Sirt1通过调节NF-κB p65/microRNA-155/BNDF信号级联改善心力衰竭

在心衰大鼠心脏组织中，Sirt1的表达较差，而NF-κB p65的表达较高

信使RNA(图1B)和蛋白质(图1C)采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和western blot分析检测Sirt1的表达。结果显示，与对照组或假大鼠相比，心衰大鼠心脏组织中Sirt1 mRNA和蛋白的表达显著降低。另一方面，与对照组和假手术组大鼠相比，HF大鼠NF-κB p65和NF-κ的B p65 Ac的蛋白表达显著增加(图1C). 胶原蛋白体积分数（CVF）(图1D)和心肌细胞凋亡(图1E)与对照组或假大鼠相比，HF大鼠的表达增加。上述结果表明，Sirt1表达升高，HF大鼠心脏组织中NF-κB p65上调，而HF大鼠心组织中NFκB的乙酰化受到抑制。

NF-κB p65沉默减轻HF

由于NF-κB p65在HF大鼠中的表达增加，我们假设NF-κ）B p65的沉默将改善大鼠HF的结局。为了验证这个假设，我们沉默了NF-κB p65的表达。在3种sh RNA中，sh NF-κB p65#2最显著地降低了NF-κB p65，因此被选择用于随后的实验(图2A). 与NC相比，sh-NF-κB p65也降低了NF-κB p 65的蛋白表达(图2B). NF-κB p65沉默降低了HF大鼠的IVSD、LVEDD和LVESD，同时增加了LVPWD、LVEF和FS(表3). 在血流动力学测量中，NF-κB p65沉默也降低了LVEDP，增加了LVSP、+dp/dt和-dp/dt。然而，不同组大鼠的心率（HR）没有显著差异(表4). NF-κB p65沉默也降低LVMI和RVMI(图2C)，立方英尺(图2D)和心肌细胞凋亡(图2E)HF大鼠。总的来说，NF-κB p65沉默减轻了HF。

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图2

NF-κB p65沉默对大鼠心力衰竭的影响。(一)sh-RNA治疗后NF-κB p65 mRNA的表达；(B类)NF-κB p65蛋白在心脏组织中的表达；(C类)心室质量指数；(D类)马森三色染色法测定CVF（100×）；(E类)TUNEL染色检测细胞凋亡（200×）*第页与模型+sh-NC组相比<0.05；#表明NF-κB p65 mRNA表达最低。数据表示为平均值±标准偏差。两组数据的比较采用非配对t检验，而三组或更多组采用单向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验。N=12。

NF-κB p65与启动子区结合并提高心肌细胞中miR-155的表达

在HF大鼠中miR-155的表达显著升高，并且在NF-κB p65沉默后部分降低(图3A). 对照组和假手术组大鼠的MiR-155表达保持不变。NF-κB p65在miR-155启动子区的富集在HF大鼠心肌细胞中显著升高，随后通过NF-κ的B p65沉默而降低(图3B). 此外，NF-κB p65过度表达增加了miR-155的表达，而NF-κ的B p65沉默降低了miR-15的表达(图3C). 这些结果表明，NF-κB p65通过结合miR-155的启动子区域上调miR-155。

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图3

NF-κB p65和miR-155之间的结合关系。(一)miR-155在心脏组织中的表达；(B类)ChIP法检测miR-155启动子区NF-κB p65的富集；(C类)miR-155在心肌细胞中的表达*第页与对照组、oe-NC或sh-NC组相比<0.05#第页与假手术组相比<0.05^第页与模型+sh-NC组相比，<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。三组或三组以上通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验。N=12。

抑制MiR-155减少心衰细胞模型中的心肌细胞凋亡

经H处理的心肌细胞中MiR-155表达增加₂O（运行）₂并被miR-155抑制剂减少(图4A). HF细胞的细胞存活率显著低于对照细胞（左面板，图4B). miR-155抑制剂显著提高了HF细胞的细胞活力（右图，图4B). H（H）₂O（运行）₂治疗还增加了细胞凋亡，并通过miR-155抑制剂恢复正常(图4C). 类似地，H₂O（运行）₂治疗显著增加了凋亡相关蛋白Bax和裂解caspase3，同时降低了抗凋亡相关蛋白Bcl-2(图4D). miR-155抑制剂逆转了上述效应。这些结果表明miR-155减少了心衰患者心肌细胞的凋亡。

