靶向新抗原用于癌症免疫治疗

肿瘤相关抗原

肿瘤相关抗原有几个亚类，如肿瘤过度表达蛋白、肿瘤睾丸抗原和癌胚抗原。第一代免疫治疗性癌症疫苗是针对肿瘤组织中高表达的蛋白质设计的。大多数这些蛋白在正常细胞中表达，在肿瘤细胞中显著上调。TAA的实例包括人类表皮生长因子受体2（HER2/neu，或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，ERBB2）、端粒酶逆转录酶（TERT或hTERT）和酪氨酸酶（TYR）[18——20].

癌-睾丸抗原（CTA）和细胞系分化抗原（CDA）是TAA的两个特殊亚群。CTA主要在成年男性生殖细胞中表达，有时在卵巢和胎盘中表达。[21——23]. 纽约食管鳞状细胞癌-1（NY-ESO-1）和黑色素瘤抗原基因（MAGE）超家族成员是过继T细胞治疗中最常见的CTA，作为激活免疫反应的靶点。罗森博格进行的一项先导性试验使用经NY-ESO-1反应性TCR工程的自体T淋巴细胞，用HLA-0201治疗转移性滑膜细胞肉瘤或黑色素瘤患者⁺这些癌症是NY-ESO-1阳性。结果显示，滑膜细胞肉瘤和黑色素瘤的总临床有效率分别为61%（11/18）和55%（11/20）。据阐明，NY-ESO-1（通常由其他CTA共享）在肿瘤细胞内异质性表达，因此理论上可能限制基因工程T细胞对该蛋白的免疫治疗效果[24].

与CTA类似，其他肿瘤过度表达的TAA，如CDA、前列腺特异性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）和前列腺酸性磷酸酶（PAP），也可能作为T细胞的抗原靶点。然而，基于TAA的癌症疫苗在临床试验中未能产生令人满意的结果[25,26]. 美国食品和药物管理局（FDA）批准的第一种癌症疫苗Sipuleucel-T使用PAP蛋白和其他免疫刺激因子作为抗原靶点。该疫苗仅显示前列腺癌患者的中位生存时间略有改善[27]. 现代TAA疫苗临床试验结合免疫治疗，如ICI，可能显示出比单一治疗更有希望的临床结果[28]. 然而，即使TAA在正常组织中的表达几乎无法检测到，在免疫系统发育过程中产生的对TAA的免疫耐受性可能会导致TAA疫苗引起的反应幅度。

癌基因病毒衍生抗原

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）和人乳头瘤病毒（HPV）等致癌病毒已被证明与多种癌症的发生有关，包括宫颈癌、鼻咽癌和口腔癌。来自HPV和EBV的非人类来源的癌相关抗原是潜在的癌症疫苗替代品[29——31]. 主要依赖体液免疫反应的经典HPV疫苗在降低HPV相关癌症发病率方面显示出预防作用。许多临床试验表明，来自高危HPV亚型16或18抗原的治疗性HPV疫苗可以激活CD8⁺T细胞通过细胞免疫反应，从而诱导对受感染的癌细胞的靶向细胞毒性[30]. 这些试验表明了使用具有特定非自身抗原的致癌病毒疫苗的可行性。

肿瘤特异性抗原/新抗原

与TAAs不同，TSAs/新抗原是来源于癌症基因组遗传改变的突变肽，在肿瘤细胞中特异表达，在正常组织中不存在，但可能引发抗癌免疫反应。由于新抗原靶向免疫治疗在肿瘤细胞内的表达受到限制，因此显示出较高的肿瘤特异性并降低了非靶向毒性。过继性T细胞治疗的临床研究表明，一名广泛转移的胆管癌患者在接受多种化疗方案后，肿瘤浸润性CD4输注后肿瘤明显消退⁺的T细胞体外扩增，并且这些T细胞识别来源于突变的免疫原性新抗原ERBB2IP公司（ERBB2IP E805G），编码ERBB2相互作用蛋白，在原发性和复发性肺部病变中高度表达。这项研究还表明，基于新抗原的个性化免疫疗法可以激发针对肿瘤细胞的强大抗癌免疫反应。另一项使用新抗原为基础的癌症疫苗的临床研究表明，通过接种多种个性化新抗原，癌症患者可以通过扩大预先存在的新抗原特异性T细胞和新抗原特异的T细胞储备，实现显著的肿瘤消退体内[32]. 与基于CTA的癌症疫苗或过继细胞治疗相比，含新抗原的癌症疫苗具有多靶点和广谱等优点。此外，新抗原疫苗可以通过产生记忆T细胞诱导持续的抗肿瘤免疫反应[16,33,34].

