SIRT1上调在lncRNA ANRIL对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用中的关键作用

转染

通过将ANRIL编码序列插入pcDNA3.1载体（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）构建ANRIL过表达质粒。寡核苷酸，包括miR-181a模拟物（5′-ACAUUCAACGCUGUCGUGAGUGU-3′）、阴性对照（NC）模拟物（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT−3′），miR-181a-antagomir（5′-ACUCACCGUUGAUGUAUUUU-3′靶向SIRT1（siSIRT1，5′-CCCCUGUAAAGCUUCAGAATT−3′）和NC siRNA（siNC；5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT−3’）的RNA来自上海基因制药有限公司。当细胞密度达到50–60%融合时，用Lipofectamine进行细胞转染^®根据制造商的协议，2000试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。根据实验目的，将等量的空pcDNA3.1载体（4µg/孔）、NC模拟物、NC antagomir（50或150 nM）或siNC（10或20 nM）稀释在相同体积的转染试剂中作为对照转染。转染后2天检测效率。对于H/R处理，细胞在转染后2天在常氧下培养或暴露于H/R（缺氧4小时，然后再复氧8小时）。在常氧或H/R处理条件下，所有转染的转染效率均有效。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析

使用TRIzol提取H9c2细胞的总RNA^®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。根据制造商的协议，使用One Step PrimeScript™RT-RNA试剂盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd.）通过RT-qPCR分析测定ANRIL和SIRT1的表达水平。根据制造商的协议，使用TaqMan™MicroRNA逆转录试剂盒和TaqMan-Universal Master Mix II（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）测定miR-181a的表达。热循环条件如下：在95°C下初始变性5分钟，然后在95°C下进行40次循环15秒和60°C下进行1分钟。β-肌动蛋白作为ANRIL和SIRT1的内部对照。U6作为miR-181a的内部控制。使用2计算数据^-ΔΔCq方法(12). qPCR采用以下引物序列：ANRIL正向、5′-CAAGCCACGTGGAAGATGC-3′和反向、5′-AGAGTGTAGCACG-3′；miR-181a正向，5′-CACTCCAGCTCGGGAACATTCACACACACGCGTCGG-3′和反向，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向，5′-TGGGGTTATATACTGTGAGAGGA-3′和反向，5′-GTGGTGCTACGGAGTCAGAGTT-3′；SIRT1正向，5′-CCAGATCCTCAGCCATG−3′和反向，5′-TTGGATTCCTCAGCCATG−3′；β-肌动蛋白正向，5′-CATGCCATCCTGCGTCTGGA-3′，反向，5′-CCACATCTGCTGGAAGGG-3′。

免疫印迹法

使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所）提取细胞总蛋白，并辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche Diagnostics GmbH）。使用BCA蛋白质分析法测定蛋白质浓度（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。通过10%SDS-PAGE电泳分离总蛋白（30µg/孔），然后将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后在室温下用5%的非脂肪乳封闭该膜1小时，并在4°C下与抗SIRT1的一级抗体（1:1000；类别号ab7343；Abcam）孵育过夜，β-肌动蛋白（1:5000；分类号sc-47778；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、裂解半胱天冬酶-3（1:500；分类号ab49822；Abcam）、Bcl-2（1:500，分类号sc-7382；圣克鲁斯生物科技有限公司）和Bax（1:2000；分类号NBP1-28566；Novus Biologicals，LLC）。清洗后，将膜与辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:10000；类别号ab6721；Abcam）在室温下进一步孵育1小时。用Immobilon Western化学发光HRP底物（EMD Millipore）观察蛋白质条带。使用Image Lab软件（5.1版；Bio-Read Laboratories，Inc.）对蛋白质表达进行半定量。

H/R损伤检测

根据制造商的协议，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍标记（TUNEL）方法，使用TUNEL分析试剂盒（OriGene Technologies，Inc.）评估细胞凋亡。简单地说，细胞在室温下用4%多聚甲醛溶液固定1h，然后在37°C下用TUNEL试剂染色1h。细胞核在室温下用1µg/ml DAPI染色15分钟。细胞用安装溶液（Beyotime Institute of Biotechnology）安装，并用LSM510META荧光显微镜（卡尔蔡司公司；放大倍率，×100）拍摄图像。TUNEL阳性细胞被视为凋亡细胞，并在每个治疗组的12个随机区域进行计数。细胞凋亡表示为凋亡细胞数除以细胞总数。按照制造商的说明，使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（分类号A020；南京建成生物工程研究所）测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放。使用Synergy HT微孔板阅读器（BioTek Instruments，Inc.）测量450 nm处的吸光度。计算结果为培养基中的LDH活性除以总细胞裂解物中的LDH活性。

