SIRT1介导的Sonic Hedgehog信号通路在子痫前期大鼠模型中的保护作用

摘要

介绍

子痫前期（PE）的特征是妊娠晚期高血压和蛋白尿（20^第个通常伴有急性肾功能衰竭、PE肾病、胎盘早剥、脑水肿和HELLP综合征[1]. PE的发病率高达2%至8%，被认为是全球孕妇和围产儿发病率和死亡率增加的主要原因之一[2]. 滋养层细胞浸润不足和子宫螺旋动脉重塑是PE的主要病理特征[三]，可增加血流阻力，引起一定程度的缺血缺氧，从而促进抗血管生成因子和炎症因子释放到血液循环中，触发妊娠全身反应[4,5]. 近年来对PE的认识取得了巨大进展，但未能准确阐明PE的发病机制，而阐明其发病机制对PE的预防、治疗和早期干预具有重要意义，从而降低PE的死亡率，改善预后。

沉默信息调节器1（SIRT1）是哺乳动物Sirtuins家族的成员，是一种NAD⁺-分子量为120kDa的依赖性组蛋白脱乙酰酶[6]. 现有证据表明，SIRT1可以通过受体（组蛋白/非组蛋白）的去乙酰化来调节基因沉默以及细胞的增殖、分化、衰老和能量代谢，从而在抗衰老、肿瘤发生、糖脂代谢和心血管系统的进展中发挥关键作用[7,8]. 此外，SIRT1被认为是预防炎症相关妊娠相关疾病的潜在治疗靶点[9]. 来自体外实验的证据表明，SIRT1通过调节某些信号来控制EVT侵袭和螺旋动脉重塑，从而与胎盘发育有关[10]. 然而，仍然没有足够的证据表明SIRT1在PE中的作用。近年来，SIRT1被证明通过调节Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在各种疾病中发挥作用，包括髓母细胞瘤[11]和大脑或脊髓损伤[12]. 更重要的是，PE期间胎盘组织中SHH的表达与氧化应激之间存在关联[13]. 因此，我们认为SIRT1通过介导SHH信号通路影响PE。胎盘缺血降低子宫灌注压（RUPP）大鼠模型已被用作临床前模型，以寻找PE治疗的新靶点，因为它在女性中具有许多临床明显的PE特征[2,14]. 在这方面，通过重组SHH蛋白、重组sirtuin 1和/或环胺治疗构建胎盘缺血RUPP模型，以验证我们的假设。

材料和方法

治疗

PE大鼠(n个=40）分为RUPP组、RUPP+rSIRT1（重组SIRT1）组、RUPP+rSHH（重组SHH蛋白，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）组和RUPP+rSIRT1+Cy（环胺，SHH途径抑制剂，圣克鲁斯生物技术）组n个每组=10。使用Alzet微渗透泵将rSIRT1或rSHH从GD11.5持续释放至GD18.5，进行腹腔植入。除了rSIRT1的持续释放外，RUPP+rSIRT1+Cy组的小鼠在GD11.5到GD18.5的饮用水中每天以25 mg/kg的剂量服用环胺。GD18.5将慢性留置导管插入大鼠颈动脉。在GD19.5上记录清醒动物的平均动脉血压（MAP）。实验程序的流程图如图所示。​图11.

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图1

实验程序的简要流程图。子痫前期（PE）、子宫灌注压降低（RUPP）、妊娠天数（GD）、rSIRT1（重组沉默信息调节蛋白1）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）。n个=每组10个

结果

SIRT1通过SHH途径对RUPP诱导的PE大鼠血压的影响

如图所示，所有大鼠的MAP测量结果。​图2，2假手术组、RUPP组、RUPP+rSIRT1组、RUPP+rSHH组和RUPP+r SIRT1+Cy组大鼠MAP分别为106.46±5.7mmHg、127.38±9.0mmHg，116.91±7.0mmHg；115.61±6.0mmHg和126.69±7.2mmHg。与假手术组（Tukey's HSD的单向方差分析）相比，RUPP组大鼠的MAP显著增加(P（P）<0.001），而UPP+rSIRT1组和RUPP+rSHH组大鼠的MAP相对于RUPP组降低（所有P（P）<0.05），但RUPP+rSIRT1+Cy组的患者无显著差异（全部P（P）> 0.05).