新抗原鉴定

新抗原鉴定依赖于来自配对肿瘤和正常组织的DNA和RNA样本的高通量测序数据。通过使用生物信息学方法分析全外显子序列（WES）和mRNA转录组测序（RNA-Seq）数据，可以确定可能导致新抗原表位的DNA和RNA水平的突变。通常，非同义单核苷酸变体（SNV）和DNA插入或缺失是多个研究中新抗原预测的唯一两个来源[32,35]. 然而，仅仅关注这两种类型的突变往往会低估肿瘤可能显示的潜在新抗原。据报道，新抗原可以来源于许多其他类型的来源，包括（1）基因融合事件；（2） 剪接位点创造突变（SCM）；（3） mRNA内含子保留；和（4）内源性逆转录因子[36]. 值得注意的是，来自其他类型突变（如基因融合和SCM）的新抗原往往比SNV衍生的新抗原具有更强的免疫原性，这表明加入更多的新抗原来源不仅会增加疫苗中的新抗原数量，而且会提高新抗原疫苗的质量和效力[37,38]. 接下来，通过计算将已识别的突变转化为突变肽（对于I类HLA，长度通常为8至15个氨基酸，对于II类HLA则为13至25个氨基酸），并筛选出不同于人类蛋白质组中任何野生型序列的新肽。最后，计算与新抗原表达、呈现和识别相关的多项测量值，以建立新抗原预测的综合模型。最近的一项调查研究表明，与新抗原免疫原性相关的重要测量包括：（1）突变肽与被研究患者HLA等位基因之间的结合亲和力；（2） 肽-HLA复合物的结合稳定性和（3）宿主基因的表达[39]. 除了来自WES和RNA-Seq数据的特征外，描述突变肽和T细胞受体之间识别潜力的其他特征也可以纳入新抗原预测系统[40]（图2)。

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图2

新抗原预测和验证工作流程。左侧面板对应于的工作流生物信息学新抗原预测。接下来，根据新抗原预测获得的假定新抗原体外使用质谱、Elispot和MHC四聚体等多种技术选择临床应用的呈递和免疫原性新抗原的验证

合成长肽疫苗

当使用肽疫苗时，重要的是选择短免疫原性序列（8到10-mer）或长序列（25-mer），后者需要额外的处理步骤将其切成免疫原性肽。它能克服免疫耐受并成功诱导CD4⁺和CD8⁺T细胞通过将短肽延伸为长肽的反应[41]. 通过皮下途径将肽基疫苗注射到患者体内后，这些肽被注射部位周围的抗原呈递细胞（APC）摄取。通过内吞和溶酶体处理，这些APC成熟并将抗原表位装载到MHC/HLA分子上。装载MHC-I或MHC-II分子的成熟APC迁移到邻近的引流淋巴结，在那里它们呈现新抗原并激活CD8⁺细胞毒性T细胞或CD4⁺T辅助细胞。T细胞的激活需要来自MHC/HLA–Ag–TCR三级复合物的一级信号和基于细胞-细胞相互作用和分泌免疫调节剂（如IFN-γ）的二级信号[42]. 接下来，活化的T细胞进行克隆扩增，离开淋巴结进入循环系统，并迁移到肿瘤部位，在那里它们识别表面存在同源新抗原的肿瘤细胞，并进行细胞杀伤。虽然基于肽的新抗原疫苗已被应用于多个临床试验，但新抗原肽的应用面临着以下挑战：快速廉价的制造，缺乏天然翻译后修饰，以及由于长度、电荷、，和疏水性。

Poly-ICLC是一种合成的双链RNA（dsRNA）模拟物，可刺激TLR3和MDA5。通过刺激MDA5，Poly-ICLC能有效诱导IFN-I和IL-15。它还可以促进T细胞扩张和增强T细胞浸润，使其成为肽癌疫苗的有效佐剂[43]. 近年来，几项主要的临床试验已经测试了肽癌疫苗的疗效。Ott等人对NeoVax进行了临床试验，这是一种针对黑色素瘤患者的个体化新抗原肽疫苗({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01970358”，“term_id”：“ncT019700358”}}NCT01970358号). 患者经病理证实为IIIB/C期和IVM1a/b期高危黑色素瘤患者，术后平均18周后接受NeoVax治疗。用Poly-ICLC配制针对多达20种新抗原的个体化肽疫苗。结果表明，这种治疗方法安全且具有免疫原性[32].