RNA免疫沉淀（RIP）分析

根据制造商的协议，使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（目录号17-700；EMD Millipore）进行RIP实验。使用H9c2细胞的裂解物进行Argonaute 2（AGO2）-RIP分析。简言之，1×10⁷将细胞在4°C下以3000×g的浓度造粒10 min，并用等量的含有蛋白酶和RNase抑制剂的RIP裂解缓冲液（100µl）再次悬浮。将细胞裂解物（100µl）与5µg对照IgG抗体（cat.no.ab182931；Abcam）或抗AGO2抗体（cat no.ab32381；Abcam）包被蛋白A/g磁珠在4°C下孵育过夜，并持续旋转。在55°C下用蛋白酶K处理30分钟后，使用RNeasy MinElute Cleanup试剂盒（Qiagen，Inc.）提取免疫沉淀RNA，并如上所述进行RT-qPCR实验的逆转录。如上所述，使用RT-qPCR分析miR-181a和ANRIL的表达水平。

荧光素酶报告试验

miRNAs的假定靶点使用生物信息学计算工具，包括starBase（v2.0；http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72). 通过PCR扩增含有推定miR-181a结合位点的ANRIL和SIRT1的野生型（wt）3′非翻译区（UTR），并将其插入pmirGLO双荧光素酶miRNA靶向表达载体（Promega Corporation）中。克隆引物如下：ANRIL正向，5′-ATCGATAGATAGATCTCTACTCTCTATCCGCCAA-3′和反向，5′-CGCAGCGCAAGTAGTCAAAACTGACTATCAGC-3′；和SIRT1正向，5′-CAAACAATCATAGTGAATAA-3′和反向，5′-CGCAAGCGCAAAGACAATCTTACTTACCACTAT−3′。通过TaqFast DNA聚合酶（目录号T828421；MACKLIN）从293T细胞合成DNA，并根据制造商的协议使用DNA纯化试剂盒（目录号DP304；Tiagen Biotech Co.，Ltd.）进行分离。根据制造商的说明，使用定点突变系统（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）生成具有假定突变结合位点（ANRIL-mut和SIRT1-mut）的基因。荧光素酶检测是根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000试剂将报告载体与NC模拟物（NC-mimic）或miR-181a模拟物共同转染到293T细胞中进行的。每次治疗进行五次。然后，在转染后2天，根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega公司）测量萤火虫荧光素酶活性。这个雷尼利亚荧光素酶活性作为每个井的标准化对照。

ANRIL通过海绵miR-181a上调SIRT1表达

LncRNAs可以作为竞争性内源性RNAs来海绵miRNAs，从而调节下游靶点的表达(14). 为了理解ANRIL如何调节SIRT1表达式，计算工具starBase（v2.0）(15)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)用于预测候选miRNAs。miR-181a与ANRIL和SIRT1的3′-UTR共有互补结合位点(图2A). 此外，RIP显示ANRIL和miR-181a在与Ago2抗体结合的小球中同时富集，与IgG对照抗体相比(图2B). 荧光素酶报告子分析显示，与NC模拟物相比，miR-181a模拟物转染显著降低了wt的荧光素酶活性，但mut ANRIL构建物的荧光素素酶活性没有降低(图2C). 在常氧条件下H9c2细胞中证实了siRNA靶向ANRIL的效率(图2D，左侧面板）。此外，ANRIL在H9c2细胞中的过度表达导致miR-181a表达降低，反之，通过siRNA转染的ANRIL敲除提高了miR-181 a表达(图2D，右侧面板）。因此，这些结果表明ANRIL能够海绵化miR-181a。

