抗血管生成治疗逆转免疫抑制性乳腺癌微环境

血管内皮生长因子

作为肿瘤血管生成的关键因子，VEGFs可以通过缺氧和低pH值诱导免疫抑制性TME[11]. VEGF可与VEGFR1（FLT1）结合，并阻止树突状细胞（DC）成熟和抗原提呈[12]从而阻碍T细胞活化并限制适应性抗肿瘤免疫反应[13]. 外周血管内皮生长因子水平升高与外周成熟树突状细胞减少相关，抗血管内皮生长激素治疗可以增加成熟树突形细胞的数量并逆转血管内皮生长素介导的免疫抑制[14]. VEGF-A水平升高促进CD8⁺通过增强PD-1的表达而导致T细胞衰竭[15]并有助于Treg的扩散[16]和髓源性抑制细胞（MDSC）积累[17]在TME中。然而，Palazon等人证明缺氧和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）支持CD8获得效应表型⁺T细胞，但激活的效应器CD8⁺T细胞可产生高水平的VEGF-A[18]. 上述结果表明，VEGF与TME免疫状态之间的调节机制有待进一步研究。

此外，VEGF-A诱导胸腺细胞选择相关HMG-bOX（TOX）介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）耗竭[19]. TOX是T细胞发育中的一个关键转录因子，在T细胞耗竭中起重要作用[20]. VEGF-A上调TOX的表达，并在CD8中启动TOX介导的重编程到耗尽状态⁺T细胞[19]. VEGFR-2敲除下调TOX表达并重新激活肿瘤特异性耗尽的CD8⁺T细胞，表明靶向VEGF/VEGFR-2轴的治疗潜力[19].

血管生成素2

活化的血管生成素2（ANG2）上调粘附分子表达，并招募骨髓间充质干细胞（BMSCs）、Tregs和M2样巨噬细胞表达ANG受体（酪氨酸激酶与Ig和EGF同源域-2，TIE-2）[7,21]. 此外，ANG2通过抑制TNF-α分泌抑制单核细胞抗肿瘤功能[22]并通过白细胞介素10（IL-10）促进Treg激活和CTL抑制[23].

胎盘生长因子

胎盘生长因子（PlGF）是诱导血管生成表型的VEGF家族成员，直接与VEGFR1相互作用，刺激肿瘤血管生成，促进巨噬细胞向M2样表型复极，促进免疫逃逸[24]. PlGF阻断诱导血管正常化和巨噬细胞表型从M2样状态向M1样状态的极化[25].

巨噬细胞

在一项评估三阴性乳腺癌（TNBC）免疫治疗的临床试验中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上PD-L1的表达水平与免疫治疗反应呈正相关，表明TAM在TME中的重要作用[34]. 根据功能和分泌细胞因子的不同，巨噬细胞分为M1型（抗血管生成表型）和M2型（促血管生成表型[35——37]. M1样巨噬细胞通过分泌抗血管生成细胞因子（IL-12和TNF-α）抑制血管生成并诱导血管成熟[38,39]. M1样巨噬细胞分泌IL-12，使其他TAM极化为M1样表型，通过正反馈回路进一步降低微血管密度[39——41]. 然而，以前的研究表明，在TME中M2类巨噬细胞比M1类巨噬细胞更占优势[37,39]. M2类巨噬细胞通过产生促血管生成生长因子（VEGF-A、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF））、促血管生成CXC趋化因子（CXCL8/IL-8和CXCL12）和血管生成相关因子（TGF-β和TNF-α）促进肿瘤血管生成。这些因子促进内皮细胞的迁移和增殖，并将M1样巨噬细胞极化为M2样表型。

抗血管生成治疗的成功部分取决于巨噬细胞从M2样表型向M1样表型的极化[42]. 用抗克隆刺激因子1（CSF1）抗体清除巨噬细胞可消除抗血管生成治疗的益处，表明巨噬细胞在抗血管生成疗效中的重要性[43]. 在小鼠乳腺癌模型中，用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞抑制肿瘤血管生成和生长[44,45].