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图2

SIRT1通过SHH途径对RUPP诱导的PE大鼠平均动脉压（MAP）的影响。子痫前期（PE）、子宫灌注压降低（RUPP）、rSIRT1（重组沉默信息调节器1蛋白）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）、Cy（环胺）。^一 P（P）<0.05,^{美国航空航天局} P（P）<0.001与。假手术组；^b条 P（P）<0.05,^{英国广播公司} P（P）<0.01与。RUPP小组；^c（c） P（P）<0.05与。RUPP+rSIRT1组；^日 对<0.01与。RUPP+rSHH小组。n个每组=10。数据以平均值±标准差表示。各组之间的比较采用单因素方差分析，然后进行Tukey诚实显著性差异检验（Tukey’s HSD）

SIRT1通过SHH途径对RUPP诱导的血管生成失衡的影响

如图所示。​图3A，3A级Tukey’s HSD的单因素方差分析表明，RUPP可明显诱导大鼠血浆中游离VEGF水平降低(P（P）<0.001），但通过治疗SIRT1过度表达可以改善(P（P）<0.005）或SHH途径激活(P（P）<0.01），游离VEGF水平急剧增加。然而，SIRT1过度表达对VEGF水平的降低作用被环胺治疗所消除(P（P）< 0.005). 此外，还使用单向方差分析和Tukey氏HSD对各组血浆sFlt-1水平进行了检测和比较（图。​（图3B），第3页)与RUPP组相比，RUPP+rSIRT1组和RUPP+r SHH组大鼠的血浆sFlt-1水平明显降低（两者均为P（P）<0.001），但RUPP+rSIRT1+Cy组大鼠无显著差异(P>（P）0.05).

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图3

SIRT1通过SHH途径对RUPP诱导的血管生成失衡的影响。一母亲血浆中的游离血管内皮生长因子（VEGF）水平。B类血浆可溶性FMS样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）水平。子宫灌注压降低（RUPP）、rSIRT1（重组沉默信息调节蛋白1）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）、Cy（环胺）。^一 P（P）<0.05,^aa公司 P（P）<0.01,^{美国航空航天局} P（P）<0.001与。假手术组；^{英国广播公司} P（P）<0.01,^{英国广播公司} P（P）<0.005,^{英国广播公司} P（P）<0.001与。RUPP小组；^{中央控制中心} P（P）<0.005,^{中央通信委员会} P（P）<0.001与。RUPP+rSIRT1组；^日 P（P）<0.01,^{dddd（dddd）} 对<0.001与。RUPP+rSHH小组。n个每组=10。数据以平均值±标准差表示。各组之间的比较采用单因素方差分析，然后进行Tukey诚实显著性差异检验（Tukey’s HSD）

SIRT1通过SHH途径对PE大鼠血浆TNF-α、IL-6和NOx水平的影响

采用Tukey氏HSD单因素方差分析法分析大鼠血浆TNF-α、IL-6和NOx水平（图。​（图4）。4). 根据结果，与假手术组相比，RUPP大鼠的血浆IL-6和TNF-α水平升高（两者均为P（P）<0.001). 但是，与RUPP+rSIRT1+Cy组相比，RUPP+r SIRT1组大鼠的IL-6和TNF-α水平显著降低（IL-6：P（P）< 0.05; 肿瘤坏死因子-α：P（P）<0.001）和RUPP+rSHH组（IL-6：P（P）< 0.05; 肿瘤坏死因子-α：P（P）< 0.001). 此外，RUPP大鼠血浆NOx水平显著降低(P（P）<0.001），然而，它被rSIRT1拯救了(P（P）<0.005）或rSHH处理(对<0.01). RUPP+rSIRT1组和RUPP+r SHH组大鼠的血浆IL-6、TNF-α和NOx水平没有显著差异（所有P（P）> 0.05).

