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生物标记研究。2021; 9: 42.
2021年6月5日在线发布。 数字对象标识：10.1186/s40364-021-00292-x
预防性维修识别码：项目管理委员会8178935
PMID：34090518

REASON评分：预测早期口腔鳞癌患者生存不良风险的表观遗传学和临床病理学评分

Chi T.越南,通讯作者1 加里·余（Gary Yu）,2 凯萨瓦·阿萨姆,三，4 卡里萨·托马斯,5 安吉拉·尤恩,6 严晨黄瓦瓦,7 米娜·哈吉亚比亚内赫,7 考特尼·基尔库茨,1 Caitlyn M.McGue女士,1 马库斯·A·库伊,8,9 尼古拉斯·F·卡拉汉,10 科伦·道恩,1 保罗·沃克,11 Khanh Nguyen先生,11 斯蒂芬妮·基德,11 史蒂夫·C·李,11 Anupama Grandhi公司,1 艾伦·C·程,8,9 阿什什·帕特尔,8,9 伊丽莎白·菲利普,6 奥利维娅·里克斯,12 克林特·艾伦,13和布拉德利·E·奥伊泽拉特2,三，4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

背景

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种反复性癌症，即使对于早期患者，其生存率也很低。迫切需要开发更精确的风险评估方法，以适当调整临床治疗。全基因组关联研究尚未产生可行的生物标记物。然而，这些研究由于使用异质队列而受到限制，尽管OSCC是一种严重表观遗传调控的癌症，但没有关注甲基化，也没有将分子数据与临床病理数据结合起来进行风险预测。在这项研究中，我们重点关注早期（I/II）OSCC，并创建了一个称为REASON评分的风险评分，该评分结合了临床病理特征和12基因甲基化特征，以预测5年死亡率的风险。

方法

我们结合了来自内部队列的数据(n个 = 515）和癌症基因组图谱（TCGA）队列(n个 = 58). 我们收集了两组患者的临床病理数据，得出REASON评分的非分子部分。然后，我们分析了TCGA队列DNA甲基化数据，以得出风险评分的分子部分。

结果

内部队列的5年疾病特异性生存率为63%，TCGA队列为86%。两组中预测能力最高的临床病理特征为年龄、种族、性别、吸烟、饮酒、组织学分级、分期、神经周浸润（PNI）、淋巴血管浸润（LVI）和边缘状态。这个由10个非分子特征组成的小组预测了5年死亡率风险，一致性（c）-指数=0.67。我们的分子小组包括12个基因甲基化特征（即。，HORMAD2、MYLK、GPR133、SOX8、TRPA1、ABCA2、HGFAC、MCPH1、WDR86、CACNA1H、RNF216、CCNJL)在存活与死亡5年的患者中，甲基化差异最大。所有12个基因都与其他癌症的生存率有关。在基因中，只有SOX8标准曾与OSCC相关；我们的研究是第一个将其余11个基因与口腔鳞癌生存联系起来的研究。分子和非分子组合小组形成了REASON评分，该评分预测了死亡风险，c指数=0.915。