表达TIE2的巨噬细胞（TEMs）是TAMs的另一种独特亚型，具有促进肿瘤血管生成的能力[43]. TEMs可与内皮细胞或肿瘤细胞分泌的ANG2结合，进一步促进血管生成[46]. 靶向抑制TEM已被证明可诱导肿瘤血管正常化并促进肿瘤退化[47].

树突状细胞

树突状细胞是TME的一种重要的适应性免疫成分，根据成熟状态调节肿瘤血管生成。成熟树突状细胞通过分泌抗血管生成细胞因子（如IL-12和IL-18）抑制肿瘤血管生成[48,49]. 此外，成熟树突状细胞释放干扰素-α（IFN-α）直接抑制内皮细胞的增殖[50]. 在TME中，肿瘤细胞通过释放多种细胞因子（如VEGF、β-防御素、CXCL12、HGF和CXCL8）从外周血中招募未成熟DC，这些细胞因子缺乏抑制肿瘤血管生成的能力[14].

CD8（CD8）⁺CTL公司

CD8（CD8）⁺CTL通过分泌IFN-γ抑制肿瘤血管生成[51,52]直接抑制内皮细胞增殖和肿瘤血管化[53]并将M2样TAM极化为M1样表型[54]. IFN-γ还通过降低VEGF-A水平和增加CXCL9、CXCL10和CXCL11水平，促进血管成熟，促进肿瘤血管重塑，抑制肿瘤生长[55,56].

Th1、Th2和Th17细胞

CD4细胞⁺T辅助细胞1（Th1）通过在TME中产生IFN-γ，帮助肿瘤血管正常化。在乳腺癌模型中，Th1细胞激活可提高周细胞覆盖率，减少肿瘤血管的异常增生，并诱导血管正常化[57,58]. Th1细胞还通过将M2样TAM极化为M1样巨噬细胞并诱导DC成熟来抑制肿瘤血管生成[8,59]. 与Th1细胞不同，Th2细胞通过表达IL-4、IL-5和IL-13招募M2样巨噬细胞促进肿瘤血管生成[32,41,60]. Th17细胞，CD4的另一种亚型⁺T辅助细胞通过表达IL-17促进内皮细胞增殖和肿瘤血管生成，IL-17是乳腺癌的不良预后因子[61,62].

特雷格斯

TME缺氧条件通过CCL28和VEGF在肿瘤细胞中的过度表达促进Treg增殖[63,64]. Tregs分泌VEGF，招募内皮细胞，直接促进肿瘤血管生成[65]. 此外，Tregs通过抑制Th1细胞活化和将TAM极化为M2样表型间接促进肿瘤血管生成[35,41]. 靶向清除Tregs可降低TME中VEGF水平并抑制肿瘤血管生成[66].

MDSC公司

在TME中，MDSC通过产生VEGF、FGF2、Bv8和基质金属蛋白酶（MMP9）促进肿瘤血管生成[67,68]. CD11b型⁺第1组⁺MDSC增加肿瘤内血管密度并减少肿瘤坏死[69,70]. 此外，MDSCs可以通过获得内皮细胞特性直接参与肿瘤血管生成[69,71]. TME中MDSC减少与肿瘤血管生成减少和肿瘤生长抑制相关[72,73]. 一些研究已经将MDSC的积累与疾病进展过程中肿瘤内VEGF浓度的增加联系起来[74]. VEGF刺激MDSC的招募，促进免疫抑制和血管生成[75,76]. MDSC通过分泌大量VEGF来克服VEGF抑制，或通过激活VEGF诱导的促血管生成信号通路来干扰VEGF靶向治疗的效果[77].