2021年，Ott等人公布了八名参与本试验的黑色素瘤患者的随访结果，平均随访时间为55个月。结果显示，8名患者均存活，6名患者没有活动性疾病的迹象。对患者外周血中T细胞的检测表明，新抗原特异性T细胞反应在接种NeoVax疫苗后的黑色素瘤患者中持续数年，新抗原特异性T细胞表现出记忆表型[44]. 值得注意的是，在Ott等人针对新诊断的胶质母细胞瘤进行的另一项新抗原特异性肽疫苗试验中，结果表明外周血新抗原特异的T细胞可以迁移到颅内胶质母细胞肿瘤[45].

理论上，肿瘤细胞的裂解会释放出新的肿瘤新抗原或TAA，从而触发新的抗肿瘤免疫反应。科学家随后还证明，NeoVax诱导T细胞反应的表位扩散，表明肿瘤细胞溶解，这也意味着肿瘤特异性细胞毒性谱的拓宽。然而，本研究中的三名患者在接种疫苗后26、40和40个月复发，另外两名患者在疫苗接种后不久复发，但在抗PD-1 pembrolizumab治疗后很快就完全缓解了[44].

过去十年来，免疫检查点抑制剂彻底改变了癌症患者的治疗。基于解锁免疫抑制信号原理的抗PD-1/PD-L1抗体在多种肿瘤类型中显示出显著的抗肿瘤活性[46]. 考虑ICI和其他抗癌疗法的组合，以确定该组合对癌症患者是否优于单一疗法，这是很自然的。Ib期试验({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT02897765”，“term_id”：“ncT0289765”}}NCT02897765号)研究个性化新抗原疫苗NEO-PV-01联合PD-1阻断剂治疗晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌或膀胱癌患者的疗效。在本次试验中生物信息学针对肿瘤突变负荷高的患者进行新抗原预测和选择，生成相应的良好生产实践级新抗原肽，然后与佐剂多聚免疫细胞化学混合并皮下注射。尼沃单抗在疫苗接种后、疫苗接种后和疫苗接种后期间服用。结果表明，黑色素瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌患者的总有效率分别为59%、39%和27%；中位无进展生存期（PFS）分别为23.5个月、8.5个月和5.8个月；1年总生存率分别为96%、83%和67%。这些数据并不亚于PD-1抗体单一疗法的历史数据。接种疫苗后也观察到表位传播，并且与较长的PFS相关[47].

核酸（DNA/mRNA）疫苗

利用核酸疫苗传递DNA或mRNA编码的靶向表位已成为预防传染病和治疗癌症的通用技术[48,49]. 基于DNA/mRNA的新抗原疫苗通过与肽基疫苗类似的处理步骤发挥作用，但DC中的额外翻译和/或转录步骤除外[49,50]. 基于核酸的疫苗已经以各种形式提供，包括由递送载体包裹，如脂质纳米粒（LNPs），这些纳米粒是通过乙醇注射纳米沉淀法通过混合酸化RNA和乙醇中溶解的脂质制备的[50]. 与肽相比，核酸制剂有助于抗原的连续有效表达和免疫刺激。重要的是，核酸制剂从细胞内产生抗原肽，避免了昂贵和困难的蛋白质纯化，并为蛋白质提供了天然的翻译后修饰。核酸疫苗在疗效、缩短设计和制造时间以及生产的可扩展性和可靠性方面具有优势[50]. 相比之下，DNA携带遗传信息，需要进入细胞核来表达抗原，而mRNA则以更好、更集中的方式指导抗原的产生，而不需要进入细胞核。与DNA疫苗相比，mRNA疫苗的另一个明显优势是在非分裂细胞中的表达相对较高，并且没有整合到宿主基因组中的风险。此外，考虑到其固有的免疫原性特征，mRNA可以作为佐剂发挥作用，并且需要较低的剂量来诱导最佳免疫反应，使其成为新抗原疫苗的一个安全而有前景的平台。目前，新抗原靶向DNA/mRNA癌症疫苗也已在各种临床试验中进行了测试。

