介绍性评论：
在美国内战期间，人们普遍认为美国军队（或“联邦”）穿着深蓝色制服，而分离主义的南部邦联军队则穿着灰色制服。通常情况就是这样。然而，由于两军都包括来自成员国的各类民兵，因此存在许多例外情况，南方部队穿蓝色，北方部队穿灰色。再加上战场上的烟雾、噪音和混乱，各个指挥官无法明确确定接近的部队的隶属关系和忠诚度，可能会导致灾难性的后果。密苏里州威尔逊溪战役（Battle of Wilson’s Creek）就是军警参与者意图缺乏确定性导致混乱的一个例子。联邦军队占领了一块很快命名为血腥山（Bloody Hill）的领土，错误地将接近的穿蓝制服的南部邦联军队认定为友好的联邦增援部队，允许他们在南部邦联开火和联军被击溃前几码内行进。
在新生血管年龄相关性黄斑变性（AMD）的病例中，巨噬细胞在疾病过程中的作用尚不明确，关于其是否有益或有害的证据相互矛盾。对于有兴趣了解和治疗AMD的科学家和临床医生来说，更好地了解这些细胞是促进黄斑病变还是有益。在这篇综述中，我们将讨论巨噬细胞参与渗出性和非渗出性AMD的证据、一些相关的临床研究、死后人体组织的数据以及使用动物模型的干预实验。我们还将建议进一步阐明巨噬细胞在AMD中的作用的方法。
年龄相关性黄斑变性（AMD）：
在西方世界，老年性黄斑变性（AMD）是导致不可逆转失明的主要原因(1–三). 仅在美国，就有近200万人患有严重的终末期AMD，并且在法律上失明。另有700万人患有早期AMD或年龄相关性黄斑病变（ARM），并有发展为晚期AMD的高风险(4). 随着人口老龄化，AMD对社会的负面影响将增加(4,5).
定义“巨噬细胞”：
在本综述中，“巨噬细胞”将被定义为来源于骨髓中的成血细胞的造血细胞，并以单核细胞的形式通过全身循环(). 这些细胞特征性地表达包括CD14、CD11b、CD18和CD68的簇分化（CD）抗原，并在吞噬、清除碎片、抗原提呈和细胞因子分泌中发挥作用。巨噬细胞种类繁多，多样性包括骨中的多核破骨细胞和位于肺-气界面的肺泡巨噬细胞。在眼睛中，在正常发育、衰老和疾病期间，循环单核细胞通过脉络膜或视网膜中的内皮细胞离开血管系统。在脉络膜中，常驻细胞的分布最好通过脉络膜整体支架来观察，这表明这些细胞在密集的网络中分布相当均匀(6). 单核起源的脉络膜细胞包括循环单核细胞、常驻巨噬细胞和树突状细胞。单核细胞离开血管系统后，可以根据微环境线索分化为巨噬细胞或树突状细胞().