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图4

SIRT1通过SHH途径对PE大鼠血浆白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、亚硝酸盐和硝酸盐（NOx）水平的影响。子宫灌注压降低（RUPP）、rSIRT1（重组沉默信息调节蛋白1）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）、Cy（环胺）。^一 P（P）<0.05,^aa公司 P（P）<0.01,^{美国航空航天局} P（P）<0.001与。假手术组；^b条 P（P）<0.05,^{英国广播公司} P（P）<0.01,^{英国广播公司} P（P）<0.005,^{英国广播公司} P（P）<0.001与。RUPP小组；^c（c） P（P）<0.05,^{复写的副本} P（P）<0.01,^{中央通信委员会} P（P）<0.001与。RUPP+rSIRT1组；^d日 对<0.05,^日 P（P）<0.01,^{dddd（dddd）} P（P）<0.001与。RUPP+rSHH组。n个每组=10。数据以平均值±标准差表示。各组之间的比较采用单向方差分析，然后采用Tukey的真实显著性差异检验（Tukey’s HSD）

SIRT1通过SHH途径改善RUPP大鼠的胎儿结局

SIRT1通过测量幼崽重量、胎盘重量和产仔数（活仔数）介导SHH途径对胎儿结局的影响，这是使用Tukey's HSD的单向方差分析（图。​（图5）。5). 与假手术组相比，RUPP组大鼠的幼崽重量、胎盘重量和产仔数均显著下降P（P）< 0.001). 然而，RUPP+rSIRT1组和RUPP+r SHH组的大鼠妊娠结局显著改善，幼鼠体重显著增加（两者均为P（P）<0.01），胎盘重量（两者P（P）<0.01）和产仔数（两者P（P）< 0.001). 然而，SIRT1过度表达对RUPP大鼠妊娠结局的改善作用通过治疗SHH途径抑制剂Cy（幼鼠体重：P（P）< 0.05; 胎盘重量：P（P）< 0.01; 产仔数：P（P）< 0.001).

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图5

SIRT1通过SHH途径改善RUPP大鼠的胎儿结局。一瞳孔重量（g），B类胎盘重量（g），以及C类产仔量（活仔数）。子宫灌注压降低（RUPP）、rSIRT1（重组沉默信息调节蛋白1）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）、Cy（环胺）。^一 P（P）<0.05,^aa公司 P（P）<0.01,^{美国航空航天局} P（P）<0.001与。假手术组；^{英国广播公司} P（P）<0.01,^{英国广播公司} P（P）<0.001与。RUPP小组；^c（c） P（P）<0.05,^{复写的副本} P（P）<0.01,^{中央通信委员会} P（P）<0.001与。RUPP+rSIRT1组；^d日 P（P）<0.05,^ddd（ddd） P（P）<0.005,^{dddd（dddd）} P（P）<0.001与。RUPP+rSHH组。n个每组=10。数据以平均值±标准差表示。各组之间的比较采用单向方差分析，然后采用Tukey的真实显著性差异检验（Tukey’s HSD）

SIRT1及其蛋白在大鼠胎盘SHH信号通路中的表达

如图所示。6A–D级与假手术组相比，RUPP大鼠的胎盘组织显示SIRT1、PTCH1和GLI2蛋白表达显著下调（所有P（P）<0.001，Tukey's HSD的单向方差分析）。与RUPP组相比，RUPP+rSIRT1组大鼠胎盘组织中SIRT1、PTCH1和GLI2的蛋白表达显著上调（所有P（P）<0.001，Tukey's HSD的单向方差分析），而与RUPP组相比，RUPP+rSHH组的PTCH1和GLI2上调（所有P（P）<0.001，Tukey's HSD的单因素方差分析），但SIRT1无显著差异(P（P）> 0.05). 此外，与RUPP+rSIRT1组相比，RUPP+r SIRT1+Cy组PTCH1和GL2的表达下调（两者均下调P（P）<0.001，Tukey's HSD的单因素方差分析），而SIRT1无显著差异(P（P）> 0.05). 基因表达的类似结果PTCH1型和GLI2型作为蛋白质表达（图。6E–F).