一种基于新抗原预测编码多达20种新抗原的个性化RNA-lipoplex新抗原疫苗RO7198457，在1b期试验中对之前接受过重度治疗的晚期实体瘤患者进行了测试({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT03289962”，“term_id”：“NCT03289962”}}NCT03289962号). 总共有29名患者接受了递增剂量的RO7198457单药治疗，132名患者接受RO71984.57联合抗PD-L1抗体阿替佐单抗治疗。本研究中最常见的肿瘤类型为非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和乳腺癌；大多数患者PD-L1表达水平较低。根据至少接受过一次肿瘤评估的患者的数据，该试验显示，在单药治疗队列中，客观缓解率为4%（1/26），稳定发病率为40%（9/26），在联合队列中，目标缓解率为8%（9/108），稳定患病率为49%（53/108）。RO7198457在两组的大多数患者中诱导了新抗原特异性T细胞反应。

另一种信使核糖核酸脂质包封的基于核糖核酸的新抗原疫苗mRNA-4157在1期试验中进行了测试({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT03313778”，“term_id”：“ncT033137078”}}NCT03313778号). 在79例接受mRNA-4157治疗的患者中，16例接受单药治疗，63例联合免疫检查点抑制剂pembrolizumab治疗。mRNA-4157安全且耐受性良好。在联合组中观察到三种完全缓解（CR）（一种是头颈部鳞癌（HNSCC），一种是微卫星不稳定性高（MSI-H）结直肠癌，另一种是MSI-H前列腺癌）和八种部分缓解（PR）（一个是膀胱癌，四种是HNSCC，两种是小细胞肺癌，还有一种是MS I-H子宫内膜癌）。特别是在10例CPI初治HPV阴性的HNSCC患者中，有效率为50%（1 CR，4 PR，4稳定疾病（SD）），mPFS为9.8个月，这与pembrolizumab单药治疗的约14.6%的有效率和2.0个月的mPFS相比是有利的[51].

DC疫苗和新抗原特异性TCR-T细胞治疗

作为替代方案，DC疫苗[52]含有从患者外周血中分离的自体树突状细胞，并含有新抗原肽体外在输注到体内之前，从而绕过抗原捕获、处理、呈现和DC成熟的过程体内[53].

最近，第一阶段试验的结果({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT02956551”，“term_id”：“ncT02955551”}}NCT02956551号)被披露了。研究了个性化新抗原肽脉冲自体DC疫苗（Neo-DCVac）治疗12例严重治疗的转移性肺癌的安全性和有效性。该疫苗是安全的，客观有效率为25%，疾病控制率为75%，mPFS为5.5个月，中位总生存期（mOS）为7.9个月。当与ICI治疗联合使用时，Neo-DCVac在四名接受疾病控制的患者（两名PR，两名SD）中显示出协同治疗效果，这些患者之前对ICI治疗没有任何初始反应或复发。这些结果表明，Neo-DCVac可以诱导特异性T细胞免疫和治疗益处[54]. 该试验首次证明了基于新抗原的DC疫苗对癌症患者的疗效。

TCR工程化T细胞治疗是新抗原应用的另一种选择，这需要来自受体能够识别自身肿瘤特异性新抗原的患者的基因工程化T淋巴细胞。与DC疫苗试验相比，目前还没有新抗原特异性TCR-T细胞治疗的临床试验结果，仅发表了病例报告。

除了之前讨论过的胆管癌患者的肿瘤含有新抗原ERBB2IP E805G的病例报告外，罗森博格还报告了几个以类似方式治疗的病例，包括一名注射KRAS-G12D靶向TIL的转移性结直肠癌患者和一名分别针对SLC3A2、KIAA0368、CADPS2和CTSB中四种突变进行TIL治疗的难治性HR阳性转移性乳腺癌患者。另外两例均获得临床疗效，接受T细胞疗法联合白细胞介素-2和ICI治疗的乳腺癌患者表现出超过22个月的完全持久消退，而仅接受KRAS-G12D靶向TIL输注的转移性结直肠癌患者在治疗后9个月进展[55,56].