结论

REASON评分是预测早期OSCC患者死亡风险的一个有希望的生物标志物。在更大的独立队列中验证REASON评分是有保证的。

补充信息

在线版本包含补充材料，请访问10.1186/s40364-021-00292-x。

介绍

口腔癌呈上升趋势[1——三]. 每年有30000名美国人被诊断为口腔鳞状细胞癌（OSCC），80%的新诊断病例为早期I/II期，没有区域淋巴结受累或远处转移。即使是早期口腔癌患者，五年生存率也低至60%[4——6]. 种族和社会经济弱势群体的死亡率更高。使用监测、流行病学和最终结果（SEER）数据库进行的一项研究表明，虽然黑人患者仅占所有OSCC患者的7.6%，其中75%的患者是白人，但黑人患者死于OSCC的可能性更大，这部分是由于诊断和获得医疗或健康保险的后期阶段[6]. OSCC患者接受癌症手术切除和颈部淋巴结切除术，然后根据风险分层进行辅助放射治疗，包括或不包括化疗和免疫治疗。然而，由于我们目前的临床实践仅依赖临床病理信息，风险预测以及生存率仍然很低。这种不良的生存率与其他癌症，甚至与其他头颈癌亚型（如口咽鳞状细胞癌）相比，后者由于准确的风险分层，生存率显著提高[7]. 有必要开发一种稳健的预后生物标记物，将临床病理数据与分子特征结合起来，将口腔鳞癌患者分为高风险和低风险类别，这将指导有关辅助化疗和放疗的临床决策，并最终提高生存率。OSCC是一种表观遗传学调控严重的癌症，甲基化是最常见的表观遗传学变化；甲基化导致基因组不稳定和导致OSCC进展的关键基因的失调[8]. 甲基化是口腔癌变早期最常见的事件之一，与癌症进展有关[8]. 在OSCC患者中进行的一些甲基化研究[8——18]包括我们自己的研究[9,10]，强调了甲基化控制的特定基因，但这些研究均未产生具有临床意义的预后能力的甲基化生物标记物。迄今为止，OSCC生物标记物研究的主要缺点包括：1）将OSCC与其他头颈癌亚部位（即。,口咽），这创造了一个异质队列，以及2）仅依赖分子数据，而不考虑临床病理因素。相反，其他癌症的商业化生物标记物结合了分子和非分子数据来确定特定癌症亚型的风险[19,20]. 我们目前的生物标志物研究直接解决了这些缺点。

在这项研究中，我们假设基因甲基化可以与临床病理因素相结合，形成一个复合的分子和非分子特征，在确定早期（I/II）OSCC患者5年死亡率的风险方面具有较高的预后性能。为了验证我们的假设并制定我们的复合分子和非分子风险评分，我们分析了515名OSCC患者的内部回顾性队列以及来自癌症基因组图谱（TCGA）的58名患者的队列的临床病理数据。我们确定了这两个队列中高度预测5年疾病特异性死亡率的主要临床病理因素。然后，我们分析了TCGA队列中可用的甲基化阵列数据，发现在死亡5年的OSCC患者和存活5年的患者之间存在12个差异甲基化的基因。我们将临床病理因素与12基因甲基化特征结合到风险评分中，我们将其命名为口腔癌高危表观遗传和临床病理评分（REASON）评分。我们确定了其预测性能，以确定诊断后5年内死于疾病的早期OSCC患者。

方法

患者选择和数据收集

本研究中的患者是从接受治疗的机构编制的现有OSCC数据库中选择的。该数据库的临床数据收集由各机构的机构审查委员会批准，包括洛马琳达大学（LLU）、哥伦比亚大学欧文医学中心（CUIMC）、波特兰普罗维登斯医学中心（PPMC）、伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）和阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）。研究仅限于口腔亚部位，包括口腔舌、上下颌牙龈、硬腭、口底、颊粘膜和唇粘膜。根据美国癌症联合委员会（AJCC）第八版分期手册记录临床和病理分期[21]. 所有患者均为I或II期（即。,T1N0M0或T2N0MO）经生物病理证实的OSCC。数据解释中使用了未确认的患者临床病理特征。我们从图表回顾中收集了以下信息：年龄、性别、种族、吸烟和饮酒、分期、肿瘤位置、病理特征[即。,神经周侵袭（PNI）、淋巴血管侵袭（LVI）、边缘状态、组织学分级]，以及除肿瘤消融外接受的治疗方式（即。,颈部淋巴结切除术、放射治疗加或不加化疗）。

TCGA Illumina甲基化阵列分析

我们对TCGA数据库中早期OSCC患者的甲基化数据进行了分析。DNA甲基化数据预处理、质量控制过滤和分位数归一化[22]（包括批量校正和替代变量分析）采用米菲R中的v1.34.0包[23]. 使用利马R中的v3.44.3包[24]. 图中的工作流程概述了Illumina Infinium甲基化450 K阵列数据分析1简而言之，在总共485512个探针中，去除了与X或Y染色体杂交的探针，剩下473864个探针。移除了另外17351个与单核苷酸多态性（SNPs）相关的探针和111977个未映射到基因区域的探针。从剩下的344536个探针中，我们保留了那些检测到的探针第页在至少50%的样品中，值<0.01。然后，我们筛选出交叉反应或映射到多个基因组位置的探针，剩下324465个探针。

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甲基化阵列工作流程。显示了TCGA队列甲基化阵列数据的分析步骤