白细胞分化的简化模型。骨髓成血细胞（HB）在某些情况下可能已经专门化，产生祖细胞，包括淋巴母细胞（LB）、粒前细胞（PG）和单核细胞（MB）。然后这些细胞分别分化为淋巴细胞（LC）或淋巴树突状细胞（LDC）、不同类别的粒细胞（GC）和单核细胞（MC）。循环单核细胞离开血管系统，根据微环境线索分化为髓样树突状细胞（MDC）和巨噬细胞（MΦ）。
炎症和巨噬细胞与脉络膜新生血管的关系——临床和遗传学研究：
一些临床研究已经发表，提供了炎症细胞在脉络膜新生血管（CNV）中可能作用的信息。在一项早期表型关联研究中，Blumenkranz及其同事将白细胞计数升高确定为与新生血管性AMD相关的少数系统性指标之一(7). 同样，澳大利亚蓝山队列最近的一份报告也发现，白细胞计数增加与早期AMD、血肿和可能的地理萎缩有关，尽管脉络膜新生血管患者没有显著增加(8). 此外，有证据表明CNV患者循环单核细胞激活增加(9). 除了对循环细胞的研究外，CNV患者的生化研究也表明，血清中C反应蛋白和细胞因子白介素-6水平升高与CNV进展相关(10,11). 这些实验非常有趣，因为它们指出了AMD发病机制中除局部眼部事件外的全身炎症因素。
影响巨噬细胞的抗炎治疗也可能对AMD患者有益。在几项对CNV患者的研究中，玻璃体内注射抗炎类固醇曲安奈德被证明是有益的(12)单独或与其他治疗方式（如光动力治疗）联合使用(13). 在大鼠模型中，通过合成植入物给药曲安奈德对实验性CNV也有保护作用(14). 然而，应该注意的是，除炎症外，曲安奈德还可能影响多种细胞间途径，这些途径的调节（如细胞凋亡）可能与这种类固醇对炎症的影响一样重要或更重要。
在过去几年中，在确定AMD的遗传风险因素方面取得了巨大进展（最近综述(15–17)). 值得注意的是，一些AMD相关风险等位基因位于其产物直接参与炎症的基因中(CX3CR1系列，MHC等位基因）(18,19)或间接（补体因子H、补体因子2、补体因素B）(20–23). 尽管这些等位基因如何影响蛋白质功能的生化细节尚待确定，但这些遗传关联有助于形成炎症在AMD发病机制中起作用的概念。
CNV中炎症和巨噬细胞参与的证据-组织病理学研究：
有间接证据表明，巨噬细胞可能参与早期AMD和晚期渗出性AMD。黄斑水肿是早期AMD的重要指标，人们普遍认为黄斑水肿的数量、大小和汇合是老年黄斑萎缩和/或新生血管改变的主要危险因素（例如(24–26)). 对酒石成分的研究表明，它们主要由多种炎症介质组成(27–29).
在晚期AMD患者眼中，巨噬细胞定位于Bruch膜的降解区域(30,31)并且在AMD患者的脉络膜内发现数量增加(32). 人类脉络膜新生血管膜已被证明含有巨噬细胞谱系的白细胞(33). 透射电镜发现，这些细胞集中在病理血管附近(34)和CD68免疫组织化学(35). 此外，CNVM内的巨噬细胞表达促血管生成细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF），表明巨噬细胞可能直接促进CNV中异常内皮细胞的生长(36).
图中显示了未受影响的眼睛（上图）和有脉络膜新生血管膜的眼睛（下图）中CD45阳性白细胞的免疫组织化学标记。