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图6

SIRT1和SHH信号通路相关蛋白在大鼠胎盘中的表达。一–D类采用Western blotting法检测大鼠胎盘中SIRT1（沉默信息调节器1）、Patched-1（PTCH1）和GLI家族锌指2（GLI2）的蛋白表达。E类–F类SHH通路相关基因的相对mRNA表达(PTCH1型和GLI2型)用qRT-PCR检测大鼠胎盘。子宫灌注压降低（RUPP）、rSIRT1（重组SIRT1蛋白）、rSHH（重组Sonic Hedgehog蛋白）、Cy（环胺）。^{原子吸收光谱} P（P）<0.005,^{美国航空航天局} P（P）<0.001与。假手术组；^{英国广播公司} P（P）<0.001与。RUPP小组；^{中央通信委员会} P（P）<0.001与。RUPP+rSIRT1组；^{dddd（dddd）} P（P）<0.001与。RUPP+rSHH组。n个每组=10。数据以平均值±标准差表示。各组之间的比较采用单向方差分析，然后采用Tukey的真实显著性差异检验（Tukey’s HSD）

讨论

不同的动物模型可以通过复制PE的不同环节来模拟PE这一多因素疾病的病理生理过程，其中RUPP动物模型似乎是目前研究中最常用的研究PE潜在机制的动物模型[18,19]. 我们的工作与之前的一份报告一致，该报告显示RUPP大鼠胎盘中SIRT1显著下调[20]. 同样，临床结果表明，与健康孕妇相比，PE患者的SIRT1血浆水平较低[21]免疫组化分析还发现，与妊娠31至40周的女性相比，PE患者的合胞体滋养层细胞中SIRT1水平降低[22]. 与正常妊娠胎盘和宫内发育迟缓（IUGR）胎盘相比，PE患者胎盘SIRT1 mRNA表达降低[23]. 此外，体外实验表明，与HUVEC基础对照组相比，与子痫前期血清孵育的人脐内皮细胞（HUVECs）中SIRT1也降低[20]. 此外，以前的研究发现，白藜芦醇通过激活SIRT1依赖性自噬，可以保护HRT8/Svneo免受H诱导的氧化应激反应的影响₂O（运行）₂[24]. 在本研究中，SIRT1可以降低RUPP大鼠的MAP并改善妊娠结局，幼鼠体重、胎盘重量和产仔数显著增加，表明SIRT1在PE中的潜在作用。

越来越多的证据表明RUPP大鼠模型中血管生成因子的失衡，表现为sFlt-1增加和VEGF减少[17,25]我们的研究也证实了这一点。VEGF被认为是最强的血管生成诱导因子，在维持血管完整性和通透性方面起着关键作用[26]并影响血管中NO和前列环素的生成，调节血管平滑肌张力，调节血压[27]. 外源性sFlt-1诱导的腺病毒可引起妊娠大鼠血液中游离VEGF和PIGF的显著降低，导致高血压、蛋白尿、肾小球血管内皮增生或其他类似PE的改变[28]. Hastie R等人报道，SIRT1的激活可以减少滋养细胞中sFlt-1的分泌[26]. 内皮细胞和胎盘组织NO释放的变化可能改变PE的发病机制[29]. 据报道，与血压正常的孕妇相比，PE患者血浆中NO代谢物的浓度急剧下降[30,31]. 此外，全身炎症被证明是PE发病的原因[32]而SIRT1基因的敲除可以增强LPS诱导的NLRP3炎性体的激活，从而促进炎症信号转导和IL-1β的分泌[9]. 此外，SIRT1可以抑制IL-6引起的HUVEC和PE患者血清中HMGB1和HSP70的释放，保护细胞免受死亡[20]. 在本研究中，重组SIRT1治疗后，RUPP大鼠血浆中VEGF和NOx水平升高，sFlt-1、TNF-α和IL-6下调，表明SIRT1过度表达可能通过调节PE大鼠的血管生成失衡发挥治疗作用，减轻炎症。