我们排除了所有样本中β值小于0.1或所有样本中大于0.9的探针，剩下317016个探针。使用患者的生存状态作为结果变量，我们使用替代变量分析进行批量校正。排除了与生存状态相关性高于0.2的替代变量（确定了14个替代变量中的3个）。然后，我们选择了前30%的可变甲基化探针，这使我们总共保留了95104个探针，涵盖4544个基因，用于差异甲基化分析。鉴于本试验研究的探索性和可用于分析的适度样本量(n个 = 58），生存状态差异甲基化CpG显示调整第页-将<0.1的值纳入预后组的分子成分。使用heatmap软件包v1.0.12在R中使用生存状态作为聚类变量，使用层次聚类分析构建热图。为了评估路径间差异甲基化基因的富集情况，路径分析使用了两个互补和重叠的注释：基因本体（GO）[25])和京都基因和基因组百科全书（KEGG[26]). 使用KEGG进行路径分析，特别是过度表达分析，并使用clusterProfiler v3.16.1在R中执行GO注释[27]，将非显著差异表达基因指定为“背景宇宙”，并使用Bonferroni校正进行多次测试。对于使用GO注释的过度表达分析，路径被进一步分类为生物过程、分子功能和细胞隔室。通过使用R中的enrichplot软件包v1.8.1对功能富集进行两种可视化（即点图和基因概念网络），评估不同甲基化途径之间的相互关系，并贡献不同的甲基化位点。

TCGA Illumina RNA序列分析

我们试图将含有不同甲基化位点的基因表达与生存状态相关联。我们对TCGA数据库中早期OSCC患者通过RNA测序（RNAseq）收集的基因表达进行了分析。原始基因计数来自TCGA。在至少90%的样本中，只有至少10个计数的基因被保留下来进行分析。基因计数的集合标识符（ID）使用R中的EnrichmentBrowser v 2.18.2 Package注释为Entrez ID[28]. 基因注释是使用Homo.sapiens v.1.3.1软件包给出的[29]. 使用STATA/SE 14.2（德克萨斯州大学城StataCorp）对RNAseq基因计数与CpG位点甲基化进行关联。

统计分析

统计分析在STATA/SE 14.2中进行。对每个队列进行单变量分析，以确定分布特征并评估缺失数据的随机性（纳入最终预后小组风险因素评分的变量的缺失值小于5%，因此不进行插补）。对具有结果变量的候选变量（基于从相关临床和人口统计学风险因素的详细筛选中选择的研究人员）进行主要结果（5年随访时的生命状态[存活与死亡]）的双变量分析。对于连续变量，使用手动调整检测到的叉方相互作用来推导截止值，以确保截止值具有临床意义。递归分区用于推导最终的非分子评分系统，以预测5年随访时的生存状态，目的是最小化最终细胞中错误分类值的数量，同时最大限度地简化评分。将每个决策节点的奇数比四舍五入为最接近的整数以创建分数。根据两项发现（内部队列、，n个 = 515）和验证（TCGA，n个 = 58）队列。一致性统计（c指数），相当于受试者工作曲线下面积（AUROC），用于评估模型判别力，并使用衍生的风险因素评分进行拟合，以预测有早期死亡和发病风险的OSCC患者[30]. c指数的范围是从0.5（随机一致性）到1（完全一致性）。

根据甲基化状态转移矩阵，对REASON评分中基于DNA甲基化的分子成分进行检测[31]. 对于每个CpG位点，β值<0.3表示非甲基化状态，0.33–0.75表示半甲基化状态和>0.75表示完全甲基化状态。如果甲基化水平从甲基化程度较低的状态转移到甲基化程度较高的状态，则认为基因甲基化程度过高。相反，如果状态改变到较低水平，则认为基因甲基化不足。没有状态变化的甲基化变化被认为不显著[31]. 通过结合每个非分子和分子危险因素的存在与否来确定REASON评分。如上所述，通过使用个体REASON评分比较观察到的5年生存状态和预测的5年存活状态，得出c指数。