高剂量还是低剂量？

高剂量或长期的抗血管生成治疗会导致体外大规模血管修剪，从而加剧TME中的缺氧或酸中毒，并促进免疫抑制，这表明需要进一步探索抗血管生成药物的最佳剂量[105,106]. 当过度血管过度调节或替代性血管生成途径被激活时，血管正常化的窗口可能会关闭[107]. 在一项肝细胞癌模型的研究中，用大剂量索拉非尼阻断VEGF信号可加重TME缺氧，并促进免疫抑制性Tregs和M2样巨噬细胞的募集[7]. 此外，过度的抗血管生成治疗会产生有利于肿瘤干细胞存活的缺氧环境[108]. 相反，低剂量的抗血管生成药物可能维持长期血管正常化[2]. TIIC的抗肿瘤活性可以通过血管正常化、减少肿瘤缺氧和恢复生理pH值来提高[109]. 因此，为了充分发挥抗血管生成治疗的潜力，需要根据微血管密度（MVD）的基线水平和循环血管内皮生长因子（VEGF）的预处理水平调整抗血管生成方案和剂量[110,111].

单块还是双块？

抗血管生成疗法可以创造一个血管正常化窗口，并改善治疗药物和效应免疫细胞的递送[112]. 血管正常化过程短暂且可逆，正常化窗口通常较短（从几周到几个月），这取决于抗血管生成剂的类型和剂量[7,113]. 肿瘤可以通过上调替代血管生成途径（例如，ANG2/TIE2信号）来逃避抗血管生成治疗[42,43]. 在黑色素瘤中，外周血ANG2水平是ICB免疫治疗反应的有效预测因子，ANG2升高表明对ICB免疫疗法无反应[114]. 与抗VEGF或抗ANG2单药相比，双重阻断VEGF和ANG2可减轻TME免疫抑制[43]延长血管正常化窗口[115]和临床前研究中的总生存率[9,116,117]. 此外，VEGF和ANG2的双重阻断促进CD4的积累⁺和CD8⁺T细胞和增加TME中IFN-γ水平[9,117]. 然而，选择合适的剂量进行双重抗血管生成治疗是至关重要的，以避免过度修剪血管并增加化疗药物的输送[118]. 因此，靶向VEGF和ANG2同时提高抗血管生成治疗的疗效，并促进TME中抗肿瘤免疫的恢复。

免疫治疗促进血管正常化

免疫治疗使各种肿瘤模型中的血管正常化，血管正常化归因于乳腺癌中Th1细胞的积聚和抗肿瘤活性的增加[7,100]. 在CD4+T细胞缺乏的小鼠乳腺肿瘤模型中，血管的周细胞覆盖率降低，肿瘤组织缺氧增加，表明CD4+T细胞缺乏导致血管异常[57]. ICB激活TME中的CD4+和CD8+T细胞，重塑肿瘤血管系统，并间接增强其抗肿瘤活性[30]. TME中效应T细胞的积累和重新激活随后间接帮助长期肿瘤控制[119]. 此外，肿瘤组织缺氧导致Tregs增加[66,120,121]. Tregs促进肿瘤血管生成，Tregs的缺失激活CD8+T细胞并促进血管正常化[66,122]. 了解ICB免疫治疗的血管正常化功能，有助于优化ICB和抗血管生成药物的给药顺序，扩大正常化窗口，延长乳腺癌患者的生存时间[123].

干扰素基因刺激物（STING）作为一种新的免疫治疗靶点，与肿瘤血管系统调节有关，并与抗VEGF2抗体和ICB表现出协同作用[52]. 激活的STING信号通过激活I型IFN信号抑制肿瘤血管生成并诱导血管正常化[14]. 有趣的是，CD8⁺CTL与STING信号触发的血管重塑有关。STING激动剂和抗VEGF2抗体协同促进血管正常化并延长抗肿瘤免疫[14]. 值得注意的是，基于STING的免疫治疗在克服抗血管生成治疗或ICB单药耐药性方面是有效的[52]. 因此，免疫治疗的肿瘤血管正常化效应为肿瘤血管重塑和免疫重编程提供了新的认识。然而，免疫治疗诱导血管正常化所需的条件、反应的持续时间以及与抗血管生成治疗介导的血管正常化的区别仍不清楚[30,119].