此外，刺猬（HH）最早发现于果蝇属在人类中，有三个同源基因，包括Sonic Hedgehog（SHH）、India Hedgehong（IHH）和Desert Hedgeho（DHH），它们对胚胎发育至关重要[33]. 此外，Wang Z等人发现PE患者原代滋养层细胞SHH生成增加，表型改善[34]. 目前的证据表明，绒毛外细胞滋养层细胞侵袭不足、子宫螺旋动脉重塑功能障碍以及由此导致的胎盘缺血和缺氧是PE的主要特征[35]. 近年来，SIRT1可以调节SHH信号通路，参与疾病的发生发展。例如，白藜芦醇（SIRT1的激活剂）通过激活SHH信号，在氧-葡萄糖剥夺/复氧损伤后增加生存能力，减少凋亡，并刺激神经突起生长[36]. 此外，它可能通过SIRT1激活SHH信号来介导，以增强成纤维细胞系NIH3T3的活性，NIH3T_用作模型细胞并用药物治疗[12]. PTCH1是GLI的主要靶基因，PTCH1的表达可以反映SHH信号通路的活性[37,38]. 先前的文献表明，与正常胎盘相比，PE胎盘中PTCH1和GLI2降低，表明PE中SHH通路受到抑制，这可能通过下调胎盘中IGF轴部分影响出生体重[39]. 在我们的RUPP大鼠胎盘中，PTCH1和GLI2的mRNA和蛋白表达确实低于对照组。Luca Tiberi等人发现SIRT1组蛋白脱乙酰化酶导致Gli1和Gli2 SHH效应器的表观遗传抑制[11]. 然而，正如Xie Y等人所证明的那样，SIRT1在赖氨酸757处脱乙酰并稳定GLI2蛋白，从而激活SHH信号[40]. 在我们的研究中，SIRT1的过度表达可以上调PE大鼠胎盘PTCH1和GLI2的mRNA和蛋白表达，表明SIRT1是SHH通路上游的调节器[12]. 上述暗示SHH信号的激活可能与SIRT1脱乙酰基有关，这有待进一步研究。此外，我们还发现重组SHH在PE治疗中具有潜在的治疗潜力，可显著改善血压、血管生成失衡、炎症和妊娠结局。此外，SIRT1对PE妊娠结局的改善作用可以被SHH信号通路抑制剂环胺逆转，这进一步证明了SIRT1介导的SHH通路在PE治疗中的潜在治疗作用。虽然我们觉得目前的结果令人兴奋，但重要的是要认识到它们并非没有局限性。首先，我们使用了相对较小的样本量，虽然我们发现了一些重要的发现，但较大的样本量可能会产生额外的差异。其次，我们研究中的rSIRT1和rSHH治疗并没有完全使RUPP大鼠的血压和其他指标正常化。其原因尚不清楚，但可能是因为所使用的rSIRT1和rSHH的剂量不同，未来应使用不同的剂量。最后，由于时间和资金限制，应进一步探索rSIRT1和rSHH治疗的结合。

总之，在PE大鼠胎盘组织中，SIRT1表达下调，SHH信号通路受到抑制。SIRT1通过调节SHH信号通路在一定程度上改善PE大鼠的血压、血管生成失衡、炎症和妊娠结局。这些结果表明，针对高危PE患者的SIRT1介导的SHH信号通路可能对母亲和新生儿具有潜在的临床益处，并为开展其他研究以阐明PE的潜在机制和制定有效干预措施提供了平台。

声明

脚注

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