结果

患者队列特征

我们的515名患者的内部队列和58名患者的TCGA队列由基于病理TNM分类的早期（I或II）OSCC患者组成。表​表11详细描述其人口学和临床病理特征。TCGA队列中60%为男性，93%为白人，平均年龄为64岁。大多数患者（68%）是当前或以前的吸烟者，61%的患者饮酒。肿瘤亚部位包括口腔舌、牙槽嵴、颊粘膜或口底；57%的TCGA队列由口腔舌鳞状细胞癌组成，其余分布于其他亚位点。就病理分期而言，31%为I期，69%为II期。就肿瘤分级而言，19%为高分化肿瘤，其余81%为中分化或低分化肿瘤。35%的病例出现PNI，6.9%出现LVI，21%的病例出现阳性或接近边缘。五年生存率为86%。TCGA队列和内部队列之间的显著差异列于表​表1。1性别、年龄、自述种族和吸烟情况在两组之间没有差异。内部队列中53%为男性，93%为白人，平均年龄65岁，50%为当前或以前吸烟者。内部队列中，自报西班牙裔的患者比例更高（22%比3.6%，第页 = 0.001). 内部队列中使用酒精的患者显著减少（40%比61%，第页 = 0.002). 肿瘤位置存在显著差异；虽然两个队列中舌鳞癌患者的比例相同（57%），但内部队列中牙槽（牙龈）鳞癌的比例高于TCGA队列（17%比5%，第页 < 0.001). 肿瘤分级也存在差异，内部队列中分化良好的肿瘤比例较高（40%比19%，第页 = 0.001). 与TCGA队列相比，内部队列中出现PNI的百分比更低（11%对35%，第页 < 0.001). 同样，在内部队列中，病理分期较低的患者也显著增多（64%比31%，第页 < 0.001). 尽管患有早期、高分化肿瘤且PNI较低，但内部队列中的死亡风险显著较高（37%比14%，第页 = 0.001).

表1

患者人口统计和临床病理特征。该表详细说明了这两个队列的特征。统计测试和第页-显示值

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缩写：AJCC公司美国癌症联合委员会，网络操作系统未另行规定，标准偏差标准偏差，TCGA公司癌症基因组图谱

非分子临床病理危险因素

我们使用不同的临床病理因素计算了c指数。两个队列中预测能力最高的临床病理特征是年龄、种族、性别、吸烟、饮酒、组织学分级、分期、PNI、LVI和边缘状态。这组10个非分子特征预测了5年死亡率风险，TCGA队列的c指数=0.72，内部队列的c系数=0.66。尽管两组的临床病理特征存在差异，但预后表现没有显著差异。这两个组在预测5年死亡率方面的c指数为0.67。低c指数与之前的临床和生物标志物研究一致[4]这表明，仅凭临床病理因素无法充分评估c指数≥0.8所定义的疾病风险。在我们目前的临床实践中，我们仅依赖这些临床病理因素进行风险评估和治疗决策。

甲基化阵列分析显示早期OSCC患者中存活五年以下的差异甲基化基因

在含有符合分析标准的CpG位点的4544个基因中，有12个基因表现出调整第页-<0.1的值（表​（表2）。2). 他们包括ABCA2、CACNA1H、CCNJL、GPR133、HGFAC、HORMAD2、MCPH1、MYLK、RNF216、SOX8、TRPA1和WDR86。图2使用热图说明了12个顶级差异甲基化基因的58个TCGA患者样本中每个样本的甲基化状态。癌症死亡5年的患者被分组在热图的左侧，与存活5年的病人相比，甲基化特征有显著差异。

表2

十二烯甲基化特征。显示了基因位置和甲基化折叠变化值。在我们的研究中，每个基因的甲基化趋势预测了不良生存率，与之前的研究中预测不良生存率的基因表达趋势相比，显示了甲基化趋势。包括参考研究的PMID

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所有急性淋巴细胞白血病，CRC公司大肠癌，地球观测卫星卵巢上皮癌，GBM公司多形性胶质母细胞瘤，肝癌肝细胞癌，非小细胞肺癌非小细胞肺癌，OSCC公司口腔鳞状细胞癌