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图4

抑制miR-155对心肌细胞凋亡的影响。(一)miR-155的表达；(B类)MTT法测定细胞活力；(C类)流式细胞术检测细胞凋亡；(D类)凋亡相关因子的蛋白表达*第页与对照组或模型+抑制剂NC相比<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验对三组或更多组进行分析。通过重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验对不同时间点之间的数据进行比较。细胞实验重复三次。

MiR-155下调BDNF并促进心肌细胞凋亡

在线数据库mirDIP、RNA22、miRWalk和starBase搜索预测BDNF具有miR-155的结合位点(图5A). 我们通过双荧光素酶报告基因分析进一步研究了这种结合关系。BDNF-野生型（WT）/miR-155模拟组的荧光素酶活性显著低于模拟NC组(图5B). 然而，BDNF-突变（MUT）/miR-155模拟组和模拟NC组之间的荧光素酶活性没有差异。这表明miR-155与BDNF特异性结合(图5B). BDNF mRNA(图5C)和蛋白质(图5D)HF大鼠心脏中的表达显著低于对照和假手术大鼠。这些结果表明，BDNF可能与涉及miR-155的HF有关。

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图5

miR-155和BDNF对心肌细胞凋亡的影响。(一)在线工具预测miR-155与BDNF的结合关系；(B类)双荧光素酶报告基因检测miR-155与BDNF的结合关系；(C类)心脏组织中BDNF mRNA的表达；(D类)心脏组织中BDNF蛋白的表达；(E类)心肌细胞中miR-155和BDNF mRNA的表达。(F类)BDNF蛋白在心肌细胞中的表达；(G公司)MTT法测定细胞活力；(H（H）)流式细胞术检测细胞凋亡；(我)凋亡相关因子的蛋白表达*第页与对照组、模型+抑制剂NC、模型+模拟NC或模型+miR-155模拟+oe-NC组相比，<0.05#第页与假手术组相比<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。两组数据的比较采用非配对t检验，而三组或更多组采用单向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验。通过重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验对不同时间点之间的数据进行比较。N=12。细胞实验重复三次。

在用H处理的心肌细胞中₂O（运行）₂，miR-155抑制剂显著降低mRNA(图5E)和蛋白质(图5F)miR-155的表达增加了BDNF的水平。相反，miR-155模拟物增加了miR-15的表达，但减少了BDNF。MiR-155模拟细胞活性降低(图5G)细胞凋亡增加(图5H)在HF心肌细胞中。BDNF过度表达使miR-155模拟物的作用正常化。类似地，miR-155模拟物被发现上调Bax和裂解caspase3，同时降低Bcl-2，但这种趋势被BDNF过度表达所阻止(图5I). 这些结果表明miR-155过表达抑制BDNF的表达并促进心肌细胞凋亡。因此，miR-155抑制上调BDNF并减少心肌细胞凋亡，因此可能对HF有益。

MiR-155/BDNF轴衰减HF体内

MiR-155 antagomir显著降低mRNA(图6A)和蛋白质(图6B)HF大鼠心脏组织中miR-155的表达同时增加BDNF的表达。sh-BDNF的加入对miR-155抗坏血酸治疗的HF大鼠的miR-15表达没有影响，但降低了BDNF的表达。MiR-155安塔戈米尔降低了心衰大鼠的IVSD、LVEDD和LVESD，同时增加了LVPWD、LVEF和FS(表5). 在miR-155抗gomir治疗的HF大鼠中，BDNF沉默显著增加IVSD、LVEDD和LVESD，并降低LVPWD、LVEF和FS。MiR-155安他戈米降低LVEDP，同时增加LVSP、+dp/dt和-dp/dt(表6). 正如预期的那样，BDNF沉默显著增加了miR-155 antagomir治疗的HF大鼠的LVEDP，并降低了LVSP、+dp/dt和-dp/dt。各组之间的HR没有显著差异。LVMI、RVMI(图6C)、CVF(图6D)和心肌细胞凋亡(图6E)miR-155 antagomir显著降低了心衰大鼠心脏组织中BDNF的表达，使其恢复正常。这些结果表明，miR-155的抑制上调了BDNF的表达并减轻了HF体内.

