急性白血病单细胞分析在治疗策略中的作用

抑制IDH1/IDH2

酶IDH1和IDH2的复发突变在15%至25%的AML病例中存在。正常的酶允许异柠檬酸转化为α-酮戊二酸（KG），后者在氧化应激的调节中起着重要作用。另一方面，突变的IDH1/IDH2酶将KG转化为R-2-羟基戊二酸（2HG），后者通过抑制Jumonji C结构域去甲基酶（JMJD2A）和十烯转位2（TET2）分子来修饰组蛋白去甲基化（参与白血病发生的机制之一）。这些突变通常与核磷蛋白（NPM1）和DNA-甲基转移酶3（DNMT3）突变有关。当与NPM1突变相关时，预后显著改善。突变联合的概念是需要考虑的一个重要因素，这可能已经开始在靶向治疗的概念中造成问题；当存在关联时，应该针对哪些分子异常？当然，有可能认为解决方案来自临床试验。但在这种情况下，考虑到多种可能的关联，很难在临床试验中纳入足够多的患者，以得出每个可能关联的统计有效结果。在IDH1抑制剂ivosidenib的I期试验中，完全缓解率（CR）达到了近22%，但中位缓解期仅为6.5个月，中位总生存期（OS）低于9个月，因此证明了快速肿瘤逃逸机制[10,11]. 使用IDH2抑制剂埃纳西替尼，CR率几乎达到20%，但中位反应持续时间仍低于6个月，中位OS低于9个月。我们如何解释这些结果？这些结果肯定很有趣，但考虑到反应的简短性和缺乏显著的治愈率，这些结果是不够的？这是因为该药物在消除IDH突变细胞方面缺乏效力吗？ivosidenid使21%的病例中IDH1突变消失，在这种情况下，中位应答率增加到15个月以上，但由于突变克隆最终重新出现，因此无法实现AML治愈。然而，在分子生物学中检测到的可测量残留病（MRD）的阴性概念必须谨慎评估，因为许多MRD阴性患者似乎只表现出一组由特定抗体检测到的突变IDH1细胞[12]. 最简单的假设是，考虑到一部分IDH1突变细胞对药物不敏感，通过可能在总人口中确定的各种机制，或通过更复杂的“单细胞”分析技术。可以假设某些机制导致IDH2抑制剂依那替尼诱导其自身失活。临床有效剂量的依那昔尼可诱导细胞色素CYP3A增加三倍[13]. CYP3A参与N-脱烷基[14]，这种机制在人类中参与了依那西尼布的降解[15]. Quek等人的文章[16]分析依那西尼治疗患者的克隆进化。首先，作者没有保留在慢性粒细胞白血病（CML）中用酪氨酸激酶抑制剂观察到的对恩那西替尼不敏感的新突变的假设，因为没有发现新的IDH2突变。然而，这种机制已经被描述为解释依那西尼的复发/耐药性，无论是通过反式还是顺式二聚体界面突变[17]. 依那西尼的作用机制不是消灭突变的IDH2克隆，而是部分突变克隆的终末分化，从而恢复正常造血。此外，其他具有IDH2以外突变的克隆可能会导致复发，要么是因为它们在诊断时以无法检测的水平存在，要么是因为它们的新出现[16]. 确实，IDH突变被认为是基础性的，但通常与其他突变相关，例如DNMT3、丝氨酸/精氨酸富集剪接因子2（SRSF2）、NPM1、额外的SeX梳样1（ASXL1）和Runt-related转录因子1（RUNX1），这可能通过克隆或亚克隆进化机制导致复发。然而，DiNardo的开创性论文[10]未发现先前存在的单基因突变（包括神经母细胞瘤大鼠肉瘤（NRAS））与缓解率之间的相关性。然而，在难治性患者中观察到酪氨酸激酶受体代谢途径的突变增多。此外，应答组的平均突变数为1.8个/患者，而非应答组为2.6个/患者。因此，支持与对IDH1抑制不敏感的突变相关的逃逸机制。这些结果能否通过综合方法得到改善？DiNardo等人（摘要560，ASH 2018年年会）采用经典的3+7方案（柔红霉素或依达比星）联合依维沙丁尼或依那西尼治疗154名IDH1或IDH2突变患者，同时巩固并继续使用IDH抑制剂。总有效率（CR+CR伴不完全计数恢复[CRi]）为80%，原发性AML患者的CR率为91%，继发性AMLs患者的CR比率为53%。其他几项研究正在进行中，以测试化疗/去甲基化药物与抗IDH药物组合的治疗效果，其结果尚待确定。(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT03173248”，“term_id”：“ncT0317328”}}NCT03173248号, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT02677922”，“term_id”：“NST0267722”}}NCT02677922号).