人眼白细胞定位。白细胞定位于84岁捐赠者的正常人类脉络膜（上图）和80岁脉络膜新生血管捐赠者（下图）的眼睛中。用针对白细胞共同抗原（一种在所有类别白细胞（CD45；绿色标记）中表达的蛋白）的抗体和凝集素标记切片欧洲乌莱克斯凝集素-I显示血管系统（红色标记）(85). 细胞核用DAPI复染成蓝色。黄橙色荧光是由RPE脂褐素引起的。脉络膜白细胞用箭头表示，CNVM内的白细胞由箭头表示，而CNVM由括号表示。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；CHO，脉络膜。比例尺=100μm。
巨噬细胞是如何促进黄斑变性的？
在研究酒糟成分时，一个更令人惊讶的发现是这些沉积物中存在MHC II类抗原(19,27,37). 这些跨膜蛋白（通常由抗原提呈细胞表达）位于核样结构中，通常分布在整个核糖体中(19,38). 虽然不能排除这些细胞清除血肿的可能性（见下文），但这些抗原在沉积物中的分散可能表明单核细胞起源的细胞参与了血肿形成的发病机制(37). 其次，为了发生视网膜下新生血管，内皮细胞有必要通过Bruch膜的缺陷迁移。在实验性CNV小鼠模型（下文讨论）中，这些缺陷是由激光损伤造成的；在AMD中，沉淀事件尚不清楚。布鲁赫膜主要由弹性蛋白和胶原蛋白组成，其溶解可能依赖于基质金属蛋白酶。巨噬细胞和中性粒细胞在细胞外基质周转中发挥重要作用，并表达大量基质金属蛋白酶，这些基质金属蛋白酶可能合理地导致Bruch氏膜破裂。第三，白细胞通过内皮细胞的迁移本身可以促进其他组织中内皮细胞的损伤和死亡(39). 与周边毛细血管相比，这种机制可能使黄斑处的毛细血管损伤风险更大，因为黄斑毛细血管往往表现出更高的细胞间粘附分子-1表达(40)因此可能使黄斑内皮细胞的单核细胞迁移增加。由迁移诱导的内皮损伤引起的脉络膜毛细血管低灌注是AMD渗出性转化的一种可能机制，特别是对于具有发展为CNV高风险的眼睛，其灌注已被证明降低(41). 最后，巨噬细胞可以分泌生长因子、细胞因子和活性氧(42)这可能会对脉络膜毛细血管和RPE产生负面影响。
值得进一步考虑的是，最近对AMD非常感兴趣的两个领域——补体系统和抗VEGF治疗——可能会调节AMD循环白细胞的功能。例如，补体复合物形成过程中产生的后期毒素对白细胞具有许多生物活性作用，包括增加促炎介质的迁移和合成(43). 同样有趣的是，鉴于抗血管内皮生长因子治疗在新生血管性AMD的治疗中取得的成功，除了其对血管生长的直接影响外，在某些条件下，血管内皮生长激素本身还增加了内皮细胞粘附分子的表达，并增加了巨噬细胞和中性粒细胞的募集(44,45).
巨噬细胞如何防止黄斑变性？
除了临床上明显的水肿外，布鲁赫氏膜中存在膜碎片和基底线性沉积物也是AMD的形态学征象(46–50). 有人认为，巨噬细胞在清除酒糟和其他废物方面发挥作用，也许可以预防这些沉积物堆积后可能发生的严重终末期病理学(51,52). 单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CL2）是一种趋化因子，可引导单核细胞募集到炎症组织中(53). 据报道，缺乏该蛋白的小鼠，尤其是缺乏趋化因子受体CX3CR1的小鼠，出现了类似于核糖的沉积，这表明巨噬细胞募集功能受损导致Bruch细胞膜碎片清除率降低(54)-(55). 衰老的人布鲁赫膜积累晚期糖基化终产物（AGEs）(56,57)可诱导培养的RPE细胞中VEGF分泌增加(58). 因为巨噬细胞可以内吞并清除AGEs(59,60)因此，巨噬细胞招募失败可能导致AGE暴露于RPE和脉络膜毛细血管的程度增加，并伴随损伤和/或促血管生成细胞因子水平增加。巨噬细胞清除凋亡细胞碎片也可以通过抑制炎性细胞因子的产生来限制炎症(61). 这些建议的功能描述如下.