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不同甲基化基因的热图和层次聚类显示，高危与低危OSCC患者的甲基化特征不同。该图代表了TCGA队列中存活至5年的患者与死亡患者之间12个差异最大的甲基化基因的热图。ABCA2=ATP-结合盒亚家族A成员2；CACNA1H=钙电压门控通道亚单位α1 H；CCNJL=细胞周期蛋白J样蛋白；GPR133=粘附G蛋白偶联受体D1；HGFAC=肝细胞生长因子激活剂；HORMAD2=含有2的HORMA域；MCPH1=小脑蛋白1；MYLK=肌球蛋白轻链激酶；RNF216＝环指蛋白216；SOX8＝SRY盒转录因子8；TRPA1=瞬时受体电位阳离子通道亚家族A成员1；WDR86=WD重复域86

REASON评分的预测能力

REASON得分是通过将10因子非分子面板与由13个CpG组成的12基因甲基化面板相结合来计算的，其中每个基因的甲基化状态是通过甲基化状态转换矩阵来确定的。REASON分数预测5年疾病特异性死亡率，c指数=0.915。

与其他癌症生存相关的前12个差异甲基化基因

对12个基因中的每一个进行的文献检索显示，除了SOX8，在人类或临床前研究中，这些基因都没有与口腔鳞癌相关。虽然许多基因尚未在临床前研究中进行广泛研究，以全面绘制其下游机制，但所有12个基因都至少有一份出版物将该基因与癌症患者的低生存率联系起来。在表中​表22每个基因都与证明癌症生存率低的参考临床研究有关。HORMAD2公司通过任一SNP的失调[32,33]或超甲基化[34]非小细胞肺癌（NSCLC）和甲状腺癌的生存率低。MYLK（马来西亚）过度表达与膀胱癌生存率低有关[35]，结直肠癌[36]和肝细胞癌[37].133加仑多形性胶质母细胞瘤患者的表达与生存率呈负相关[38,39]. 的作用SOX8标准已经使用体外和体内模型进行了研究,以及OSCC的临床样本。在一项临床研究中，SOX8标准在舌鳞癌化疗耐药患者中过度表达，与较高的淋巴结转移、晚期肿瘤和较短的总体生存期相关[40]. 同样，更高SOX8标准子宫内膜癌患者的表达与肿瘤组织学分级高、淋巴结转移和总生存期短有关[41].TRPA1号机组癌症中的表达存在争议，基因过度表达与鼻咽癌生存率低有关[42]基因表达不足与肾透明细胞癌患者生存率低相关[43]. 然而，一项使用国际癌症基因组联合会数据的研究表明TRP公司基因家族在不同的癌症类型中有不同的表达TRP公司基因比其他基因具有更强的预后能力[43].ABCA2，编码ATP-结合盒转运体超家族的膜相关蛋白，在上皮性卵巢癌和存活率低的急性淋巴细胞白血病患者中过度表达[44,45].HGFAC公司乳腺导管癌和卵巢癌的表达与生存率直接相关[46,47].WDR86型结直肠癌和乳腺癌中的表达与低生存率有关[48,49]. 在包括胃癌、肺癌和卵巢癌在内的实体瘤的临床研究中，T型钙通道基因的表达包括CACNA1H公司用作生存的预后标志[50].RNF216号机组表达与结直肠癌和卵巢癌的低生存率相关，尽管过表达或欠表达是否会降低生存率尚不清楚[51,52].CCNJL公司肝细胞癌的表达与生存率呈负相关[53]. 值得注意的是，这12个基因的差异甲基化以前并没有被认为与任何类型癌症的低生存率有关。除了HORMAD2公司和HGFAC、，已发表的关于这些候选基因的研究侧重于差异基因表达而非甲基化。

差异甲基化基因的功能分析

在58名具有DNA甲基化数据的TCGA OSCC患者中，有55名患者的基因表达数据可用。正如人们越来越认识到的那样，基因超甲基化会导致基因表达减少或增加[54]在TCGA样品中观察到。基因表达与每个基因的DNA甲基化之间存在显著相关性(ABCA2公司[第页 = 0.46,第页 = 0.0005],133加仑[第页 = 0.42,第页 = 0.0015],MCPH1型[第页 = 0.31,第页 = 0.024],RNF216号机组[第页 = − 0.38,第页 = 0.0045]之间，TRPA1号机组[第页 = − 0.60,第页 < 0.0001],WDR86型[第页 = 0.36,第页 = 0.0072]）。