抗血管生成联合免疫治疗的探讨

研究旨在研究抗血管生成联合免疫治疗（A+I）在TME正常化中的可行性和功能（图2). 在不能切除的肝癌中，与索拉非尼相比，阿替佐单抗联合贝伐单抗降低了死亡率（HR 0.58；95%可信区间0.42-0.79；P（P） < 0.001），总生存率提高（67.2%vs 54.6%）[155]. 在转移性非鳞状非小细胞肺癌中，在贝伐单抗联合化疗的基础上加用阿替唑单抗显著提高了总生存期（19.2个月vs.14.7个月；HR 0.78；95%置信区间0.64至0.96；P（P） = 0.02) [156]. 此外，肿瘤组织中PD-L1的表达不能作为预测a+I联合治疗反应的生物标志物[156]. 与舒尼替尼相比，阿西替尼联合pembrolizumab治疗晚期肾细胞癌[157]或与alvumab一起[158]增加无进展生存率。在晚期子宫内膜癌中，lenvatinib联合pembrolizumab表现出良好的抗肿瘤活性[159]. 在乳腺癌中，对接受一线贝伐单抗的患者进行免疫治疗，以确定ICB是否可以恢复对抗血管生成药物的敏感性。最近发表的一项Ib期研究招募了转移性HER2阴性乳腺癌患者，这些患者在贝伐单抗一线治疗至少6周后取得进展，这些患者接受了杜伐单抗加贝伐单抗治疗[160,161]. 有趣的是，在第一次评估（2个月）时病情保持稳定的患者CD8增加了1.2到3.5倍⁺外周血中的效应记忆T细胞水平，但在疾病进展患者中未观察到此类变化[160,161]. 抗血管生成药物的益处具有时间和剂量依赖性，确定肿瘤正常化的时间窗具有挑战性[119]. 临床试验表明，在晚期胃癌或结直肠癌中，低剂量雷戈拉非尼联合尼沃单抗治疗优于高剂量治疗[162]表明免疫治疗和抗血管生成治疗可以防止过度修剪血管[163]. 需要进一步研究A+I联合治疗对乳腺癌的临床益处，尤其是对TNBC的临床益处[164].

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图2

抗血管生成治疗结合免疫治疗改善肿瘤免疫微环境（由BioRender.com网站). 在乳腺癌中，抗血管生成治疗（贝伐单抗或VEGFR-TKI）可诱导肿瘤血管正常化，改善血液灌注，促进免疫细胞募集和树突状细胞（DC）成熟。使用免疫检查点抑制剂（抗PD-1/PD-L1单克隆抗体，单克隆抗体）可进一步缓解免疫抑制状态。A+I联合治疗后，免疫抑制微环境转变为免疫支持微环境，M1样巨噬细胞、成熟DC、CD8+CTL、Th1 CD4+T细胞数量增加，NK细胞活化，Tregs数量减少，有效发挥抗肿瘤作用。CTL，细胞毒性T细胞；血管生成素2；树突状细胞；Fas-L、Fas抗原配体；成纤维细胞生长因子；基质金属蛋白酶；NK，自然杀手；PD-1，程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1，程序性细胞死亡1配体1；肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤微环境；Tregs，调节性T细胞；VEGF，血管内皮生长因子

抗血管生成治疗减少ICB免疫治疗的不良事件

大多数与免疫治疗相关的不良事件都与过度活跃的免疫反应有关，例如T细胞介导的自身免疫炎症和免疫稳态障碍，这可能导致免疫相关的正常组织损伤，包括胃肠道、皮肤和肝脏。这些不良事件可以通过中断或减少ICB免疫治疗的剂量来缓解[165]. 考虑到血管正常化可以改善治疗药物的输送，拟议的联合策略可能需要较低剂量的ICB来增强免疫反应，同时降低不良反应的风险[7]. 值得注意的是，ICB免疫治疗增加了脑水肿的风险，偶尔会导致死亡[166]. 相反，抗血管生成药物可以减轻脑水肿，为低剂量抗血管生成治疗和免疫治疗联合治疗脑转移瘤提供了理论支持[167]. 根据目前的临床数据，一些ICB制剂（例如SHR-1210）可能会导致反应性毛细血管瘤[168]而抗血管生成治疗可以抑制血管瘤并减少抗PD-1相关的不良反应[169]. 对于抗血管生成治疗，常见的不良反应包括高血压、出血、血栓形成和蛋白尿。乳腺癌是一种结缔组织增生的肿瘤，细胞外基质分子（包括I型胶原和透明质酸）水平升高会压迫血管，导致缺氧状况。血管紧张素受体阻滞剂（ARB）使基质正常化并减压血管，减少抗血管生成治疗的不良反应[170]. 此外，ARB激活先天性和适应性免疫系统[171]并可能提高A+I联合治疗的效果[172,173].