巨噬细胞在新生血管性AMD进展中的潜在有害（左）和有益（右）作用。
CNV巨噬细胞的功能研究及其局限性：
如前几节所述，有令人信服的组织学证据表明免疫细胞（单核细胞或巨噬细胞）与人类脉络膜新生血管膜之间存在空间关联。当然，巨噬细胞和其他免疫细胞在病变部位的存在本身并不能表明这些细胞是诱导病变还是减轻病变的严重程度。依靠人体供体组织进行的研究虽然在观察实际人体病理学方面最可靠，但由于只调查了疾病过程的一个“快照”，因此受到了限制（尽管希望来自疾病不同阶段的足够数量的静态图像能够产生更动态和完整的理解）。CNV的动物模型可以改变遗传和环境参数，对基于人类组织的研究起到补充作用，并可以进一步阐明巨噬细胞在CNV中的作用。
最常用的脉络膜新生血管动物模型依赖于热激光在Bruch膜上诱导的断裂，从而允许损伤部位的视网膜下新生血管。最初在灵长类动物中描述了使用热激光诱导脉络膜新生血管(62)随后在啮齿类动物身上(63). 这种实验在小鼠身上具有特殊价值，不同干预措施和遗传背景对CNV的影响可以很容易地控制。虽然导致人类CNV的事件与激光诱导创伤中的事件明显不同，但人类CNV中随后发生的血管生成步骤可能会反映在激光损伤模型中。
使用热激光诱导CNV已用于许多优雅的研究，其中白细胞功能在小鼠中受到抑制。2003年发表的两项研究评估了单核细胞耗竭对激光诱导脉络膜新生血管形成的影响。Espinosa-Heidman等人在诱导CNV之前用氯膦酸盐脂质体预处理小鼠(64). 氯膦酸盐促进吞噬脂质体的单核细胞和巨噬细胞的凋亡，导致循环和常驻细胞群的耗竭(65). 与对照组相比，在CNV诱导后，注射氯膦酸盐脂质体的小鼠的CNV严重程度（通过病变大小评估）显著降低。在同时发表的一份报告中，樱井等人也使用了氯膦酸盐脂质体方法(66). 在这些研究中，使用氯膦酸钠治疗的动物的CNVM体积显著减少。此外，形态学研究被解释为显示巨噬细胞（CD45+、F4/80+细胞）先于内皮细胞进入发展中的CNV区域。值得注意的是，在氯膦酸钠治疗的动物中，血管内皮生长因子的水平降低，这表明巨噬细胞有助于VEGF的合成，正如之前在人类CNVM中所表明的那样(36).
巨噬细胞募集或信号转导基因缺陷的小鼠表现出与巨噬细胞药物耗尽的小鼠相似的CNV严重性降低。敲除小鼠缺乏抄送2，编码单核细胞趋化蛋白-1受体的基因，严重损害了单核细胞募集到炎症区域的能力。当这些动物的布鲁赫膜被热激光破坏时，发现它们产生的新生血管膜比野生型小鼠小得多(67). 缺乏内皮表面分子细胞间粘附分子-1或其结合伴侣之一CD18的小鼠在激光治疗后也表现出新生血管受损(68). 因此，在几项研究中，单核细胞的药理学和遗传损伤对CNV都有保护作用。
除了单核细胞/巨噬细胞外，还探讨了多形核白细胞的潜在作用，有证据表明这些细胞对实验性CNV的贡献不大(69,70)尽管在不同的研究中观察到的对CNV大小影响的重要性有所不同。
综上所述，有相当多的证据表明巨噬细胞参与了小鼠模型中CNV的发病机制，可能还有AMD患者的人眼。