然而，基于新抗原的T细胞治疗的最大挑战之一是识别和分离这些突变特异性TIL和TCR的劳动密集型过程。关于基于新抗原的DC和TCR-T治疗，值得注意的是，将免疫细胞输注到人体中可能会导致严重甚至致命的副作用。细胞因子释放综合征（CRS）是其中最常见的一种，它会导致机体免疫细胞激活，释放大量细胞因子[57].

基于公共新抗原的癌症疫苗

与纯粹的个人化新抗原相比，公共或共享新抗原来源于癌基因的驱动突变或基因组中的其他热点突变。它们被表征为存在于特定癌症亚型患者亚群中的免疫原性表位。因此，公共新抗原的发现取决于从相当大的患者库中分析个体化新抗原。一旦确定并评估其免疫原性体外，公共新抗原可以提前制造，并在基因检测后随时为患者提供。公共新抗原的一个主要优点是，它们可以快速应用于癌症患者，尤其是那些晚期癌症患者和治疗窗口较短的患者。此外，含有公共新抗原的癌症疫苗将降低治疗成本。

迄今为止，一些研究试图确定公共新抗原以及与公共新抗原相关的TCR。公共新抗原的一个例子对应于KRAS上G12D的突变，该突变经常在胰腺癌、结肠癌、非小细胞肺和结直肠癌中发现[33]. 先前讨论的转移性结直肠癌患者的病例报告显示，对KRAS-G12D靶向TIL有初步反应。同样，TP53是一种在大量癌症中广泛突变的著名抑癌基因，具有广泛的热点突变，并被多种癌症共享[58]. Malekzadeh等人开发了一种TP53特异性筛选试验，以评估T细胞对与TP53热点突变相关的新表位的反应。因此，在相当一部分患者中发现了共同的抗原特异性T细胞[59].

相比之下，Okada等人发现了一种TCR，该TCR能够识别包含HLA-A2呈现的H3.3K27M突变的合成肽，HLA-A2是弥漫性中线胶质瘤的驱动突变和诊断生物标志物。用TCR转导的T细胞在小鼠中显示出显著抑制胶质瘤异种移植物肿瘤进展的能力[60]. 类似地，van der Lee等人发现了一种TCR，能够识别发生在约30%急性髓性白血病中的NPM1热点移码突变。临床前实验证实了用该TCR转导的T细胞的抗肿瘤反应[61].

目前，可以从ClinicalTrials.gov中跟踪大约40项使用公共癌症新抗原的临床研究。大多数这些公共新抗原临床试验仍在进行中，而一些早期试验报告了良好的结果。在一项开放标签的单臂I期临床试验中观察到高安全性和免疫原性({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01250470”，“term_id”：“ncT0125470”}}NCT01250470型)其中9名复发性恶性胶质瘤患者接种了一种15氨基酸长的survivin肽（也称为杆状病毒凋亡抑制因子重复序列5，BIRC5），该肽含有不同的八至十氨基酸免疫反应表位，具有相同的C57M突变[62]. 这种突变肽疫苗能够诱导体液免疫反应和某些HLA等位基因限制性T细胞反应体内一些患者出现部分缓解或病情稳定至少六个月。此外，另一项关于survivin在神经内分泌肿瘤中作用的研究表明，电离辐射可以诱导人类类癌细胞系中survivine的表达[63].

在另一个设计类似的试验中(｛“type”：“临床试验”，“attrs”：｛“text”：“NCT02261714”，“term_id”：“NCT02261714”｝｝NCT02261714号)低剂量或高剂量的KRAS突变肽TG01（由7个已知的G12和G13密码子致癌突变组成）被用作疫苗，与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）联合用药，以增强T细胞反应，在32例接受手术切除（R0或R1）的I或II期胰腺癌患者中，93.75%的患者存在可检测的KRAS突变。结果表明，低剂量可产生良好的安全性结果，而高剂量组观察到一些严重的不良反应，可能与治疗有关。两种剂量都产生了强烈的细胞免疫反应，受试者2年和3年的存活率分别约为72%和37%[64]. 综上所述，公共新抗原疫苗已证明其作为癌症治疗靶点的巨大价值。

不适用。