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图2。

ANRIL通过吸收miR-181a上调SIRT1的表达。（A） 推测的miR-181a与ANRIL和SIRT1的3′-UTR之间的结合位点（红色）。ANRIL的突变序列（蓝色）显示在顶部。（B） 用Ago2抗体沉淀H9c2细胞裂解物，进行RNA-结合蛋白免疫沉淀法检测miR-181a和ANRIL的富集。以同型IgG抗体作为对照。结果表示为相对于IgG对照（n=3）。（C） 293T细胞与NC-mimic或miR-181a模拟物以及wt或mut ANRIL荧光素酶报告质粒共同转染。转染后2天测定荧光素酶活性。结果表示为相对于NC转染（n=5）。（D） 用pcDNA3.1载体或pcDNA3.1-ANRIL质粒或si-NC或siANRIL转染H9c2细胞。转染后2天测定ANRIL（左）和miR-181a（右）的表达水平。（E） 293T细胞与NC-mimic或miR-181a模拟物以及wt或mut SIRT1荧光素酶报告质粒共同转染。转染后2天测定荧光素酶活性。结果表示为相对于NC转染（n=5）。（F和G）H9c2细胞转染NC-mimic或miR-181a模拟物，或antagomir-NC或antagomer-181a。转染后2天，测定miR-181a和SIRT1的（F）mRNA表达水平以及SIRT1（G）蛋白表达水平（n=3）。（H） 用pcDNA3.1载体或pcDNA3.1-ANRIL质粒（4µg/孔）转染H9c2细胞，同时转染或不转染50或150 nM miR-181a模拟物。转染后2天，细胞在常压下培养或暴露于H/R（缺氧4小时，然后再复氧8小时）。SIRT1蛋白表达通过免疫印迹法测定（n=3）。数据表示为平均值±标准偏差。**P<0.01。NS，不显著；ANRIL，INK4位点的反义非编码RNA；SIRT1，sirtuin 1；miR，microRNA；UTR，非翻译区；NC，阴性对照；wt，野生型；突变突变株；si/siRNA，小干扰RNA；H/R，缺氧/复氧。

荧光素酶报告分析也显示miR-181a靶向SIRT1的3′-UTR(图2E)表明SIRT1是H9c2细胞中miR-181的靶点。然后，通过分别转染mimics或antagomir，miR-181a在H9c2细胞中过度表达或被抑制，并通过RT-qPCR分析证实转染效率(图2F，左）。SIRT1的转录水平因miR-181a的过度表达而降低，相反，SIRT1的转录水平因miR-181a的抑制而升高(图2F，右侧）。在SIRT1蛋白水平上也获得了类似的结果(图2G). 这些结果证实了miR-181a至少在H9c2细胞中靶向并抑制SIRT1表达的证据。值得注意的是，H/R处理的H9c2细胞中ANRIL减弱的SIRT1表达下降在miR-181a过度表达的情况下被完全逆转(图2H). 因此，这些数据表明，miR-181a是H/R损伤后控制ANRIL对SIRT1阳性调节的中间产物，如图1D-F.

ANRIL对H/R损伤具有保护作用

LDH释放和细胞凋亡是H/R损伤的两个常用指标(16,17). 通过强制过度表达恢复ANRIL转录水平(图3A)导致H/R损伤引起的LDH释放大幅减少(图3B)表明ANRIL可能具有减少H/R损伤的能力。观察到ANRIL过度表达降低了H9c2细胞的凋亡细胞数量，这一点得到了证实，H9c1细胞在H/R损伤后凋亡细胞数量增加(图3C和D). ANRIL抑制H9c2细胞凋亡的证据是Bax和裂解caspase-3的表达减少，同时Bcl-2的表达增加(图3E). 这些数据表明，ANRIL降低H9c2细胞中H/R诱导的LDH释放和凋亡，因此ANRIL对H/R损伤具有保护作用。

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图3。

ANRIL可防止H/R损伤。（A-E）H9c2细胞瞬时转染pcDNA3.1载体或pcDNA3.1-ANRIL质粒（每孔2或4µg）。转染后2天，细胞在常压下培养或暴露于H/R（缺氧4小时，然后再复氧8小时）。（A） 通过逆转录定量PCR分析测定ANRIL的表达。β-actin起到了内部控制作用。结果表示为相对于常氧组。（B） 测量细胞释放的LDH，并将其表示为总LDH活性的百分比（n=5）。（C和D）使用TUNEL分析检测凋亡，定义为TUNEL阳性细胞（绿色）占细胞总数（DAPI，蓝色）的百分比（n=12）。比例尺，100µm。（E） 用免疫印迹法测定Bax、Bcl-2和裂解caspase-3的表达水平（n=3）。数据表示为平均值±标准偏差。**P<0.01。NS，不显著；乳酸脱氢酶；ANRIL，INK4位点的反义非编码RNA；H/R，缺氧/复氧。