然而，这些细胞加剧CNV的说法最近受到了一项多方面研究的挑战，Apte等人在该研究中提供了巨噬细胞抑制实验性CNV发展的证据(71). 这些研究人员还使用了激光诱导的CNV模型，在本例中，使用了白细胞介素-10（IL-10）缺乏的小鼠，以确定巨噬细胞抑制对随后CNVM形成的影响。IL-10是一种细胞因子，通常被认为具有抗炎作用，可抑制巨噬细胞的功能。有人会假设，根据巨噬细胞促进CNV的拟议作用，在缺乏IL-10的情况下，CNV的严重程度会增加。实际上观察到了相反的结果，当IL-10被敲除，或其有效浓度因添加外源性抗IL-10抗体而降低时，小鼠出现了较轻的CNV。这种效应与巨噬细胞（或CD11b和F4/80阳性细胞）迁移到损伤部位的程度相关。为了确定反过来是否正确，产生了过度表达IL-10的转基因小鼠，与野生型同窝动物相比，这些动物对CNV的敏感性增加。此外，Apte及其同事发现，注入玻璃体的单核细胞虽然不能反映AMD的病理生理学，但也通过一种可能涉及CD95信号的机制，阻止CNVMs像注入其他细胞类型的眼睛一样显著发展。总的来说，本研究从正反两方面提供了重要证据，证明巨噬细胞可以减轻实验性损伤模型中脉络膜新生血管的严重程度，这对之前的几项研究提出了挑战。
为了调和这些不同的发现，并更好地定义巨噬细胞在CNV中的作用，以下概述了一些注意事项：
在没有激光的情况下巨噬细胞耗竭的影响是什么？
这些研究中的每一项都使用具有遗传或药理学干预的小鼠来影响巨噬细胞数量或功能，然后使用热激光治疗并评估CNV的严重程度。令人惊讶的是，这些治疗对非激光眼的可能影响尚未得到很好的证实。如前所述，除循环单核细胞耗竭外，氯膦酸盐脂质体治疗或其他方式可能导致内皮细胞死亡或损伤(71). 这是一个重要的考虑因素；显然，一种杀死或抑制脉络膜内皮细胞增殖的方式有望降低CNVM的严重程度，其对巨噬细胞的同时作用将是有趣的，但无关。而其他研究中暴露于氯膦酸盐脂质体的动物是可行的(65)，并且这种递送似乎不会引起广泛的血管脱落和组织坏死，因此RPE和绒毛膜毛细血管对这种药物特别敏感是可行的。这个问题可以通过氯膦酸盐治疗来解决，然后将单核细胞重建到循环中；如果未经处理的单核细胞无法恢复严重的CNV表型，这一结果将引发人们对氯膦酸盐在本实验中最重要的生物效应是否是通过单核细胞耗竭产生的质疑。
同样，关于IL-10，重要的是要确定这种细胞因子是否影响体内RPE-Bruch的膜毛细血管复合物。尽管Apte及其同事表明IL-10的过度表达对视网膜的整体结构没有严重影响，但有必要进行详细的高分辨率定量研究，以探讨IL-10缺乏小鼠的脉络膜毛细血管和/或布鲁赫膜水平是否存在细微变化，IL-10转基因小鼠和氯膦酸-脂质体治疗小鼠。对每种治疗方案和基因型的动物的脉络膜血管系统、Bruch膜和RPE进行仔细的免疫组织化学和超微结构研究，例如以前用于评估香烟烟雾对RPE脉络膜复合体的影响(72)，尤其有保证。
虽然IL-10通常被认为是一种抗炎细胞因子，但它似乎具有多效性作用，具有免疫抑制或免疫刺激功能，这取决于其微环境、刺激类型和所使用的模型系统(73). 观察到一种效果在体外内皮细胞激活和内皮细胞粘附分子E-选择素上调(74)一些接受IL-10治疗的人类患者的血浆中某些促炎细胞因子水平升高(75). 也可能存在与IL-10丢失相关的细胞外基质变化；这种细胞因子下调I型胶原的合成在体外(76)因此可能会影响疤痕形成的动力学，正如最近的一篇社论所指出的那样(77). 此外，I型胶原蛋白是布鲁赫膜的组成部分(78)并且布鲁赫膜的ECM组成的变化可能导致形成新生血管膜的倾向改变。因此，虽然从表面上看，这些研究中的每一项都在巨噬细胞耗竭方面提出了相同的问题，但IL-10给药、IL-10缺乏和氯膦酸盐治疗的生物影响可能是复杂的。
在非激光CNV模型中巨噬细胞耗竭的影响是什么？