基于血清的生物标记物

A+I联合治疗改善肿瘤组织灌注状态，激活局部免疫反应；因此，识别反映TME血管免疫状态的相关生物标志物具有重要的临床意义。血清生物标志物，以前曾用于监测抗血管生成疗法的反应[174,175]，可用于预测抗血管生成联合免疫治疗的反应。血清ANG2是血管成熟的关键因素[176]与黑色素瘤抗CTLA4免疫治疗的临床反应率和总生存率呈负相关[114]. 在肿瘤疫苗治疗的非小细胞肺癌患者中，ANG2和VEGF-A血清水平可能是长期缓解和生存的预测因素[30]. 总之，这些发现支持肿瘤血管重塑和抗肿瘤免疫反应生成之间的相关性，表明血管相关生物标记物在预测抗血管联合免疫治疗的临床反应方面具有潜在作用。然而，基于血清的生物标志物会受到宿主身体状况的干扰，它们是否真的反映了TME的状况还需要进一步研究。此外，新的血清生物标志物，如外泌体、循环肿瘤DNA（ctDNA）、血清RNA、免疫细胞亚群计数和乳酸脱氢酶（LDH）水平，是否具有临床预测意义值得进一步探讨。

组织生物标记物

基于组织的生物标记物的主要局限性是需要重复活检。在转移性乳腺癌中，肿瘤组织PD-L1的表达和肿瘤突变负荷（TMB）可以预测免疫治疗的疗效[三,7]. 相反，对于乳腺癌新辅助治疗，免疫治疗效果的预测因素仍需进一步研究[153]. Mpekris等人研究了肿瘤细胞、免疫细胞（M1/M2样TAM、NK细胞、CD4+/CD8+T细胞和Tregs）和内皮细胞之间的复杂相互作用，并开发了肿瘤组织灌注评估和免疫治疗疗效预测的数学模型[119]. 该模型的设计考虑了TME中促血管生成分子（如ANG1、ANG2、PDGF-b、VEGF和CXCL12）的水平以及CD4+和CD8+T细胞的血管正常化作用[119]. 模型预测与临床前结果显示出良好的相关性，这需要在前瞻性临床研究中进一步验证。

免疫治疗的疗效取决于肿瘤灌注，任何改善灌注的方法都可以同时增强免疫治疗。肿瘤中HEV的发病率也可能预测A+I联合治疗的效果[146]. HEV的形成已被证明可以提高ICB免疫治疗的效果[177]. 在乳腺癌模型中，HEV的形成是由淋巴毒素-β受体（LT-βR）信号转导介导的。用激动性LT-βR抗体治疗可诱导HEV发展并增加CTL活化，进一步增强抗血管生成治疗的疗效[101].

此外，通过非侵入性测量，如动态对比增强（DCE）MRI，对血管变化进行功能测量[178]、动态光学乳腺成像（DOBI）[179]和剪切波弹性成像（SWE）[180]，可能有助于A+I联合治疗。这些功能测量可以提供TME状态的重要信息，并允许在治疗期间进行动态监测。表中总结了上述乳腺癌TME中的生物标记物和细胞1。

作者感谢王克博士、李超、孙珊珊、张志刚以及邱福明教授和黄健教授为他们的研究工作提供的有益建议和合作。