刺猬抑制：glasdegib

这种口服Hh途径抑制剂以平滑化合物（SMO）为靶点，SMO在AML中异常存在，并通过胶质瘤相关癌基因同源物（GLI1）诱导信号传导。许多体外研究强调了抑制AML中这种信号通路的潜在价值，特别是通过对LSCs的化学增敏作用[18]已知对传统药物有耐药性[19]. 在一项I期试验中，28名AML患者接受了glasdegib治疗[20]. 结果虽然有趣，但并不引人注目：在28名患者中有16名患者观察到了疗效，其中1名患者出现了CR，4名患者出现CRi，4名症状轻微，7名患者病情稳定。许多其他研究已经调查了glasdegib/化疗的联合应用。Cortes等人对AML或高危骨髓增生异常综合征（MDS）患者的低剂量阿糖胞苷与阿糖胞嘧啶/glasdegib进行了比较[21]. 阿糖胞苷/格拉斯代基组的CR率为17%，单用阿糖胞嘧啶组为2.3%，OS分别为8.8个月和4.9个月。然而，在缺乏随机试验的情况下，通过分析文献数据和模拟治疗比较，似乎格拉司代布/阿糖胞苷联合治疗优于氮胞苷或地西他滨治疗[22]. 在另一项单臂试验中，glasdegib联合常规的“7+3”阿糖胞苷+柔红霉素化疗，55岁以上患者的CR率为46.4%[23]. 这一治愈率并不特别有利，作者设定了一个目标，即超过54%的治愈率，但观察到约40%的患者在24个月内无复发生存率（RFS）达到一个平台，表明对LSC有根除作用。然而，值得注意的是，在本研究中，所分析的12个基因（CCAAT/增强子结合蛋白α[CEBPA]、DNMT3A、FLT3、FLT_3-内部串联重复[ITD]、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、NPM1、NRAS、RUNX1、TET2、Wilm’s tumor 1[WT1]）的突变与临床反应之间没有相关性。在对低甲基化药物无效的MDS中，glasdegib单药治疗仅对6%的患者有效（35例中有2例），然而56%的患者在20.6个月的OS期内表现出稳定的疾病[24].

FLT3的抑制（中柱糖苷，吉曲替尼）

FLT3是一种III类受体酪氨酸激酶，是AML中发现的最常见的突变，证明了靶向治疗的兴趣，该治疗适用于大约30%的患者[25]. Stone等人的开创性文章[26]在FLT3突变患者中，比较了标准柔红霉素加阿糖胞苷诱导和巩固治疗与大剂量阿糖胞嘧啶加或不加中奥斯他林的疗效。CR结果不显著，中奥斯塔林组为59%，安慰剂组为54%，但OS和无事件生存率（EFS）显著改善在中柱龙的手臂上。值得注意的是，中蛇藤素在FLT3外有几个靶点：c-kit、血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体，这些靶点在一些AML中突变。这表明，在某些情况下，疗效的提高可能是由于存在多个靶点。相反，Hh途径似乎更经常参与FLT3突变AML的增殖[27]FLT3/Hh的双重抑制可以改善使用中蛇藤素获得的结果。已经开发了其他几种FLT3抑制剂，其中最有希望的是吉菌替尼，它是一种主要针对FLT3的抑制剂，更偶然的是针对c-Kit，但也针对AXL酪氨酸激酶，后者的阻断加强了对FLT3-ITD的抑制。在Perl等人的研究中，Gilteritinib对复发/难治性AML显示出疗效[28]. 吉替替尼组的CR/CRi患者百分比为34%，化疗组为15.3%，分别为21.1%和10.5%。虽然吉地替尼组的EFS为2.8个月，而化疗组为0.7个月，但生存曲线在24个月时收敛，没有生存平台，这清楚地表明吉地替尼单药治疗是一种有趣的分子，但效果有限。已经进行了一些抗FLT3抗体与氮杂胞苷的联合试验[29]没有任何实际好处。对FLT3抑制剂的耐药机制可能从白血病人群一开始就存在或通过选择现象获得。最常见的机制包括抑制剂结合位点的突变（尤其是残基D835）、FLT3的过度表达或替代信号通路的使用（例如NRAS突变）。