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图6

miR-155和BDNF对心力衰竭的影响体内.(一)miR-155和BDNF mRNA的表达；(B类)BDNF蛋白表达；(C类)心室质量指数；(D类)马森三色染色法测定CVF（100×）；(E类)TUNEL染色检测细胞凋亡（200×）*第页与模型+NC antagomir或模型+miR-155 antagomir+sh-NC组相比，<0.05。数据表示为平均值±标准偏差。通过非配对t检验对两组数据进行比较。N=12。

心衰大鼠模型的建立

健康雄性Sprague-Dawley大鼠（207±20 g，n=120，中国广东省广州市广州中医药大学动物实验中心）在（22±3）°C、相对湿度40-70%、12小时/12小时光/暗循环、自由获取食物和水的无病动物设施中饲养。将大鼠随机分为对照组（n=12）、假手术组（n=12）和HF组（n=96）。如前所述，结扎左心耳和肺动脉之间的左冠状动脉可诱发大鼠HF[42]. Sham大鼠接受冠状动脉暴露，不结扎缝合。术后4周，采用超声心动图（SonoAce X8，中国上海巨木医疗器械有限公司）测定LVEF≤45%，以确保成功诱导HF[43,44]. 换掉诱导HF失败的动物。

HF大鼠的转染

HF大鼠分为8组（每组n=12）：（1）模型+sh阴性对照（NC）（NK-κB p65沉默阴性序列）；（2） 模型+sh-NF-κB p65（NF-κB沉默质粒）；（3） 模型+NC antagomir（miR-155 antagomil负序列）；（4） 模型+miR-155 antagomir（miR-155-antagomir寡核苷酸）；（5） 模型+miR-155 antagomir+sh-NC（miR-155antagomir寡核苷酸+BDNF沉默负序列）；（6） 模型+miR-155 antagomir+sh-BDNF（miR-155antagomir寡核苷酸+BDNF沉默质粒）；（7） 模型+oe-NC（Sirt1过表达负序列）；（8）模型+oe-Sirt1（Sirt1过表达质粒）。根据En-transter提供的说明，通过尾静脉注射转染溶液（0.5 nM，在3μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）^TM（TM）-体内工具包[45]. 对照组服用3μL PBS[46]. 所有病毒载体的测序和包装均由GeneChem（中国上海）制备。

心衰大鼠左心室超声心动图

用戊巴比妥钠（3%，i.p.，P3761，Sigma，St.Louis，MO，USA）麻醉大鼠，并以仰卧姿势固定在木板上。摘除胸部附近的毛发进行多普勒超声检查（SSI-5000，山东树康恒通科技贸易有限公司，中国），以确定以下内容：LVPWD、IVSD、LVEDD、LVESD、LVEF和FS。

HR大鼠心脏血流动力学

用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其固定在手术台上，保持仰卧位。LVSP、LVEDP、HR、+dp/dt和-dp/dt同时记录在多通道生理记录仪上（p3plus，B&E Teksystems，中国北京）。

心衰大鼠心室质量指数

取大鼠心脏，置于预先冷却的羟乙基哌嗪-乙磺酸（HEPES）溶液中。将右心室和左心室分开放置在电子天平上，以测定右心室质量和左心室质量。LVMI和RVMI通过心室质量/体重计算。然后将心脏组织固定在10%甲醛（pH 7.0）中24小时，嵌入石蜡中，并切割成4μm冠状切片。显微镜下观察组织病理学变化。

RT-qPCR

将组织或细胞匀浆（100μL）与1mL Trizol试剂（15596-018，SolarBio Life Sciences，中国北京）完全混合。添加、混合氯仿（200μL），并在室温下静置15分钟。然后在4°C下以12000 rpm离心15分钟。取上清液，与0.5 mL异丙醇混合，在室温下静置10-30 min。将所得混合物在4°C下以12000 rpm离心10 min。丢弃上清液，沉淀RNA。用1 mL 75%乙醇重新悬浮RNA，并用20μL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水稀释。混合物在4°C下以8000 rpm离心5分钟。丢弃上清液，让颗粒在室温下干燥5-10分钟。将颗粒重新悬浮在20μL DEPC处理过的水中，以测定其RNA浓度。RNA（2μg）通过TaqMan逆转录试剂（Roche，Basel，Switzerland）产生cDNA。目标基因在50μL反应体系中通过PCR扩增。引物（Sigma，St.Louis，MO，USA）序列见表9.所有样品均进行了三次测试。甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）被用作Sirt1、NF-κB p65和BNDF的内部参考引物。U6被用作miR-155的内部参考引物。通过使用2^-ΔΔCT方法[47].