我们通过公开的数据库进行基因网络分析，以确定我们的12个候选基因是否直接参与已建立的信号网络。表​表3三详细说明与候选基因相关的KEGG途径；补充表1详细说明了与按基因本体类别（即生物过程、细胞隔室、分子功能）聚集的候选基因相关的GO途径。12个差异甲基化基因中的7个（即。，ABCA2、CACNA1H、MCPH1、MYLK、RNF216、SOX8、TRPA1)映射到具有统计学意义的差异甲基化途径。使用基因集富集点图和基因概念网络图（图三)。CACNA1H公司和MYLK（马来西亚）映射到19条具有统计学差异的甲基化途径中的5条（p调整后的 < 0.05; 表​表3）。三). 差异甲基化基因的数量(第页 < 0.05）在前十个差异最大的甲基化途径中（p调整后的 < 0.05）如图所示。​图3a。三a.两个(CACNA1H公司,MYLK（马来西亚）)在REASON评分图中包含的12个差异甲基化基因中，前3个差异最大的甲基化途径是：神经活性配体-受体相互作用、吗啡成瘾和钙信号通路（图。​（图3三b） ●●●●。

表3

功能网络分析（KEGG）。不同的甲基化途径（p调整后的 < 0.05）基于KEGG注释。确定了包括预后面板中12个差异甲基化基因中任何一个的途径

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功能网络分析映射。功能富集分析确定差异甲基化基因在聚合为三个概念的路径上的聚合。一差异富集基因的点图，映射到前十个差异扰动最大的甲基化途径（p调整后的 < 0.05）。b条统计上差异最大的前三条甲基化途径由一个灰色圆圈标识，组成基因差异甲基化的折叠变化以每个基因的负（绿色）到正（红色）折叠变化的颜色表示。每个圆圈的大小取决于基因的数量

讨论

REASON评分在预测早期OSCC的不良生存率方面具有较高的准确性

我们在这项研究中构建的REASON评分依赖于标准临床实践中已经用于评估风险的非分子临床病理因素，以及12个基因的甲基化特征。之前在OSCC中的甲基化研究没有发现这12个基因中的任何一个具有预测能力。除了SOX8标准，该小组中的基因以前没有与OSCC相关。然而，虽然其中一些基因尚未被确定在致癌过程中发挥关键作用，但在对患者组织的遗传关联研究中，所有12个基因都与癌症生存相关[31,32,34——42,45,46,48,50——52]. 因此，我们认为包含这12个基因的REASON评分是一个有希望的预后工具，值得进一步验证。这项初步研究的结果为大规模生物标记物验证研究奠定了基础，在该研究中，我们将描述我们内部队列的甲基化特征，据我们所知，这是迄今为止最大的早期OSCC队列。任何与致癌有关的基因途径都需要进行广泛的体外和体内研究，但与患者生存率低下直接相关需要大量的临床队列；因此，将所有12个基因纳入研究小组，已经与其他癌症的癌症生存率相关，这既具有挑衅性，又是罕见的。

尽管癌症治疗进展迅速，但口腔鳞癌患者的生存率很低

2001年人类基因组计划的完成开启了个性化医学的时代。希望基因密码能促进高效生物标志物小组的开发，以确定癌症患者的风险，并发现直接靶向高度失调途径的抗癌药物。由于个性化的药物治疗，一些癌症的生存率显著提高。例如，商业化的基因组测试可以预测乳腺癌患者的复发风险，目前已用于临床实践，以指导治疗决策。这些生物标记物面板是根据2000年代早期进行的大型DNA微阵列研究开发的[19,55]. 目前市场上最畅销的多基因检测方法包括肿瘤型DX，该方法得到了二级证据的支持，并得到了美国临床肿瘤学会的认可[20]和哺乳动物纹，这得到了三级证据的支持。在过去二十年中，由于深入的基因组分析，乳腺癌治疗的这些进展和其他进展，特别是患有转移性疾病的年轻女性的生存率显著提高[56]. 然而，分子剖析技术的进步尚未导致OSCC风险分层结果的改善或临床有用的生物标记物。事实上，世界范围内口腔鳞癌的发病率正在上升[1]. 在一项对全球22个癌症登记处进行的流行病学研究中，在没有吸烟或饮酒等传统危险因素的45岁以下年轻女性中，舌癌发病率增加。尽管在技术上取得了进步，例如用于精确传递辐射的强度调制放射治疗（IMRT），但在过去几十年中，OSCC存活率的改善并不明显[三]. 针对复发或转移性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的靶向治疗，如西妥昔单抗与强化化疗联合使用，已证明其生存率有所提高，但在确定的治疗方案中尚未显示出改善的结果[57]. 免疫治疗已成为许多癌症的第四种治疗方式，目前有两种免疫检查点抑制剂，尼沃单抗和pembrolizumab，被批准用于HNSCC。不幸的是，免疫治疗仅对12-20%的HNSCC有效，目前仅限于复发或转移。此外，抗癌活性似乎需要肿瘤微环境中预先存在的免疫浸润，不幸的是，大多数OSCC中免疫浸润不足或基本缺失[58,59]. 由于这些原因，尽管近年来头颈癌治疗取得了进展，但OSCC患者的生存率仍然很低。