白血病细胞群和白血病干细胞的深度分型

LSC的概念有时也会被讨论，然而这个群体被认为至少部分包含CD34+CD38-群体。Won等人的研究正是基于这种表型[44]它不使用单细胞分子分析，而是使用经典的单细胞培养技术。通过比较LSC和CD34+CD38+对应物，显示（在84个基因的减少组中）参与细胞激活途径的27个基因的表达减少，特别是与肿瘤生长因子（TGF）、Wbt、FGF、Hh、Notch、IL6ST（白介素6信号转导子）和白血病抑制因子受体（LIFR）超家族有关的基因。对这些LSC静止的另一种解释是线粒体DNA拷贝数的减少，线粒体DNA拷贝数量不受组蛋白保护，且靠近活性氧（ROS）生成位点，可能更容易发生突变。Sachs等人[45]在单细胞技术中鉴定了白血病小鼠模型中的LSCs特征，该特征与来自健康供体的CD34+CD38-干细胞的转录组学特征进行了比较。小鼠LSC和正常干细胞表达的相似性导致了这样一种假设，即正常转录程序也用于人类LSC的发育。此外，通过比较在正常干细胞和LSC上表达最多的10%细胞中的一组基因的表达，证明了9个LSC特异基因的特征。这项单细胞研究表明，在LSC和HSC中，增殖和自我更新功能是分开的，这可能解释了抗增殖治疗的失败[45]. 有趣的是，朱等人通过单细胞分析确定了LSC干细胞的主要调节因子（在T-ALL模型中），这可能成为旨在根除LSC的药物靶点[46].

最终，经典的单细胞培养和转录组学方法为我们提供了关于LSC生物学的额外数据，激活途径表达减少，参与自我更新的基因表达增加，增殖和自我更新功能分离，以及对化疗的耐药性，同时提供旨在根除LSC的可能治疗靶点（例如CD36、MYB或SPI1）。

预测、风险分层和进化价值

一定数量的AML发生在MDS的进化过程中，进化风险由修订的国际预后评分系统（R-IPSS）评分进行评估，该评分基本上考虑了细胞减少、母细胞百分比和细胞遗传学异常，考虑到NGS技术有可能突出某些突变的预后作用[47]. 直观地说，根据这些模型，这些模型在得分中对确定转化为AML的几率的爆炸百分比有着重要的影响，白血病的演变将基于MDS诊断时存在的这些爆炸，其扩展将导致AML。单细胞研究通过提出非线性进展模型来挑战这一概念。事实上，对一系列MDS已发展为AML的患者的研究表明，AML阶段的主要克隆并非来自MDS阶段确定的母细胞，而是来自MDS前或MDS阶段干细胞中只能检测到的亚克隆[48]. 在靶向治疗的时候，这个概念很有意思，也解释了某些幻灭。事实上，对总人口的分子生物学分析，即使有很深的阅读，也无法确定真正负责白血病转化的人口，注定要以这些全球数据为基础，通过靶向治疗阻止白血病演变的尝试失败。只有及早鉴定出特别容易发生的干细胞亚克隆（已知预后不良的突变、化疗耐药基因的表达等）才能有效地指导治疗策略。Levine等人的单细胞质谱研究[49]包括在18种细胞刺激条件下对31名AML患者1500万个细胞的31种蛋白质进行分析。虽然在来自健康供体的造血细胞中，干细胞的经典表面标记物与活化谱相关，但AML样本中的情况并非如此。事实上，当表面表型与AML中功能和临床相关通路的表达和激活特征相匹配时，这些特征往往不一致，从而导致了表面定义原始细胞（SDPC）与推断功能原始细胞（IFPC）的定义。有趣的是，IFPCs资料已被证明比SDPCs资料对患者生存率具有更好的预测价值。