蛋白质印迹分析

在4℃下消化心脏组织匀浆（100μL）或细胞裂解液（1 mL）30 min。在4℃以12000 rpm离心混合物20 min。上清液的蛋白质浓度由双钦酸试剂盒测定（20201ES76，中国上海酵母生物技术有限公司）。稀释裂解液体积，使每个样品仅含有30μg蛋白质。样品与加载缓冲液混合，并在100°C下煮沸5分钟。然后用冰冷却样品，离心并加载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离凝胶（10%）上进行电泳。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并在4°C下用5%脱脂牛奶隔夜封闭。将细胞膜与原代兔抗鼠Sirt1（1:2000，ab233398）、NF-κB p65（1:1000，ab28856）、NFκB Ac（1:500，ab19870）、BDNF（1:2000，ab108319）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（1:500、ab4051）、裂解钙蛋白酶3（1:1500，ab49822）、Bax（1:2000、ab32503）、Bcl-2（1:1000、ab59348）和GAPDH（1:2500，ab9485）孵育抗体在摇床上4°C下过夜。用Tris缓冲盐水和吐温20（TBST）每次清洗膜5分钟，共3次，并在室温下用辣根过氧化物酶标记的次级山羊抗兔IgG（1:5000，ab6721）抗体孵育1小时。每次用TBST洗涤样品5分钟，总共洗涤3次。冲洗膜并拍摄图像。用Quantity One软件分析蛋白质条带的灰度。GAPDH被用作内部参考。所有样本均进行了三次检测，所有抗体均购自英国剑桥Abcam。

马森三色染色

石蜡包埋的心肌组织在65°C的烘箱中干燥3小时并脱蜡。组织分别用10%三氯乙酸和10%重铬酸钾处理40分钟。然后用自来水冲洗组织，用苏木精（PT001，BoGoo Biotechnology Co.，Ltd.，中国上海）染色，并静置8分钟。用1%蓬松S（HL12202，Harling Biotechnology Co，Ltd.（中国上海））和1%品红（HPBIO-SJ820，Hepeng Biotechlology Co.Ltd.，Shanghai，China）对组织染色用自来水冲洗40分钟。通过添加1%冰醋酸，然后添加1%钼酸溶液去除污渍。样品脱水并固定在显微镜下观察。基底膜和胶原纤维被染成蓝色或绿色。免疫细胞呈红色，细胞核呈蓝棕色。每个样品中随机选择五个场，在偏振光显微镜下观察。通过Image Pro plus 5.1图像分析软件（Media Cybernetics，Rockville，MD，USA）计算CVF，基于：CVF（%）=胶原蛋白面积/全场面积×100%。

TUNEL染色

将石蜡包埋的心脏切片脱蜡并浸泡在3%H中₂O（运行）₂室温下甲醇溶液30min。每次用PBS洗涤5 min，共3次后，向切片中滴加蛋白酶K溶液，并在37°C下培养30 min。切片在室温下在0.1%Trion X-100和0.1%柠檬酸钠溶液中培养5 min，每次用蒸馏水洗涤5 min共3次。将切片与新制备的TUNEL反应混合物（根据试剂盒制造商的说明制备）在37°C下培养90分钟。然后在室温下在TBS中每次清洗切片5分钟，共清洗3次。添加牛血清白蛋白封闭溶液（5%），并在室温下在湿箱中孵育20分钟。添加POD溶液并在37°C下培养30 min，然后用TBS每次洗涤5 min，共2次。切片在显微镜引导下于室温下在3,3′-二氨基联苯胺中展开。用水冲洗部分，停止颜色发展。细胞核内有棕黄色颗粒的细胞被定义为TUNEL阳性细胞。在每个样本中随机选择五个字段。在400倍或200倍显微镜下，用BI-2000图像分析系统对每个场的TUNEL阳性细胞数进行计数和平均。所有样品均进行了三次测试。

乳鼠原代心肌细胞HF细胞模型的建立

取SD大鼠（2-3日龄）的心室，用Hank’s溶液（pH值7.2-7.4）冲洗3次。将组织切成小块，并在37°C下用0.25%胰蛋白酶分离10分钟。用新鲜的0.25%胰酶替换胰蛋白酶溶液，并在36°C下再培养30分钟。用汉克的溶液再次清洗组织3次。将完全分散的细胞调整为2×10⁶用含有20%胎牛血清的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）培养每毫升细胞，并在37°C和5%CO中培养4小时₂孵化器。粘附细胞被丢弃。台盼蓝染色后观察漂浮细胞的存活率。当细胞存活率达到>95%时，将细胞（100μL/孔）转移到96周的培养板上，并在37°C和5%CO的条件下培养₂持续7天。H（H）₂O（运行）₂加入（10%血清培养基中的100 m/L）并孵育30 min，以在心肌细胞中诱导HF模型。

