述，神经传递的功效是通过乙状结肠Gompertz功能测定的[36]. LTP实验的刺激电流幅度为电流强度的40-50%，导致种群峰值。通过A365刺激隔离器每20秒发送一次刺激（美国佛罗里达州萨拉索塔的世界精密仪器公司）。响应由1800型放大器（美国华盛顿州卡尔斯堡a-M系统公司）放大，然后使用ADC/DAC NI USB-6211（美国德克萨斯州奥斯汀国家仪器公司）使用WinWCP v5.x.x软件（英国格拉斯哥斯特拉斯克莱德大学）进行数字化。使用Clampfit 10.2软件（Axon Instruments，San Jose，CA，USA）对记录进行分析。
LTP诱导采用两种刺激方案。（1） TBS：五个脉冲的五次爆发，频率为100 Hz，爆发之间的间隔为200 ms。每10秒重复刺激5次。（2）HFS：每20秒施加3组100 Hz脉冲组成的序列。
LTP诱导前的20分钟基线期。刺激后60分钟内记录增强的fEPSP。通过计算增强的fEPSP的平均斜率（刺激后50–60分钟）和基线值（刺激前10分钟）的比率来量化LTP。MK-801（10μM）是一种非竞争性NMDAR拮抗剂，ifenprodil（3μM）则是一种GluN2B亚单位选择性NMDAR阻断剂，D-serine是NMDAR的联合激动剂，从Sigma（美国密苏里州圣路易斯）获得。这些药物在蒸馏水中稀释，然后在浴中使用。
配对脉冲比（PPR）计算为第二个到第一个fEPSP振幅比。
4.4. 全细胞膜片钳记录
使用Zeiss Axioskop 2显微镜（德国Oberkochen的Zeiss）对锥体神经元进行可视化，该显微镜配备有差分干涉对比光学系统和摄像机（Grasshopper 3 GS3-U3-23S6M-C；FLIR Integrated Imaging Solutions Inc.，美国俄勒冈州威尔逊维尔）。使用P-1000移液器（Sutter Instrument，Novato，CA，USA）从硼硅酸盐玻璃毛细管中拔出贴片电极（3-5 MΩ）。使用基于甲烷磺酸铯的移液管溶液（mM:127 CsMeSO3、10 NaCl、5 EGTA、10 HEPES、6 QX314、4 ATP-Mg和0.3 GTP的成分；用CsOH将pH调至7.25）进行电压灯记录。使用MultiClamp 700B（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）补丁灯放大器和NI USB-6343 a/D转换器（National Instruments，Austin，TX，USA，使用WinWCP 5软件（英国格拉斯哥斯特拉斯克莱德大学）进行全细胞录音。以10kHz对数据进行滤波，并以20kHz对数据进行采样。在样品中包含的所有电池中，接入电阻小于20 MΩ，并且在整个实验中保持稳定（增加≤20%）。通过减去7 mV，对电压灯记录的液结电位进行离线补偿。将双极刺激电极放置在与场电位记录相同的区域。在加巴静（10µM，以色列耶路撒冷Alomone实验室）和DNQX（10μM，英国布里斯托尔Tocris Bioscience）存在下，NMDAR介导的eEPSC在+40 mV下被记录。
使用衰减阶段（90–10%）的非线性回归分析描述了TBS期间NMDAR介导电流的时间进程变化[42]. 我们使用了双指数函数：
哪里和是快速衰减分量的振幅和时间常数；和是缓慢衰减分量的振幅和时间常数。
对于TBS诱导的五个NMDAR介导电流中的每一个，快衰减分量和慢衰减分量的相对份额计算如下：
哪里和分别是五个响应中第一个响应的快衰减分量和慢衰减分量的振幅。
4.5. 定量PCR（qRT-PCR）
在第21页将大鼠斩首。大脑被迅速取出、冷冻，并在−80°C下保存，直至解剖。根据大鼠脑图谱，使用低温恒温器OTF5000（英国亨廷顿Bright Instrument）解剖背侧海马[69]. 按照制造商的方案，使用ExtractRNA试剂（俄罗斯莫斯科埃夫罗根）分离总RNA。使用NanoDrop™Lite（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA）分光光度法评估RNA浓度。
逆转录使用总RNA（2μg）、寡核苷酸引物和9聚体随机引物（分别为0.5μg/1μg RNA和0.25μg/1µg RNA）（俄罗斯莫斯科DNA合成有限公司）和MMLV逆转录酶（100个单位/10μg RNA；俄罗斯莫斯科Evrogen）。反应在25µL的总体积下进行。我们将引物和8µL RNA溶液混合，在70°C下培养10分钟，并快速冷却至4°C进行引物退火。然后，我们添加了包含逆转录酶的反应混合物，样品在42°C下培养1小时，在65°C下培育10分钟。在此步骤后，将所有样品稀释7倍。使用0.8µL cDNA、0.75单位TaqM-聚合酶（Alkor Bio，俄罗斯圣彼得堡）、3.5 mM Mg、2+、特异正向、反向引物和水解（TaqMan）探针（参见). 核苷酸由DNA合成有限公司（俄罗斯莫斯科）合成。PCR反应在C1000 Touch热循环器和CFX96 Touch™实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中以三胞胎的形式进行，同时没有模板和反转录对照样品。的相对表达式格林1,格林2a,格林2b,格里亚1和格里亚2基因使用2计算-ΔΔCt方法[70]，根据的相对表达式进行归一化Ppia公司基因，在癫痫模型中是稳定的[71].