OSCC生物标记物研究试图预测颈部转移的风险，但尚未得出临床可行的风险评分

头颈癌研究人员试图制定一个多基因风险评分，以更好地为口腔鳞癌患者量身定制治疗方案。到目前为止，研究使用差异基因表达、基因扩增和缺失、甲基化和microRNA（miRNA）作为潜在的生物标记物。我们目前的研究确定了可能从治疗升级中受益的高危患者，与此相反，大多数研究主要集中于通过开发生物标记物来预测颈部转移风险，以防止过度治疗。20%或更多的患者有隐匿症状（即。,临床检查或成像无法检测到）颈部转移。大量出版物，包括计算建模研究[60]，回顾性研究[61]以及一项大型前瞻性临床试验，该试验将接受预防性颈部淋巴结切除术的早期口腔鳞癌患者与采用观察等待方法的患者进行了比较[62]所有这些都表明，如果不进行预防性颈部淋巴结切除，20%以上的隐性转移风险预示着生存率很低。因此，早期OSCC患者接受预防性颈部淋巴结切除术是护理的标准，即使这种做法涉及高达80%的伴随发病率患者的过度治疗，包括肩部功能障碍、神经损伤和淋巴水肿[63]. 这种临床实践需要开发一种更精细的风险分层方法。然而，到目前为止，还没有足够高的准确度预测颈部转移风险的分子特征可用于临床。21世纪初进行的早期生物标记物研究使用定制的内部DNA微阵列基因表达谱来发现有和无颈部转移患者之间差异表达的基因。来自荷兰的Roepman等人发现了一个预测颈部转移的102-基因特征[64,65]. 该特征在预测颈部转移方面准确率为77%，在预测颈部无转移方面准确度为100%，总准确率为86%。在最初研究7年后，作者将他们的平台转换为经CLIA/ISO批准的商用微阵列，然后继续验证他们的签名。在对222例OSCC和口咽鳞癌（OPSCC）患者的多中心验证中，作者确定他们的基因表达特征对OSCC和OPSCC的所有阶段具有72%的负预测值（NPV），仅在101例早期（I/II）OSCC患者中就增加到89%[63]. 在一个包含基因特征的临床决策模型中，作者预测，在101名早期口腔鳞癌患者中，有32名患者可以通过颈淋巴结清扫术避免过度治疗[63]. 当仅考虑早期I/II OSCC患者时，NPV的改善强调了认识到OSCC是一种不同于所有其他头颈癌亚部位的疾病子集的重要性。

Albertson等人将重点放在基因扩增和缺失上，使用阵列比较基因组杂交（CGH）[66]以鉴定OSCC中失调的途径。他们的小组是第一个发现OSCC中Notch信号通路失调的小组。这一发现后来在Grandis等人的一项研究中得到验证，该研究定义了头颈癌的突变景观[67]. 该小组接着定义了染色体畸变的生物标记物，包括+3q24-qter、-8pter-p23.1、+8q12-q24.2和+20，将主要亚组（70-80%的OSCC患者，称为3q8pq20亚型）与其余亚组（20-30%的OSCC病人，非3q8pq20）区分开来。非3q8pq20生物标记物具有较高的阴性预测值（0.93-1.0），但较低的阳性预测值（0.46-0.77）[68]. 该生物标记物尚未在临床试验中得到验证。综上所述，迄今为止专注于预测颈部转移风险的生物标志物试验取得了一定的成功。如果一种强大的生物标志物能够得到验证，这将对外科医生和患者都非常有益，因为这将使他们能够在知情的情况下决定是否需要进行选择性颈清扫，同时避免过度治疗。