对药物的治疗反应和靶向

吉替替尼是FLT3抑制剂，对AML有效但无疗效。复发患者中可能出现的新突变已在总人群中显示出来。McMahon等人[50]采用单细胞DNA测序技术对4例复发性AML伴RAS突变患者的样本进行分析。该分析表明，在所有4例病例中，RAS突变发生在具有FLT3突变的同一克隆群体中，这表明是RAS突变导致了对吉曲替尼的耐药性。此外，单细胞分析显示，在诊断和复发时分析的三个AML中，有两名患者的NRAS克隆之前存在突变，但仅在第三名患者的治疗期间出现。除了这些双突变FLT3/NRAS克隆外，另一名患者还具有一个预先存在的FLT3-WT/NRAS-WT亚克隆，其中包含IDH1和SF3B1突变，该突变在吉菌替尼下扩展[50]. 这个小系列已经显示了单细胞方法的兴趣，它可以突出不同患者的复发/耐药性进化模式，并显示出在吉替替尼或之前存在的亚克隆的存在，并且需要除抑制FLT3外的另一种方法才能将其根除。对于另一种FLT3抑制剂，单细胞分析显示，在奎沙替尼治疗后复发的患者中，存在对该药物耐药的多克隆人群，这些患者的靶基因突变和靶基因突变都存在[51].

单细胞方法还可以更好地了解异基因移植后复发的动力学和病理生理学。事实上，单细胞研究通过精确评估移植后嵌合体，以及根据表型/突变检测和量化不同白血病克隆，特别是定义这些突变的共现性，带来了无与伦比的分析，这只能通过批量分析间接实现，而不是非常精确[52]. 通过这项技术，可以确定两种类型的复发，一种基于具有预先存在突变的克隆的发展，另一种基于新出现的克隆突变的出现。尽管如此，单细胞分析也表明，化疗耐药可能是通过动态转录适应的非遗传机制引起的[53]支持使用表观遗传疗法[54].

疾病监测和可测量的残留疾病

单细胞方法对监测MRD很感兴趣。Pellegrino等人[55]分析了在诊断、CR和每个阶段复发期间检测到的突变的演变。在CR阶段，患者在4384个基因型细胞中只有10个突变细胞（7个DNMT3A和3个TP53），复发期间这些细胞群再次出现[55]. 此外，复发分析显示，三突变群体H2DI/NRAS/ASXL1显著增加，表明任何仅针对其中一个突变的方法都注定会失败。Ediriwickrema等人[56]分析14例患者，10例无复发，4例复发，平均每点分析8177个细胞。对CR患者的分析显示，10名复发患者中有8名患者存在突变细胞，4名患者中有3名患者没有复发，在这个小样本量中差异不显著。另一方面，诊断时同时发生的突变数量，即出现在同一细胞中，复发患者为2个，而保留CR的患者为1个。接受测试的患者人数很少，这使得任何假设都有风险，但尽管如此，这类数据增强了单细胞方法的兴趣，因为似乎重要的不是突变数量，而是细胞分布的类型，同一细胞中的几个突变比同一突变在不同克隆上传播的更有害。

Céline Baier博士和Yasmine Labiad博士在细胞实验和数据讨论方面给予了他们的亲切帮助，并向Pr Pascal Rihet博士提供了持续支持、实验和数据探讨、手稿修订。