激光诱导CNV模型非常容易控制，具有可预测的时间进程和研究人员的高度控制；然而，该模型中产生的损伤（正常、健康的Bruch细胞膜突然被破坏）与人类CNV的病理学有很大不同，人类CNV需要多年才能形成。过表达VEGF的转基因小鼠表现出脉络膜内新生血管形成，其模式与人类糖尿病脉络膜中所描述的相似(79)但一直没有发现视网膜下新生血管(80). 最近，人们描述了RPE亚型沉积物和自发CNV的替代小鼠模型。转基因人载脂蛋白Eε4等位基因的小鼠，在高脂肪饮食中，出现RPE下病变以及脉络膜（和视网膜）新生血管。此外，超氧化物歧化酶-1缺乏的小鼠(81)也发现有局灶性核果状沉积物，尽管这些沉积物小于RPE细胞的高度，并且基底沉积物弥散。在这些动物中也观察到自发性CNV。如上所述，MCP-1和CX3CR1编码基因缺陷的小鼠也会形成RPE亚型沉积，并形成自发的CNV(55). 这些模型，以及将根据了解AMD的遗传进展开发的模型，可能为评估巨噬细胞在CNV中的作用提供新的可能性。具体而言，可以在更具医学相关性的新生血管模型中探索改变不同类别巨噬细胞的数量和功能的作用。
不同的巨噬细胞种类对CNV有不同的影响吗？
在鉴定和表征人类不同类型的单核细胞和巨噬细胞方面已经取得了相当大的进展(82)和鼠标(83)，（最近审阅(84)). 这些不同类别的单核细胞似乎具有不同的功能特性和不同的分化为巨噬细胞和树突状细胞的倾向，以应对不同的微环境条件。迄今为止，小鼠研究已将实验CNVM中的巨噬细胞群描述为F4/80+、CD11b+和/或CD45+细胞。这些标记物似乎标记了所有类别的小鼠单核细胞和巨噬细胞，并且不区分不同的亚群。因此，与其他基因型相比，IL-10缺陷小鼠中巨噬细胞的迁移增加可能代表一个不同且更良性的细胞群体，并与更严重的CNV相关。使用其他标记物（如CD11c和CD62L）的进一步研究(84)可能会进一步细化这些研究中的“巨噬细胞”是否真的是相同的细胞。
结论：
总之，尽管迄今为止进行了几项出色的研究，但对于巨噬细胞是否会降低CNV、加重CNV、是否会根据基因型和环境环境产生混合效应，或是该过程中的偶然旁观者，仍缺乏共识。不同群体所采用的实验方法之间细微但重要的差异使得比较这些实验变得困难。了解循环炎性细胞在AMD发展和进展中的作用，对于这一毁灭性疾病的其他治疗方法具有明显的重要性。未来的研究将需要确定氯膦酸盐脂质体以及IL-10、CD18和ICAM-1缺陷单独对RPE-Bruch膜-毛细血管复合物生物学的影响。如果可能的话，将抗炎症与IL-10的抗血管生成活性分离开来将很有帮助，特别是如果这些活性被发现由不同的受体介导。此外，重要的是要证明严重的CNV表型可以在CD18缺乏的小鼠中被“拯救”，或者通过将健康的单核细胞（不同亚群）输注到治疗动物中，用氯膦酸盐脂质体治疗。
基于数据优势，我们认为巨噬细胞很可能参与新生血管性AMD的转变。尤其令人信服的是，在犯罪现场（CNVM内）和手持吸烟左轮手枪（或至少表达VEGF）的人眼观察到巨噬细胞的持续存在。这表明抑制他们的活动对患者有帮助。
然而，对人眼的发现还有其他解释，而对小鼠模型的研究表明，这幅图像可能很复杂。更透彻地了解白细胞在AMD中的作用将大有裨益。人们可以很容易地想象出某些类别的白细胞促进CNV的情况。在这种情况下，干预其迁移、信号传递、VEGF分泌和患CNVM高风险的眼睛的其他功能将是有益的（例如，患有软性黄斑水肿、高危基因型和对侧CNVM的眼睛）。然而，如果更好的眼睛中的某些类别的白细胞减缓了CNV的进程，那么抑制这些细胞将适得其反且有害。进一步完善这些细胞在脉络膜新生血管形成中的有害和潜在的有益作用，将有利于指导新疗法的开发，并有利于应用作用于白细胞和炎症的现有疗法。