需要生物标记物来预测OSCC早期的不良生存率

其他研究人员没有将重点放在生物标记物上，而是采用与我们当前研究类似的方法，重点开发OSCC患者生存率低的生物标记物，以确定可能受益于治疗升级的高危患者。Chauhan等人开发了一个由5种蛋白质组成的生物标记物小组，用免疫组织化学方法对其进行定性评估，以预测OSCC患者的死亡率。测试和验证队列包括早期和晚期OSCC患者（I-IV期）。他们验证的生物标记物面板的c指数=0.69[69]. Yoon等人开发了一种基于microRNA（miRNA）的评分系统，该系统将临床病理数据与miRNA特征相结合。他们只关注早期口腔鳞癌患者。作者使用568例早期（I/II）OSCC患者发现并验证了该预测面板，这些患者的5年生存率已知。他们检测了多种临床病理因素，包括TNM分类、组织学分级、PNI、LVI、浸润深度、边缘状态、种族、吸烟和饮酒，以及2083个miRNAs。

仅临床病理数据就只能预测5年的死亡风险，c指数的准确性为0.672(第页 < 0.001). 前3个候选miRNAs分别是miRNA-127-3p、miRNA-655-3p和miRNA-4736（c指数=0.810；第页 < 0.001). 根据c指数计算，他们确定由TNM分类、组织学分级、miRNA-127-3p、miRNA-655-3p和miRNA-4736组成的5个复合组在预测5年死亡风险方面具有最高的预测能力，c指数=0.832(第页 < 0.001) [4]. 而我们的临床队列包括Yoon等人使用的队列的一部分。,对整个队列的分析得出了不同的重要临床病理因素，我们将其与甲基化特征相结合，得出REASON评分。

本研究开发的REASON评分预测早期OSCC患者5年内的死亡风险，c指数为0.915。风险评分是通过利用一个大型的内部队列和公开的TCGA数据得出的，特别关注口腔亚位点，以最大限度地提高在高度反复无常的疾病中发现有意义的生物标记物的可能性。由于REASON评分（TCGA）分子部分的初始开发可用的样本量适中，交叉验证方法（例如k倍或离开法）由于在当前数据集大小的较小子集上生成性能估计，可能会引入偏差，因此既无效也不合适[70]. 需要足够大的数据集，以便将测试、培训和验证方法应用于初步的REASON得分。我们目前正在通过对整个内部队列进行甲基化阵列分析来验证REASON评分。此外，我们正在将OSCC患者纳入一项前瞻性研究，该研究将使用非侵入性刷检来验证REASON评分。

结论

在这项研究中，我们使用了一个内部队列和公开的队列来推导出显著的临床病理因素，并将它们与12基因甲基化特征相结合，以创建复合分子/非分子REASON评分，该评分在识别早期（I/II）OSCC患者中具有较高的预后表现，这些患者的死亡风险为5年。

致谢

我们要感谢Michael Samardzija博士、法学博士和洛马琳达大学研究事务办公室对REASON分数申请专利的支持。我们也感谢洛马琳达大学癌症登记处的成员。

作者的贡献

BEA的CTV设计了这项研究，撰写了手稿，并协调了多个机构的招生。GY和KRA对数据进行了分析。CTV、CMT、CD、KN、PCW、SCK、SCL、AG、ACC、AAP协调机构审查委员会批准、患者登记和各自站点的数据库创建。YCW、MHA、CAK、CMM、MAC、AJY、EP和OLR完成了患者数据库，并在各自机构进行了回顾性图表审查。CTA就数据分析提供了专家建议。所有作者阅读并批准了最终手稿。

基金

口腔颌面外科基金会。

数据和材料的可用性

本文包含了本研究产生的所有数据。

声明

道德批准和参与同意

已获得机构审查委员会的批准，以便在每个机构创建已取消身份的患者数据库。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

不适用。

脚注

出版商笔记

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

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文章来自生物标志物研究由以下人员提供BMC公司