大鼠原代心肌细胞的转染

H处理的心肌细胞₂O（运行）₂将其分为6个转染组：（1）模型+抑制剂NC（miR-155抑制剂负序列）模型+miR-155模拟+oe-BNDF-NC（miR-155-模拟质粒+BDNF过表达负序列），以及（6）模型+miR-155-模拟+oe-BDNF（miR--155模拟质粒+BNDF过表达质粒）。在转染之前，将心肌细胞接种在六孔板中24小时，以使细胞融合达到约70%。Lipofectamine 2000脂质体（20μL，11668019，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）在500μL无血清培养基中稀释，并在室温下与心肌细胞孵育5分钟。将质粒和脂质体混合并在室温下培养20分钟。用无血清培养基清洗心肌细胞三次。添加培养基，与脂质体混合物孵育5-24小时，转染期间每6小时更换一次。在用无血清培养基冲洗三次后，用20%无抗生素DMEM培养心肌细胞48小时。用RT-qPCR验证shRNA（sh-NF-κB p65#1、sh-NF--κB p 65#2、sh-NF-κBp65#3）的干扰效率。导致NF-κB p65最低表达的ShRNA用于进一步实验。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

NF-κB p65在miR-155基因启动子区的富集通过ChIP试剂盒（美国马萨诸塞州伯灵顿Millipore）进行测定。对数生长期的细胞在室温下与1%的甲醛混合10分钟，以形成DNA-蛋白质交联。形成的交联通过超声装置破碎到合适的大小，10秒，15次，每次循环后间隔10秒。部分交联片段在4°C下以13000 rpm离心，其余片段用作ChIP输入。将上清液收集到三个试管中，并与原代兔抗鼠NF-κB p65（ab19870，Abcam，Cambridge，UK）或NC IgG抗体在4°C下孵育过夜。蛋白质琼脂糖/琼脂糖沉淀内源性DNA-蛋白质复合物。离心后，将上清液丢弃。交联蛋白在65°C下隔夜分解。然后通过苯酚/氯仿萃取纯化DNA片段。NF-κB p65与miR-155启动子区的结合(表9)使用Input作为内部参考确定。

双荧光素酶报告基因检测

消化BDNF mRNA中3’-非翻译区（UTR）的WT和MUT位点序列。将WT和MUT的靶基因片段插入pmiR-RB-REPORT^TM（TM）以前用限制性内切酶消化过的载体（中国广州瑞宝生物科技有限公司）。空质粒转染作为对照。含有MUT和WT的载体分别与NC模拟物或miR-155模拟物共同转染到HEK293T细胞。收集并裂解细胞，离心3-5分钟，转染48小时后收集上清液。相对光单位（RLU）由Renilla Luciferase Assay Kit（YDJ2714，Yudo Biotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China）以萤火虫荧光素酶为内部参照物测定。使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）分析Renilla和Firefly荧光素素酶之间的结果。

3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT）分析

用0.25%胰蛋白酶分离心肌细胞，制备单细胞悬液。以3-6×10接种细胞（0.2 mL）^三96个板中的细胞/孔（6个孔/组）。用含有10%MTT溶液的培养基（5 g/L，GD-Y1317，Gudu Biotech Co.，Ltd.，Shanghai，China）替换每种培养基，并允许以24小时、48小时和72小时的时间间隔培养4小时。去除上清液，加入100μL二甲基亚砜（D5879-100ml，Sigma，St.Louis，MO，USA）并充分混合10分钟。通过设置在570nm的微孔板读数器（BS-1101，Detie Equipment Ltd.，Nanjing，China）检测活细胞产生的甲氮杂晶体。

流式细胞术

用0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸，EDTA）分离细胞，离心，转染48小时后丢弃上清液。用冷PBS洗涤细胞3次，然后离心以丢弃上清液。TUNEL染色基于Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒（556547，Surej Biotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China）。将Annexin-V-FITC、PI、HEPES缓冲溶液和Annexin V/PI染料溶液以1:2:50的比例混合，制备染色溶液。1×10的细胞⁶细胞/100μL在室温下染色15分钟，加入HEPES缓冲溶液（1mL）并混合均匀。通过流式细胞术观察凋亡细胞（Bio-Rad ZE5，Hercules，CA，USA）。FITC的吸收波长和激发波长分别为488nm和525nm；PI-DNA的吸收波长和激发波长分别为535nm和615nm。