4.6. 组织学
在第21–23页，用舒泰/二甲苯嗪混合物（法国Virbac）对大鼠进行深度麻醉，然后用冰镇0.01M PBS（pH=7.4）和冰镇4%多聚甲醛（PFA）在0.1M PB（pH=7.4）中以10 mL/min的速率经心灌注处死大鼠。然后，取下大脑，将其固定在4%PFA中，温度为4°C，持续24小时。从PFA中冲洗大脑，并在4°C的PBS中用30%蔗糖冷冻2–3天。最后，将大脑冷冻在冷却（＜−50°C）的异戊烷（78-78-4，异戊烷溶液，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中，并在−80°C下储存，直到切割。用Bright OTF5000低温恒温器（Bright Instrument Co Ltd.，英国亨廷顿）从尾部至角部2.6至3.6 mm切割20μm厚的冠状连续切片，并将其安装在带有粘合剂涂层Super Frost Plus（J1800AMNZ，英国拉夫堡Fisher Scientific UK Ltd.）的载玻片上。干燥一天后，将未染色的载玻片放入一系列溶液中进行尼塞尔染色。将切片在乙醇（EtOH）和氯仿（俄罗斯莫斯科Ekos-1）（1:1）的混合物中脱脂1–3 h，然后在浓度降低的EtOH-溶液中再水化（96%EtOH3步，70%EtOH2步，每步2分钟），然后在蒸馏水中漂洗2次（每次1分钟），然后在0.05%的硫蛋白溶液（pH 4.5）中放置5分钟。然后在蒸馏水中冲洗切片（2步，每个步骤1分钟），并在浓度增加的乙醇溶液中脱水。最后，在微清理中清理断面（意大利马丁内戈的迪帕斯；两步15分钟和20分钟），然后用VitroGel覆盖（俄罗斯莫斯科Ergo生产厂）。
使用Leica显微镜AF 7000（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）在×400倍放大下分析Nissl染色切片。为了进行形态学分析，对每5个切片进行神经元计数（从一只大鼠海马体中得到8-10个切片）。分析截面之间的距离为100µm。使用ImageJ（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）对CA1、CA3、门和齿状回细胞层的数字显微照片中每100μm的神经元数量进行计数。
4.7. 模拟
NMDAR的动力学模型由[58]添加谷氨酸结合步骤，如[76]用于模拟TBS诱导NMDAR介导的电流。这个动力学方案()包括两个谷氨酸结合步骤（R0和R1)，三个闭合状态（C三，C2,和C1)，两种脱敏状态（D1和D2)，两个打开状态（O1和O2)和两个甘氨酸结合步骤（CU型和CM（M）). TBS期间的突触输入被模拟为1mM谷氨酸的1ms脉冲（5组5脉冲，每100秒重复一次）。甘氨酸的浓度设置为恒定值。使用Wolfram Mathematica 12（Wolfram Research，Champaign，IL，USA）对相应的速率方程系统（十一个一阶微分方程，每个概率状态一个）进行了数值求解。由于NMDAR的两个开放状态具有相似的电导[58,77]，将宏观电流的时间历程计算为两个导电状态的解之和。
4.8. 统计分析
使用OriginPro 8（美国马萨诸塞州北安普敦的OriginLab Corporation）和SigmaPlot 12.5（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的Systat Software Inc.）对结果进行统计分析和图形表示。Dixon的Q检验（90%置信水平）用于识别和拒绝异常值。使用Kolmogorov–Smirnov检验评估样本数据的正态性。使用Levene中值检验评估方差的相等性。使用Student’st吨-测试和方差分析如文中所述。所有数据均表示为平均值±标准误差。第页<0.05被认为具有统计学意义。
致谢
分子生物学实验是利用俄罗斯科学院谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所生理、生化和分子生物学研究资源中心的设施进行的。
作者贡献
数据管理，D.V.A。；形式分析、T.Y.P.、A.V.G.、D.V.A.、A.A.K.、E.B.S.和O.E.Z。；融资收购，A.V.Z。；调查、T.Y.P.、A.V.G.、A.A.K.和E.B.S。；方法、T.Y.P.、D.V.A.、A.A.K.、A.V.Z.和O.E.Z。；监督、T.Y.P.、O.E.Z.和A.V.Z。；验证、T.Y.P.和A.V.Z。；书面原稿、T.Y.P.、D.V.A.、A.A.K.、E.B.S.、O.E.Z.和A.V.Z。；Writing review and editing，T.Y.P.和A.V.Z.所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项工作得到了俄罗斯科学院谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所研究项目075-00408-21-00的支持。
机构审查委员会声明
该研究是根据欧盟动物实验指令2010/63/EU进行的，并得到俄罗斯科学院谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所伦理委员会的批准（伦理许可证编号13-k-a，2018年2月15日）。
数据可用性声明
本研究中提供的数据可向相应作者索取。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
工具书类
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